Thực nghiệm thành phần hóa học của cao eter dầu hỏa

Thực nghiệm thành phần hóa học của cao eter dầu hỏa

Tước khi tiến hành ly trích, cô lập và xác định các hợp chất trong cây kim

vàng, chúng tôi thực hiện các bước sau đây :

e Tinh ché dung môi

e Ly trich mau cay dé lay cao,

e Chuan bi cot sac ky

* Tinh chế dụng môi:

e Eter dau héa chưng cất ở phân đoạn 60-90°C, làm khan với sợt Na kim loại,

® Benzcn lắc với acid H;SO, 20%, rửa nước, làm khan bằng Na;SO, hoặc CaCi, trong 24 gid, chung cat 6 80°C, lam khan với soi Na kim loại

s Eter etil chung cất ở phân đoạn 34,5'C, làm khan với CaCl; khan, tiếp tục làm khan với sợi Na kim loại

e Alcol etil chung cat phan doan 4 78°C

e Alcol metil chưng cất phân đoạn ở 64°C

e Aceton chung cat phan doan 6 56°C

* CI roform lắc với nước 3-4 lần để loại alcol etil, chưng cất ở 61C, làm khan vdi CaCh

* Ly trich mau cay:

Chúng tôi tiến hành ly trích mẫu cây bằng các loại dung môi khác nhau : eter dau hỏa, benzen, cloroform và alcol etil, thu duoc cdc cao tương ứng Cao eter dau hỏa tiếp tục được xà phòng hóa Phần không xà phòng hóa được sử dụng để sắc ký cột

Chỉ tiết của phần này chúng tôi sẽ dé cập rõ hơn trong phần kế tiếp

*- Thuốc thứ:

Ngoài một số thuốc thử phục vụ cho phần khảo sát định tính (ở mục HH), chúng tôi còn sử dụng thuốc thử hiện hình là hơi iod, acid H;ạ5O¿ 5%, acid phosphomolibdic 10% trong EtOH

* Cột sắc ký:[20]

Cột dùng cho sắc ký cột khô-nhanh là phêu lọc xốp được gắn vào hệ thống hút chân không, cho từ từ silica gel (60H loại dùng cho sắc ký bản móng, Merck) vào cột, dùng muỗng để ép phần silica gel va ding may hit chân không để tăng thêm áp lực làm cột cứng đều không bị nứt gấy Khi silica gel cho vao gan day

57

cột, bão hòa cột bằng eter dầu hỏa trong một giờ Chuẩn bị phần cao nạp cột và một miếng bông để đặt lên trên

* Thiết bị, dụng cụ:

Máy cô quay RE 1i1 Rotavapor kèm bếp đun cách thủy Buchi 461 Water Bath

se Bếp đun cách thủy LW-§ Water Bath

» Soxhlet cdc ioai : i Hit, 2 lit, 10 lit

38

I Định tính một số cấu tử hiữu cơ trong lá và thân của cây kữn vàng

11.Điều ché cao eter diu héa, cao benzen, cao cloroform, cao

dicol cHÍ của lá và thân cây kim vàng

Nguyên liệu khô (lá, thân) được tận trích với các loại dung môi : eter dầu hỏa, benzen, cloroform va alcol etil trong Soxhlet Loc, c6 can dung mdi trong máy cô quay ở 40°C Đuổi dung môi trên bếp cách thủy, cho vào bình hút ẩm chân không, đến khi có trọng lượng không đổi, thu được các loại cao : eter đầu bổa, benzen, cloroform, alcol etl của các bộ phân lá, thân Bột khô và cao của lá

và thân lần lượt được đem định tính

1.2 Dinh tinh sterol va triterpen

Ngoài bột khô và các loại cao trên, chúng tôi còn điều chế dịch nước của lá theo cách thức mà người dân sử dụng để chữa trị rắn cắn,

Điều chế dụng địch nước : lá và thân cây tươi (nỗi thứ 10g), giả nhuyễn, sau

đó thêm vào 10ml nước cất cho mỗi phần Vắt lấy nước, để yên cho lắng, lọc lấy

nước trong Sử dụng địch nước của lá và thân trên để làm trắc nghiệm sự hiện

dién cia sterol va triterpen

Với các mẫu cao khác : mẫu khô (1g) hòa tan trong cloroform (20ml), lọc Với mẫu cao, sử dụng 0,1g ngâm trong cloroform (30m)), lọc Lấy dịch lọc để trắc

nghiệm với thuốc thứ Liebermann-Burcbard, Salkowski va Noller

+» Thuốc thử Liebermann-Burchard :

Anhidrid acetic 20ml

H,SO, dam dac iml

tính

®% Thuốc thử Salkowski :

HạSO¿ đậm đặc

59

s* Thudc thit Noller :

Nếu thấy màu ngã qua vàng, qua cam, qua dé, qua đó thẩm là phản ứng dương tính

13 Dink tink alcaloid

Bột khô (5g) trích với dung dich Prollius (eter etil, cloroform, alco! etil, NH,OH, tỷ lệ 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lắc thường xuyên Lọc, lấy dịch lọc để làm trắc nghiệm với thuốc thử

Ngâm 0,Íg cao trong dung dich H,SO, 3%, dun nhe 3 80°C trong 6 gid Loc, lay dich loc để thử với các thuốc th Bouchardat, Mayer, Hager, Bertrand, Dragendorff

& Thudc thit Bouchardat :

Cho kết tủa mầu nâu với địch chứa alcaloid

$» Thuốc thử Mayer :

Nước cất 500ml

Cho kết tủa màu vàng nâu với dịch chứa alcaloid

& Thuốc thử BcrtaHd :

Cho kết tủa mầu trắng đục với dịch chứa alcaloid

s Thuấc thủ Hager :

Dung địch acid picric bão hòa trong nước, Cho kết tủa mâu vàng với dịch chứa aÌlcaloid

60

% Thudc thit Dragendorff :

Dung dich A: Bi({NO;) 0,85g

Nước cất 4Ôml

Khi sử dụng, trộn đều dung dịch A với dung dich B Cho trầm hiện mau vàng cam với dung dich chứa alcaloid

l4 Dinh tinh glicosid

Ghcosid được xác định bằng các phan ứng có rnàu và phản ứng huỳnh quang + Phan ứng có màu dựa trên phấn ứng đặc trưng của phần đường như phần ing Tollens (AgNO,/NH,OH); phan ting Keller-Kiliani (dac trưng của dudng 2-deoxi); phan ting Xanthidrol; phan tng Pesez

Phan ứng màu của phần không đường

Phan ting Baljet: dung dich acid picric 1% trong alcol 20%, dụng dịch NaOH 5%, nếu thấy xuất hiện mầu vàng cam hoặc hồng sẫm là phần ứng dương tính

Phan tng Molish: Thimol xanh 2% (1-2 giot), H;SO¿ đậm đặc (1m)

Nếu thấy xuất hiện mẫu đỏ là phần ứng đưởng tính,

Phần ứng Legal : hòa tan mau trong 2-3 giọt piridin, thêm một giọt nifro- prussiat natri 0,5% mới pha, rồi cho từng giot NAOH CN,

Phần ứng Kedde :

Dung dich A : acid 3,5-dinitrobenzoic 2% trong alcol

Dung dịch B : KOH 5% trong nước

Phần ứng Raymond : đồng thể tích m- dinitrobenzen 1% trong nước và NaOH 20% trong nước

Phần ứng huỳnh quang đặc biệt dùng để nhận đanh các glicosid trợ tìm có nhóm -OH 4 vi tri Cys

Để xác định sự hiện của glicosid, chúng tôi thực hiện phương pháp SOOS (co sửa đổi)

Tận trích 5g mẫu bệt khô với 20ml EtOH 20

lọc với 20ml dung địch acetät chì 20%

Na;SO¿ bão hòa Lọc, cô cạn dị

20% trong 24 giờ Lọc, chế hóa dịch Lọc, lấy dịch lọc để chế hóa với 10ml dẻ

ng dịch dưới áp suất kém ở 40C, thu được can

6]

Hoa tan can nay trong alcol etil 954% Loc, lấy dịch lọc thử với các thuốc thử Tollens, Baljet và Molish,

Với mẫu cao, hòa tan cao trong dung môi đã dùng để ly trích, lấy địch đã hòa tan đem thử với các thuốc thử,

5 Dink tính tanin

Nấu sôi mẫu bột khô (5g) trong 100ml nước cất trong 20 phút Với mẫu cao, nấu sôi 3g cao trong 100m] nước cất trong 10 phút, Lọc, thực hiện các phản ứng trên địch lọc với các thuốc thử sHasny, dung dịch gelatin mặn, dung dịch acetat chì bão hòa, dung dich FeCh 1%

© Thudc thit stiasny :

‹% Dung dich gelatin man :

a GG

Gelatin

Dung dich NaCl bao héa

£6 Dinh tinh flaven

Plavon được xác định bởi phần ứng Shibata còn gọi là phần ứng Cianidin của Wilstatter,

Thực nghiệm:

Nấu sôi mẫu nguyên liện trong nước cất khoảng 10 phút, để nguội, lọc Lấy địch lọc làm mẫu thử Cho mẫu thử vào bai ống nghiệm (1-2ml) Ong 1 ding dé đối chứng: ống 2 thêm HƠI đậm đặc (5ml), bội Mp kim loại, để yên đến lúc hết sti bot, thém từ từ alcol iso-amil theo thành ống nghiệm Đun nóng nhẹ, một vòng màu hồng bắt đầu xuất hiện rồi chuyển sang màu đồ tím, chứng tỏ có sự hiện diện của flavon

L7 Dinh tinh saponin

Theo được điển Pháp, chỉ số bọi là đệ pha loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao Tem sau khi để lắng trong ống nghiệm, tiến hành trong điều kiện qui định [18].

Dun sôi lg bột nguyên liệu trong 100ml nước cất trong 30 phút Lọc, để nguội, thêm nước cất vào cho đủ trở lại 100m]

Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao lócm, đường kính 16mm Cho vào ống

nghiệm lần lượt I, 2, 3, .10ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ

10ml Lắc mỗi ống theo chiểu dọc của ống trong 15 giây Để yên 15 phút đo

chiều cao các cột bọt Nếu cột bọt trong tất cả các ống nghiệm dưới lcm, chỉ số bọt dưới 100, nghĩa là không có saponin Nếu ống bọt có cột bọt cao 1cm là ống

số 4, nghĩa là ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột nguyên liệu thì chỉ số bọt được tính như sau : 10xL0 _ 250

Kết quả : chỉ số bọt của bột lá khô, bột thân và tất cả các cao với dung môi khác nhau đều < 100

63

U Cé lap mét sé hep chất hiểu cơ có trong cao eter déu hóa của lá cây kửn vàng

Việc cô lập một số hợp chất bữu cơ từ lá cây kim vàng được thực hiện qua các giai đoạn :

HI.1 Ly trích bột lá cây với eter dầu hỏa

Lá tươi, phơi héo, sấy khô (60-80°C), xay thành bội Tận trich 2,2kg bét lá khô với 20 lít eter dẫu hỏa (60-900C) Cô cạn dung môi ở 40C trong máy cô quay, đuổi dung môi trên bếp cách thủy Làm khô phần cao trong bình hút Ẩm chân không đến trọng lượng không đổi, thu được 48g cao eter dầu hóa

2 ^ N of a’

Kiểm tra cao eter dầu hóa vừa được điều chế :

Cao eter đầu hỏa vừa điển chế được đem sắc ký bản móng với hệ dung ly benzen-cloroforrn (8:2), phun thuốc thứ hiện hình là acid phosphomolibdic 10% trong alcol edl, sấy ở 160C trong 3 phút, thấy có một vết từ vạch xuất phát đến vạch tiển tuyến dung môi, điền đó chứng tổ ngoài sterol, triterpen, alcol béo thì cao eter dầu hỏa còn chứa một lượng khá lớn các chất béo

xử 2 ` z Ẩ 12 A , a ae eos

Để quá trình khảo sát cao eter dầu hỏa được thuận lợt hơn cần phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách phần không xà phòng hóa ra khối hỗn hợp

112 Điều chế phần không xà phòng hóa cha cao eter dau hea

Hoa tan 48% cao eter dẫu hỏa trong đụng dich gdm 36,5g KOH và 250m1 EIOH 95% Đun hoàn lưu hỗn hợp trên bếp cách thủy trong 3 giờ Để nguội, thêm 250ml nước cất vào hỗn hợp Ly trích phần không xà phòng hóa với 6 lt etcr etl, Rửa dịch trích eter etil nbiéu lần bằng nước cất đến pH = 7 Làm khan dung môi eter eul với NazSOa Lọc, cô cạn dịch trích eter etl, Cao eter đâu hỏa phần không

xà phòng hóa được cho vào bình hút ẩm chân không đến khi trọng lượng không đổi, thu được 11g

11.3 Cô lập 5 hợp chất hữu cơ từ phần không xà phòng hóa

Hoa tan ilg cao eter dầu hỏa phần không xà phòng hóa trong cloroform, Thực hiện sắc ký cột khô nhanh trên phếu lọc xốp có đường kính 8cm, với chất

64

hap phu silica gel Dung ly được sử dụng là eter dầu hỏa, benzen và hỗn hợp eter dầu hỏa với benzen, mỗi phân đoạn hứng từng 5Øml,

Dùng 3 thuốc thử Liebermann-Burchard, Salkowski và Noller kết hợp với sắc

ky ban mong silica gel vdi hé dung ly là eter dầu hỏa, benzen, cloroform và hỗn hợp của chúng, thuốc hiện hình là acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95% để theo đöi quá trình sắc ký

Chúng tôi thu được I1 phần đoạn lớn, được đánh số từ l đến XI rong đó, ngoài 4 phân đoạn [, Il, VI va V đuợc tiếp tục khảo sát, các phân đoạn còn lại cho

et qua sac ky ban mong xuất hiện nhiều vết nên chúng tôi tạm để lại, chưa khảo sat

113.1 Cé lap hop chat Barleria T

Phân đoạn I (1-75) c6 két quả sắc ký bản mỏng với hệ dung ly eter dầu héa- benzen (8:2) cho 2 vết xa nhau

Phân đoạn thu được có dạng bột, màu tring Két tinh Jai trong n-heptan nhiéi lần cho hợp chất có tình thể hình vay mau trắng, có trọng lượng 0,14g, giá trị

R, = 0,69 (eter dau héa-benzen §:2), có nhiét dé néng chay 69,5°C, đặt tên là Barleria T

11.3.2 Cé lap hep chất Sterol K

Phân đoạn II (76-150), thu được từ sắc ký cột bởi hệ dung ly eter dau hỏa- benzen (9:1) Sắc ký bản móng hệ dung ly eter dau hỏa-benzen (8:2) cho 2 vết xa nhau Kết tình phần đoạn H trong alcol metil cho tỉnh thể hình kim, màu trắng, có trọng lượng 0,02g, có giá trị R; = 0,38 (eter dầu héa-benzen 1:1), nhiệt độ nóng chây 180-181°C, dat tén 1A Sterol K

13.3 Cô lập hợp chất Barteria K

Phân đoạn IV (315-495), thu được từ sắc ký cột bởi hệ dung ly eter dầu hóa- benzen (9:1) Sắc ký bản mồng hé dung ly benzen-cloroform (8:2) cho mot vết tròn, rõ Rửa hợp chất nhiều lẫn trén phéu buchner với n-heptan Kết tinh lại nhiều lần trong alcol meul có sử dụng bột than, cho tính thể dang bét, mau trắng đục, có trọng lượng 0,06g, có giá trị Rr =0,1§ (benzen-cloroform §:2), nhiệt độ

nóng chảy 83-84°C, đặt tên là Barleria K

65

113.4 Cé lap hop chat Sterol 4 va Sterol S

Phân đoạn V (496-772), thu được từ sắc ký cột bởi hệ dung ly eter dầu hỏa- benzen (9:1), Sắc ký bản mỏng hệ dung ly benzen-cloroform (8:2) cho 2 vét cd Ry rất gần nhau Vì thế chúng tôi quyết định tách hai chất này bằng phương pháp sắc

ký bản dày, hệ dung ly benzen-cloroform (8:2) Kết quả, chúng tôi thu được hai hợp chất có giá trị R¿ lần lượt là 0,27 và 0,14 với hệ dung ly benzen-cloroform (8:2), dat tén la Sterol 4 va Sterol 5

Hợp chất Sterol 4, tinh thể có dạng hình kim, màu trắng, có trọng lượng

0,22g, có nhiệt độ nóng chảy 196C

Hợp chat Sterol 5, dang tinh thé hinh kim, khong mau, c6 trong long 0,20g,

cé nhiét dé néng chay 164-166°C

Như vậy, trong phần không xà phòng hóa của cao eter đầu hỏa trích ly từ lá cây kim vàng, chúng tôi đã cô lập được 5 hợp chất hữu cơ được đặt tên trong bài

1A Barleria T, Sterol 4, Sterol 5, Sterol K va Barleria K

66