Thực nghiệm thành phần hóa học cât trùy hoa tông bảo

Thực nghiệm thành phần hóa học cât trùy hoa tông bảo

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Chùy hoa tổng bao Trang 66

4.1 NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN

CỨU

4.1.1 Hóa chat

e Dung môi dùng trong sắc ký cội và sắc ký điều chế, bảng mồng gồm: eter dầu héa ( 60°C- 90°C ); n- hexan; benzen; cloroform; acetat etyl; aceton; metanol va etanol déu 1A héa chat Trung Quéc va duoc lam khan bing CaCl néu sif dung lai

e Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ trên bản mỏng, phun xịt bằng acid

sulfuric dam đặc hoặc dùng hơi iod và dung dịch FeCh,

4.1.2 Thiết bị,

e Các thiết bị dùng để ly trích ( lọ thủy tính, becher )

e May cô quay chân không Buchi- Ì 11

e Cột sắc ký: cột khô, cột cổ điển

e Sic ky ban mong 25DC — Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254 Merck

e Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne

e Các thiết bị ghi phổ:

- Phổ IR; Ghi trên máy quang phổ hồng ngoại TR-470 SHIMADU, BRUKER-

EQUINOX 55

-Phé MS—EL Ghi trén may 5989B-HP-MS-Engine

- Phổ MS phân giải cao: Ghi trên máy quang phổ LC-MSD-Trap-SL Phổ

!_RMN, °C_RMN, kết hợp với phổ DEPT- RMN 135 và 90: Ghi trên máy

cộng hưởng từ hại nhân Bruker 500 MH¿z cho phổ proton và 125 MH¿ cho

°C-RMN

- Phổ mô phéng 'H-RMN va °C-RMN: Ghi bang ACD-proton H-RMN DB ( V.6.12) và ACD-carbon C-RMN DB ( V.6.12)

- Phể UV : Ghi trên méy VARIAN UV-Vis CARY

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: PHAM VAN TOAN EM

Tất cả phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học Khoa Học

Tự Nhiên, Số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội Riêng phổ UV ghi

tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố

Hồ Chí Minh

4.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TU

CÂY CHÙY HOA TỔNG BAO

4.2.1 Điều chế cao etanol

Ngâm dầm 1,9 g bột cây khô trong lọ thủy tĩnh khoảng 24 giờ (loại 20 lít) lọc, cô cạn dung môi trong máy cô quay ở 50°C thu được cao etanol, lập lại quá

trình trên nhiều lần đến khi trích kiệt mới thôi

4.2.2 Điều chế cao eter dầu hỏa, cao cloroform, cao etyl acetat, cao metanol

Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các

- đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực, theo dõi qúa trình bằng sắc ký

bản mồng rồi cô quay thu hổi dung môi sẽ thu được các loại cao tương ứng

4.2.3 Cô lập các hợp chất có trong các loại cao

Tiến hành sắc ký cột (nhanh cột khô, cổ điển) các loại cao, sau đó sắc ký

cột và sắc ký điều chế nhiều lần trên những phân đoạn được chọn để cô lập các

hợp chất Toàn bộ qúa trình trên được theo đõi bằng sắc ký bản mỏng với thuốc thử hiện hình là acid sulfuric đậm đặc hoặc hơi iod

4.3 THU NGHIEM HOẠT TÍNH SINH HỌC t!*!1,

4.3.1 Dụng cụ

— Becher cdc loại: 250ml (2 chiếc); 500ml (2 chiếc); 1000ml (2 chiếc) dùng

để ấp trứng

—_ Khay thử với các ống nghiệm có vạch định mức 5ml, kính lúp, đèn pin

nhỏ

GVHD: PGS.TS NGUYỄN KIM PHI PHỤNG HVCH: PHAM VAN TOAN EM

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Chùy hoa tổng bao Trang 68

_ Ống đong 1Ôml (3 chiếc) có chia vạch Iml, Sml

—_ Pipettma sử đụng cone 10 ~ 100 n1, 100— 1000 pl

~ Lo thiy tinh loại 5ml (10ml) có nắp đậy kin dùng để pha mẫu thứ

4.3.2 Hóa chất

~ Dung mdi DMSO (Dimetil sulfoxid) loại tình khiết, hãng Prolabo

—_ Nước biển (loại dùng để nuôi cá cảnh biển), nước cất

—_ Gossypol và plnmbagin được sử dụng như chất đối chứng dương

4.3.3 Nguyên liệu,

Tring Artemia salina

4.3.4 Cách tiến hành

4.3.4.1 Ấp trứng thành Gu thé

- Cân 0,1 gam trứng cho mỗi lần thử (khoảng 100 ống nghiệm), cho vào becher,

ngâm với 50 mÌ nước cất trong 30 phút, lọc trứng trên giấy lọc và phễu thủy

tinh

- Dùng ống hút bơm nước biển rửa trứng trên giấy lọc cho chảy vào một becher

có chứa sẵn 100 ml nước biển Sau đó thêm nước biển vào cho đủ 250 ml

- Ngâm becher vào một thau nước nhỏ để giữ nhiệt độ trong khoảng 28 °C — 34°C (trên 35 °C ấu trùng sẽ chết) Không cần đậy kín, để yên becher sau 48 giờ,

- Dùng đèn pin soi cho ấu thể tập trung tại vùng có ánh sáng, rồi dung ống hút

chúng thả riêng vào một becher có chứa sẵn 150 ml nude biển sạch (nến trước 48

giờ mà thấy ấu thể nở nhiều và bơi khỏe thì nên hút chúng để riêng dân theo cách như trên nhằm tạo điều kiện cho ấu thể hô hấp tốt), Chỉ sử dụng ấu thể nổ

trong khoảng thời gian từ 48 ~ 72 giờ

4.3.4.2 Cách pha mẫu

+ Pha mẫu cái; đối với cao nên pha nỗng độ lớn, thy vao kết qủa độc tính mà

có sự giảm hoặc tăng nông độ cho lần thử tiếp theo Cân 30mg cao cho vào lọ,

GVHD: PGS.TS NGUYÊN KIM PHI PHỤNG HVCH: PHAM VAN TOAN EM

nhỏ vào một ít dụng môi DMSO hoặc dụng môi trích cao để hòa tan (tổng thể tích tích DMSO và dung môi trích cao < 150 nÙ), có thể đun cách thủy nhẹ để cao tan tốt hơn Thêm 3 ml nước biển vào lọ, đậy nắp lắc đều

© Pha mẫu chứng :

~ Mẫu chứng đương: cân 5 mg Plumbagin, bòa tan bằng bằng 50 ul aceton rồi

thêm 1 ml nước biển, đậy nắp, lắc đều

~ Mẫu chứng dung môi trích cây: cân 30mg dung môi trích cây cho vào lọ, nhỏ thêm vài giọt DMSO để giúp dung môi dễ phân tán trong nước (thể tích DMSO

< 150 pb), réi thém 3 ml nước biển, đậy nắp, lắc đều

~ Mẫu chứng DMSO: hòa tan 150 n1 DMSO bằng 3 ml nước biển trong lọ

4.3.4.3 Cách tinh

e Tính nông độ

- Mẫu cái: 30 mg/ 3ml tương đương 5mg/500 nl Như vậy, nếu hút 500 nÌ sẽ có chứa 5mg mẫu chất Sau khi thêm nước biển cho đủ 5 mi thì nồng độ khi đó sẽ

là 1000 bg/ nL, tính tương tự cho các nông độ khác

~ Mẫu chứng dương (Plumbagin): 5mg/ mÌ tương đương 0,5mg/100 pl Nhu vay, néu hit 100 pl sé cé chita 0,Smg Plumbagin Sau khi thêm nước biển cho đủ 5 ml

thì nỗng độ khi đó sẽ là 100 ng/ pl

~ Mẫu chứng dung môi trích cây: nếu pha mẫu cái ở nông độ nào thì mẫu chứng dụng môi trích cây cũng phải được pha ở nông độ đó

— Mẫu chứng DMSO:có thế không cẩn tính nồng độ nhưng với 150 ul DMSO/3ml nước biển (sử dụng lượng bằng với lượng hòa tan cao), cũng hút 500

ul, 250 yl, 5Ơ nÌ cho vào mẫu thử,

GVHD PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: PHAM VAN TOAN EM

Góp phân tìm hiểu thành phần hóa học của cây Chùy hoa tổng bao Trang 70

e Tính toán liều LCsạ

Liểu IC;o là liều mà mẫu thử được pha với nỗng độ xác định có thể giết

chết 50% ấu thể Brine Shrimp trong vòng 24 giờ Nếu số lượng ấu thể chết ít hơn

50% ở một nồng x nào đó và chết 100% ở nông độ lớn hơn 10x, thì phải thử

nghiệm lại ở những nỗng độ loãng hơn trong khoảng x đến 10x để xác định chính

xác liễu ICso

4.3.4.4 Cách thử (mỗi nông độ muốn thử được thực hiện trên 3 ống nghiệm)

Từ becher chứa ấu thể, dùng pipette pasteur hút 10 con cho vào mỗi ống

nghiệm, sao cho thể tích nước biển trong ống đạt ống đạt khoảng 4 ml Bom mau chất vào ống thử rồi thêm nước biển cho đủ 5ml/ ống nghiệm Khay thử được che đậy, để yên sau 24 giờ Dùng kính lúp đếm số lượng ấu thể chết ở mỗi ống nghiệm, suy ra tỷ lệ nauplius chết do dung dịch thử nghiệm ở mỗi nồng độ

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: PHAM VAN TOAN EM