Thực nghiệm thành phần hóa học của cây cúc áo

Thực nghiệm thành phần hóa học của cây cúc áo

3.1- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phuong pap tach chéét

Điều chế cao eter dầu hỏa, cao cloroform bing Soxhlet

Phin life edie cha tb bite et

Sắc ký cột chậm với silica gel 70-270 mesh (Merck.) Dùng các loại cột có kích thước như sau:

| Cột1 | Cật2 | Cột3 Đường kính/chiểu cao (cm) | 5⁄60 | 3⁄40 | 2⁄30

Sắc ký cột nhanh với silica gel 60 H loại đùng cho bản mỏng (Merck) Dùng

các loại cột có kích thước như sau:

| Cột] | Cột 2

Sắc ký bản mỏng loại 25 DC- Alufolien 20x20 cm, Kieselgel 60 F554 (Merck)

- Diém nong chay được đo trên khối Maquenne và máy MODEL WRS-!

DIGITAL MELTING POINT APPARATUS

- Phân tích nguyén té carbon, hidrogen được do trên máy phân tích C, H tự động tại Trung tâm DVPT & TN Thành phố Hồ Chí Minh

- Sắc ký khí ghép khối phổ được thực hiện trên máy Sắc ký GIRDEIL- 32 ghép khối phổ R10-10C NERWAY tứ cực của Trung tâm DVPT & TN Thành phố Hồ Chí Minh

- Phổ tử ngoại được ghi trên máy Model UV LS 28 USA ctia Khoa Hóa, Đại

Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh

- Phổ hồng ngoại được đo trên máy quang phổ hồng ngoại IR -470 SHIMADU

- Phổ cộng hưởng tử hạt nhân H: được thực hiện trên máy cộng hưởng từ

hạt nhân BRÙỦKER AC.200, tần số cộng hưởng 200 MHz

- Phổ cộng hưởng tử hạt nhân BC két hợp ky thuật DEPT được đo trên máy

cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.200, tan số cộng hưởng 50 MHz

- Khối phổ: được đo trên máy đo khối phổ 5989 BMS -Viện Hóa Học, thuộc

Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Hóa Học - Hà Nội

3.2- PHAN DINH TINH

3.2.1- Xác đỉnh đô ẩm nguyên liệu

Cây Cúc Áo, Soilanthes acmella, được định danh bởi GS.TS Lê Công Kiệt,

Tổ bộ môn Thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ

Chí Minh Cây Cúc Áo được hái ở xã Hưng -Phú, Thành phố Cần Thơ, thời gian: từ

tháng 7 đến 9 năm 1998

Cân từng bộ phận tươi của cây: lá, hoa, thân, rễ, sấy ở nhiệt độ 105°C cho

đến khi trọng lượng không đổi Cân trọng lượng sau cùng suy ra độ ẩm Mỗi mẫu thực hiện 4 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả được trình bảy trong bảng 3

Bảng 3: Độ ẩm trung bình của các bộ phận cây Cúc Áo

3.2.2- Xác đỉnh hàm lượng tro của nguyên liều

Cân từng bộ phận khô của cây (5 ø), nung mẫu ở nhiệt độ 200 - 300°C, sau

đó nâng nhiệt độ lên 400-500°C cho đến khi mẫu thành tro trắng, cân trọng lượng tro suy ra hàm lượng tro của các bộ phận cây Cúc Áo Tro này được dùng để định

tính các ion vô cơ có chứa trong các bộ phận Kết quả được trình bảy trong bảng 4 Bảng 4: Hàm lượng tro của các bộ phận cây Cúc Áo

3.2.3- Dinh tinh các ion vô cơ trong tro của các bộ phân cây Cúc Áo [31]

Hoa tan tro (0,5 g) cua tting b6 phan cây trong dung dich HC] 10% (10 ml),

lọc và pha loãng trong nước cất (50 ml) Dung dịch nảy dùng để xác định sự hiện diện của các ion Ca”, K”, Mg”, Fe”, Fe”, SO,”

Hòa tan tro (0,5 g) của từng bộ phận cây trong dung dịch HNO; 10% (10

ml), loc, dich lọc nảy dùng để xác định sự hiện diện của các ion CI”, PO, ”.Kết quả định tính được trình bày trong bảng 5

3> Phần thực nghiệm 17

Bảng Š§: Kêt quả xác định các ion vô cơ trong cây Cúc Ao

Ca?” H;SO/, Na;SO,, Na;CO; | Kết tủa trắng + | + + | +

Mn? AgNO, + HNO, + K,S,O, | Két tia nau — } - — |

khong tan H , OH”

Kết luận: Tro của các bộ phận trong cây củng chứa các

Ca”, Fe”, CI, SO,”, PO,”

ion giông nhau: K,

3.2.4- Định tính các cấu tử hữu cơ có trong hoa, lá Cúc Áo

Để tìm hiểu sơ bộ thành phần hóa học của cây Cúc Ao, chúng tôi tiến hành định tính sự hiện diện một số cấu tử hửu cơ thưởng hiện diện trong cây có như: sterol, flavon, tanin, glicosid, alcaloid, saponin

Mỗi cấu tử hữu cơ được định tính bằng những thuốc thử đặc trưng riêng, thưởng là các thuốc thử cho phản ứng có màu hoặc phản ứng trầm hiện Trên kết

quả định tính các cấu tử hữu cơ, chúng tôi tiến hành việc định lượng một số các loại hợp chất hữu cơ có trong cây Cúc Áo

Sự khảo sát các cấu tử hữu cơ trong hoa và lá được thực hiện trên các dạng nguyên liệu, bột khô, cao eter dầu hỏa và cao etanol Các loại nguyên liệu trên được

điều chế theo sơ đô 3

- Phơi khô Cô 6 ap suat thap

So dé 3: Diéu ché bét thd, cao eter dau hda, cao etanol của lá và hoa cây Cúc Ao

3.2.4.1-Dinh tinh sterol: [22] [32] [33]

Sterol được xác định dựa trên các phản ứng với các thuốc thử sau đây:

Liebermann - Burchard:

Anhidric acetic: 20 mi

Nếu xuất hiện màu xanh nhạt, lục, hểng hoặc đỏ là phân ứng đương tính

Salkowski: H.SO, dam dac

Nếu xuất hiện màu đổ là phản ứng dương tính

Cân mẫu: bột thô, cao eter dầu hỏa, cao etanol (0,1 g) hỏa tan trong CHCI, (30-ml) loc lay dịch lọc để trắc nghiệm với thuốc thủ trên Kết quả định tính được

trình bảy trong bảng 6

a x

Bang 6: Kêt qua định tính sterol trong bột thô, cao eter dâu hỏa và cao etanol của

lá và hoa cây Cúc Ao

3.2.4.2- Dinh tinh flavon [34]

Flavon được xác dinh bdi phan ung Shibata con goi la phan ung Cianidin ca

Wilstatter Thuốc thử gồm: HCI đậm đặc; bột Mg kim loai ; alcol isoamil

Tiên hanh:

Nấu sôi mẫu nguyên liệu trong nước cất (bột thô, cao eter dâu hóa, cao etanol

0,1g trong 100 mÌ nước cất) khoảng 10 phút Để nguội, lọc, lẫy dịch lọc làm mẫu

thủ Cho mẫu thử vào 2 ống nghiệm

z

A

Ong thứ nhất dủng đối chứng, trong ống thứ hai, thêm HCI dam dac (5 ml) bột Mg kim loại và thêm từ tử alcol isoamil theo thành ống nghiệm Đun nóng nhẹ, một vòng màu hồng tử từ xuất hiện rồi chuyển sang màu đỏ tím, chứng tỏ sự hiện

diện của flavon Kết quả được trình bảy trong bang 7

, Bảng 7: Kết quả định tính favon trong bột thô, cao eter dầu hóa, cao etanol của lá,

hoa cây Cúc Áo

3.2.4.3- Dinh tính alcaloid [35] [36]

Để định tính alcaloid, chúng tôi tiến hành theo phương pháp sau đây:

Ngâm nguyên liệu (bột khô, cao eter dầu hỏa, cao etanol (0,1 g) trong dung

dịch HạSO¿ 3% Dun nhẹ ở 80°C trong 6 giờ Lọc, lấy dịch lọc để thử với các thuốc

thứ như Bouchardat, Mayer, Hager, Bertrand

Thuốc th Bouchardat: l;: 2,5 g; KĨ: 5 g; Nude eat: 100 ml

Thuốc thủ sẽ cho trầm hiện mảu nâu với dụng dịch có chứa alcaloid

Thude thi’ Dragendorff:

Dung dich A: Bi(NQO,); 20 g trong HNO, dam diac (30 ml) Dung dich B: KI (68 g) trong nước cất (60 ml) Hòa tan 2 dung dịch trên, để yên trong 24 giỏ, thêm

nước cất đủ 250 ml

Thuốc thử sẽ cho trầm hiện màu vàng cam với địch chúa alcaloid

Thu6c thie Mayer: HgCl,: 1,36 ¢; KI: § g ; Nude cat: 100 ml

Hoa tan HgCl, trong 60 mÍ nước cất và KĨ trong 10 mi nước cất Trộn đều 2

hỗn hợp và thêm nước vửa đủ 100 ml,

Thuốc thủ sẽ cho trầm hiện màu cam với dụng dịch có chứa alcaloid

Thuéc thi’ Hager:

Dung dich acid picric bao hoa trong nude cho tram hién mau vang voi dich

chứa alcaloid

Kết quả định tính alcaloid được trình bảy trong bảng 8

Bảng 8: Kết quả định tính alcaloid trong bột thê cao eter dầu hỏa, cao etanol của

3.2.4.4- Dinh tinh Saponin: [37]

Theo được điển Pháp, chỉ số bọt là độ pha loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao lcm sau khi lắc trong ông nghiệm, tiên hành trong điều kiện qui định

Tiến hành:

Cho |g nguyên liệu vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi Giữ cho sôi

nhẹ 30 phút Lọc, để nguội và bủ thêm nước cất đến cho đủ 100ml Lấy 10 ống

nghiệm (16 x 160 mm) cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

mi nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ i0ml Lắc ống nghiệm

theo chiều dọc của ống trong 15 giây Để yên 15 phút, đo chiều cao của các cột bọt

để tim xem ống nghiệm nào có cột bot cao | cm Thi du éng nghiệm số 4 có cột bọt

cao Ì cm, chí số bọt của nguyên liệu khảo sát sẽ là:

{Ox

Nếu cột bọt trong tất cả các ông nghiệm đều dưới Ì cm, chỉ số bọt dưới 100,

nghĩa là không có sapoain Kết quả được trình bày trong bảng 9

Bang 9: Kết quả định tính saponin trong lá và hoa cây Cúc Ao

Để xác định tanin, chúng tôi sử dụng các thuốc thử cho phần ứng màu và

trầm hiện sau đây:

- Dung dich chi acetat bao hoa

- Dung dich FeCl, 1%

Tiên hanh:

Dun mau nguyén liệu trong nước cât khoảng lÔ phút, lọc lây dịch trong dé

thực hiện phản ứng màu và trầm hiện

- Lấy 2 mì dịch trong, thêm 2 - 4 giọt chì acetat bão hỏa, có trầm hiện vàng

nhạt, cho biết có tanin

- Lấy 2 ml dung dịch trong thêm 2 ml FeCl;, dịch chuyển sang xanh đen, cho

biết có tanin

Kết quả định tính tanin được trình bày ở bảng 10

Bảng 19: Kết quả định tính tanin trong lá và hoa Cúc Áo

Két luận: Bột thô, cao etanol của lá và hoa Cúc Áo chứa tanin Cao eter dâu

hóa của lá và hoa không chứa tanin

3.2.4.6- Dinh tinh glicosid [39]

Glicosid có thể được định tính bằng các phần ứng có màu va phản ứng huỳnh

quang sau đây:

+ Phản ứng màu đưa trên phần ứng đặc trưng của phần đường như phần ứng Tollens (AgNO, trong NH,OH), phan ung Keller Kilani (phản ứng đặc trưng của

dudng 2-deoxy), phan ung Xanthidrol, phan ung Pesez

+ Phan ung mau của phần không đường

- Phản ứng Baljet Dung dịch acid picric 1% trong alcol (20ml) nếu xuất

hiện màu vàng cam hoặc hồng xâm là phản ứng dương tính

- Phản ứng Molish: Thimol xanh 2% (1 - 2 giọt), HạSO, đậm đặc 1 ml

Để xác định sự hiện diện của glicosid, chúng tôi dùng phương pháp SOOS (có sửa đối) theo sơ đổ 4 Dịch etanol sau củng được dùng làm dung dịch thủ vỏi các thuốc thử Baliet, Molish

- Cô can ổ áp suất thấp

- Hoa tan can trong EtOH 95%

(dùng để trắc nghiệm với thuốc thử Baljet và Molish)

Sơ đề 4: Định tính glicosid theo phương pháp SOOS

Kết quả định tính giicosid được trình bảy trong bảng 11

Bảng 11: Kết quả định tính glieosid trong lá và hoa cây Cúc Áo

Kết quả: Bột thô, cao etanol của hoa và lá có glicosid Cao eter đầu hóa của

hoa và lá Cúc Áo không có glhicosid

3.3- PHẦN ĐỊNH LƯỢNG:

3.3.1- Định lượng tanin [38]

Chúng tôi dủng phương pháp Takashi Yoshida (1988) để xác định tanin thô

ui trình được trình bày theo sơ đề 5

Thu hồi dụng mỗi

[ Dịch nước } | Dich etil eter}

Tan trích voi etil acetat

Sơ để 5: Xác định hàm lượng tanin trong bột thô lá, hoa Cúc Áo

Kết quả tanin thô: Lá: 0,12 %

Hoa: 0,15%%

3.3.2- Dinh lugng glicosid tim [39]

Để xác định hàm lượng glicosid tim, chting téi tién hanh theo so dé 6

- Rửa với nước

- Lam khan voi CaCl,

- Cô dung môi

Glicosid tim |

Sơ đồ 6: Định lượng glicosid tim

Kết quả: Hàm lượng glicosid tim trong lá: 1,59%

Hàm lượng glicosid tim trong hoa: 1,78%

Kết quả định tính và định lượng các cấu tử hữu cơ có trong cao eter dầu hỏa

và cao etanol của lá và hoa cây Cúc Ao được tóm tắt trong bảng 12

3~ Đhần thite nohiam - 26

thô, cao eter dầu hỏa và cao etanol của lá và hoa cây Cúc Áo

Khảo sát sơ bộ thành phản hóa học của cây Cúc Áo cho kết quả sau:

- Bột thô của lá, hoa Cúc Áo chứa sterol, flavon, saponin, tanin, glicosid

- Cao eter dầu hóa của lá, hoa Cúc Áo chỉ chứa sterol

- Cao etanol la, hoa Cúc Áo chứa flavon, saponin, tanin, glicosid

3.4- ĐỊNH TÍNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA HỢP CHẤT LACTON

CÓ TRONG HOA và LÁ CÂY CÚC ÁO:

3.4.1- Qui trình trích ly các hợp chất sesquiterpen lacton

Sesquiterpen lacton là những hợp chất có độ phân cực tử yếu đến trung bình,

một số tác giả để nghị hai qui trình trích ly sesquiterpen lacton: trích mẫu nguyên liệu tươi bằng nước cất và cloroform [2] ;trích mẫu nguyên liệu khô bằng eter dầu

hỏa và cloroform [41] Chúng tôi đã thực hiện cả 2 qui trình trên trình bảy trong sơ

Dich chiét nước}

- Tủa bằng dung dich (CH,;COO),Pb

Cặn chiết Ì (mẫu cao thô)

Sơ đề 7: Qui trình chiết mẫu cây tươi bởi nước và cloroform [2]

Bảng 13: Hàm lượng cao thô các bộ phận hoa, lá, thân, rễ cây Cúc Áo trích ly theo

- Trộn cao etanol với bột alumin làm chất mang

- Trích với eter dầu hỏa trên Soxhlet

[ Cao eter dầu hóa Ì Dịch cloroform | Bã

- Lam khan bằng Na;SO,

3.4.2- Định tính sự hiện diên của sesquiterpen lacton trong các mẫu

cao thô của cây Cúc Áo

3.4.2.1- Khảo sát bằng sắc ký bản mỏng [25]

Các mẫu cao thô được sắc ký bản mỏng với hệ dung ly là benzen: etil eter

(4:6), thuốc hiện màu là acid sulfiric đậm đặc, rồi sấy bản mỏng ở 100-120°C Kết quả sắc ký bản mỏng trên các mẫu cao thô hoa, lá, thân, rễ Cúc Áo được ghi ở bảng

3 | 0.29 | Vết mở, màu | 0.29 | Vết mở, màu | 0.29 | Vết mở, màu |0.29Ì Vết mở,

4 | 0.22 | Vết mơ, màu |0.22| Vết mò, màu |0.22| Vếtmơ, |0.22| Vết mờ,

5 | 0.12 | Vét md, mau) 0.12) Vết mở, màu | 0.12 | Vết mở, màu |0.12| Vết mở,

6 | 0.06 | Vết mở, màu | 0.06 | Vết mờ, màu | 0.06 | Vết mở, màu |0.06|_ Vết mơ,

Nhận xét:

- Cả 4 bộ phận: hoa, lá, thân rễ đều cho kết quả với các vết gần giống nhau

Các vết dêu không thấy được bằng mắt thưởng, những thấy được qua đèn UV vả cho hiện màu với thuốc thử acid sulfuric đậm đặc, sấy bản móng 120°C trong vải phút

dam nhung 2 bộ phận hoa và lá thì 2 vét nay rat mo

- Trên bản móng có 6 vết, có thể gồm nhiễu hợp chất co mang các nhóm

chúc khác nhau, trong số đó có sự hiện điện của những hợp chất có chúa vòng laclon do hiện màu với các thuốc thứ H,SO, đậm đặc vả sấy bản móng 6 120°C

3.4.2.2- Khảo sát bằng phổ hồng ngoại [26]

Để dịnh tính sự hiện diện của lacton trong các mẫu cao thô, chúng tôi khảo

sát mẫu cao thô được điều chế theo hai qui trình (sơ để 7 và sơ để 8) bằng phổ hỏng

ngoại Kết quả được trình bày trong bảng 16 (phụ lục số 1, 2, 3, 4) và bằng 17 (phụ lục số 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12)

Bảng 16: Kết quả phổ hổng ngoại của các loại cao CHCH; thô cây Cúc Áo, trích ly

theo sơ đồ 7

3.4.2.3- Khảo sát bằng phương pháp hóa học [22]

Mẫu thử là cao eter dầu hỏa và cao cloroform của lá và thân Cúc Ao trích ly theo sơ đồ ÿ

* Phan ứng với 2,4-dinitrophenilhydrazin (phan ứng nhận diện nhóm carbonil): cho một giọt dung dịch cần thử vào một ống nghiệm, nhỏ thêm | ml dung

dich 2,4-dinitrophenilhidrazin Da s6 aldehid va aceton sé cho tia vàng đến đó Một vài chất cần đến 5 phút có khi còn đun nhẹ

Ceton é >=O cho trầm hiện vàng; ceton liên hợp < >=0 cho trầm hiện cam đỏ; ceton có cộng hướng cho nhiều trầm hiện đó

* Phan ứng với hydroxymat ferie (phần ứng chung của hợp chất lacton)

Vài giọt dung dịch thử trong etanol hoặc etil eter, thêm một giọt dung dich

hydroxilamin clohydrat 2N, | giot KOH 2N trong metanol Dun cách thủy 1-2 phút,

dé ngudi Acid hoa dung dich voi 1 - 2 giot HC] | N Thêm Ì giọt FeCl; 13⁄4 Nêu

cé mau man tia la phan ung đương tính Nếu không có màu thì pha loãng it nước rồi quan sát lại

* Phần tứng với thuốc thi Baljet (acid picric)

Các hợp chất có vòng ơ, B lacton không nọ khi phần ứng với thuốc thủ Baljet cho mâu vâng cam

Kết quả định tính sesguiterpen lacton bằng phản ứng hóa học được trình bày

trong bang 18

Bảng 18: Kết quả định tính sesquiterpen lacton bằng phản ứng hóa học

Thuốc thủ B: Hidroximat feric

Thuốc thử C: Acid picric (thuốc thủ Baljet)

Nhận xét: Các kết quả kháo sát trên các loại cao: bằng phương pháp hóa

học va phương pháp phổ nghiệm (hồng ngoạÙ, cho thấy các bộ phận cáy đếu có thể

cø chúa hợp chất sesqutHerpen lacion Chúng tôi hụ vọng nếu có thêm thỏi gian, sẽ tiếp tục trích ly, cô lập loại hợp chất này trên cây Cúc Áo

3~ Phần thực nghiệm 32

KHẢO SÁT CAO ETER DẦU HỎA BẰNG PHƯƠNG

PHAP SAC KY COT

Theo các tài liệu nghiên cứu, cây Cúc Áo có nhiều ung dung kha quan trong trong y hoc G Việt Nam, người dân chỉ dùng Cúc Áo theo kinh nghiệm dân gian và chưa có tác giả nào thực hiện các phương pháp hóa lý để tách chiết, phân lập các hợp chất có trong Cúc Áo Xuất phát tử tình hình này, chúng tôi đã thử nghiệm trên nhiều loại cao để mong cô lập một vài loại hợp chất hữu cơ có trong cây

Chúng tôi đã điêu chế cao eter dầu hỏa của lá Cuc Ao và áp dụng phương

pháp sắc ký cột để phân lập một số hợp chat co trong cao

3.5.1- Điều chế cao eter dầu hỏa và cao eter đầu hóa phần không và

phòng hóa từ lá Cúc Áo

d) Xử lý mẫu

Cây Cúc Ao sau khi thu hải, nhặt lẫy phân lá, rửa sạch và phơi khô lá dưới

ảnh nắng mặt trời, sây lá ở nhiệt độ 40 - 50”C cho đến khi có trọng lượng không đổi

Xay lá khô thành bội để dùng làm mẫu nguyên liệu cho nghiên cứu

b) Diéu ché cao eter dau hoa va cao eter dâu hóa phần không xà phòng hóa Tận trích lá khô (3,8 kg từ 20 kg lá tuoi) vdi eter dau hda trong Soxhlet Loc,

và cô cạn địch lọc ổ áp suất thấp nhiệt độ 40°C để đuổi dung môi, thu được cao eter dau hỏa (110gr) Phân nửa lượng cao này tiếp đó được xà phỏng hóa

Hòa tan cao eter dầu hóa (55g) trong dung địch KOH - etanol 95% (50 g

KOH khan trong 350 ml etanol 95%) Đun hoàn lưu hỗn hợp trong 2 giỏ Để nguội, thêm nước vào hỗn hợp (300 ml) Tân trích phần không xà phòng hóa với ebl eter, ria dung dich etil eter vdi nude cat, lam khan bing Na,SO, Loc, cé can dich etil

eter Thu được phần không xà phòng hóa (19 gr) Qui trình điều chế cao được trình

bay trong so dé 9

G3 Os

3~ Phần thực nghiệm

[ Bã lá Ì[ Dịch eter dâu hỏaÌ

Cô cạn dưới áp suất thấp ở 40°C

- Dun hoan fuu vdi dung dich KOH/Etanol

- Tân trích vdi etil eter

- Rửa với nước

Sự đã 9: Điều chế cao eter dầu hóa va cao eter dau héa phan khéng xa phong hoa

của lá cây Cúc Áo

Hai loại cao eter dâu hỏa và cao eter dầu hỏa phần không xa phỏng hóa được

sắc ký bản mỏng với hệ dung ly là cloroform, thuốc thử hiện hình các vết là dung dịch acid phosphomolipdic 103% trong etanol 90%; phun thuốc thủ lên bản mỏng, sấy bản ở 120°C trong 15 phút Kết quả sắc ký bản mỏng trình bảy trong hình 4

Nhận xét: Sắc ký hẳn móng cho thấy cao eter dau hoa phan không xa phòng

hoa che các vết tưởng đối sạch và rõ ràng hơn so vải cao eler dâu hóa chưa được

xa phong hoa