Thực nghiệm thành phần hóa học nấm linh chi

Thực nghiệm thành phần hóa học nấm linh chi

Việc khảo sát định tinh và trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ trong nấm Linh

chỉ, được thực hiện phương tiện, hóa chất và kỹ thuật sau:

Tình chế dung môi và chuẩn bị các thuấc thử

se Dung môi: alcol 95°, eter dầu hỏa, benzen, cloroform, acetat etyl, aceton,

metanol, déu dude lam khan bing Na,SO,,

e Thuốc thử: để hiện bình các vết chất hữu cơ trên bán mồng phun xịt bằng

acid sulfuric đậm đặc và ding hoi iod

Thiết bị chính và kỹ thuật tiến hành

Cột sắc ký (silica gel nhanh- khô): là những phễu lọc xốp có đường

kính khác nhau (tùy vào lượng cao khảo sáÐ được gắn vào hệ thống rút khí để

tạo áp suất kém thông qua một bình tam giác cổ ngang, nạp từ từ silica gel

(60H loại dùng cho sắc ký lớp mống, Merck) vào cột, ép nhẹ đều tay lớp

silica gel này, đưới sự trợ giúp của máy hút chân không để cho cột chặt đều

Khi chiều cao lớp siica gel trong cột đạt 4,5-5cm thi tiến hành bảo hòa cột:

bằng cách cho dung môi kém phân cực nhất trong số các hệ dung môi sắp

dùng để giải ly (dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để lựa chọn hệ dung môi

này), đi qua cột đến khi nào lớp silica gel trong cột trở thành một khối đồng

nhất và khi rút khô dung môi mà lớp silica gel này không đứt gãy Sau đó, các

mẫu cao được nạp lên đầu cột và tiến hành giải ly

Kỹ thuật sắc ký nhanh cột khô nói trên được sử dụng nhiều lấn để

trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ

Ngoài ra, còn dùng một số thiết bị kỹ thuật khác đã được nếu trong phần nghiên cứu và kết quả

Trang 65

-4.1 TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ

Nam Linh chi, Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr) Karst dude định

danh bởi Thầy Lê Duy Thắng thuộc bộ môn Vì sinh, Khoa Sinh của trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh

Sau khi loại bó những phần sâu bệnh, nấm Linh chỉ được rửa sạch,

sấy khô ở 1I0°C đến khối lượng không đổi, cắt nhỏ xay nhuyễn thu được bột

cây khô 997g, Cân khối lượng trước và sau khi sấy để suy ra độ Ẩm trung

bình Độ ẩm trung bình: 0,3%

$« Cô lập hợp chất GANO.E

Tw cao eter ddu héa A trong so dé 1 (0,4 g), tiến hành sắc ký điều chế, giải ly bằng dung môi cloroform, kết tỉnh sản phẩm trong acetat ety! thu

được tỉnh thể hình kim màu trắng, sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất mầu

nâu, đặt tên là GANO,E

s% Cô lập hợp chất GANO.E1

Từ cao eter dầu hỏa B trong sơ đồ 1 (3,5 g), tiến hành sắc ký cột trên silica gel, giải ly bằng đụng môi eter dầu héa 100% đến metanol thu được các

phân đoạn trình bày trong bảng 4

Cao ở phân đoạn A¡ của bang 4, tiến hành sắc ký điều chế, giải ly

bằng hệ dụng môi eter đầu hỏa: benzen (6:4), thu được chất mầu trắng ở dạng

sáp, sắc ký lớp mông cho một vết duy nhất mầu cam, đặt tên là GANO,EI,

+ Cô lập hợp chất GANG.E2

Cao ở phân đoạn Bị của bảng 4á, tiến hành sắc ký điều chế, giải ly bằng dung môi eter đầu hỏa: benzen (6:4) thu được một hợp chất không màu

+» Cô lập hợp chất GANO.CI1

TỪ cao cloroform Á trong sơ đổ 1 (2,2g), tiến hành sắc ký cột trên silica gel, giải ly bằng dụng môi eter đầu hỏa 100% đến metanol thu được các phân đoạn trình bày trong bảng 5

Cao ở phân đoạn A; của báng 5, tiến hành sắc ký điều chế, giải ly

bằng dung môi benzen: cloroform (1:1) thu được một hợp chất không mầu

dang dau, sắc ký lớp mồng cho một vết tròn mầu xám, đặt tên là GANO.CI

+ Cô lập hợp chất GANO.C2

Từ cao cloroform B trong sơ để 1 (6,6 g), tiến hành sắc ký cột trên

silica gel, giải ly bằng dung môi benzen 100% đến metanol thu được các phân

đoạn trình bây trong bang 6

Cao ở phân đoạn A; của bằng 6, tiến hành sắc ký điều chế, giải ly bằng

dung môi cloroform: acetat etyl (9:1) thu được một hợp chất không màu dang

dầu, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn màu đó, đặt tên là GANO.C2

& Cé lap hop chat GANO.C3

Cao ở phân đoạn Bị của bắng 6, tiến hành sắc ký cột silica gel nhiều lần, sau cùng là sắc ký điều chế, giải ly bằng hệ dung môi cloroform: acetat etyl (1:1), thu được chất không mau 6 dang đầu, sắc ký lớp mồng cho một vết duy nhất màu đỏ, đặt tên là GANO.C3

+ Cô lập hợp chất GANO.C4

Cao ở phân đoạn C¡ của bằng 6, tiến hành sắc ký điều chế, giải ly bằng

dụng môi cloroform: meftanol (9:1) thu được một hợp chất không mầu dạng

dâu, sắc ký lớp mông cho một vết tròn màu đỏ, đặt tên là GANO,CA

Trang 67

-4.2 THU NGHIEM HOAT TINH SINH HỌC

4.2.1 Vật liệu

Nam Linh chi (Ganoderma tucidum) được nuôi trồng ở trại của thây Lê

Duy Thắng, huyện Bình Chánh, TP Hồ Chí Minh

Artemia sử dụng trứng Artemia ở dang nang cia Thai Lan san xuất

Trứng có thông số chất lượng sau:

Kích thước trứng: 23QuH~m, số lượng trứng: 360.000 nang bào xác/gam, tý lệ

trứng: 80- 85%, độ Ẩm: 5- 7%,

Điều kiện thích hợp để trứng nở: độ mặn: 30- 35%o, độ pH: §,0- 8,5, nhiệt độ:

28- 30C Thời gian để trứng nở: 24 giờ

sục khí liên tạc trong suốt thời gian ương trứng

Đồng tế bào ứng thư biểu bì HEp-2 và ang thư cơ RD

Sử dụng hai dòng tế bào ung thư người do viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cung cấp tháng 1 năm 2001 được bảo quần và nuôi cấy lại phòng thí

nghiệm Công nghệ sinh học phân tử C, khoa Sinh, Đại học Khoa học Tự

nhiên TP Hồ Chí Minh

Dong té bao ung thu biéu bi HEp-2 (Human Epidermoid carcinoma)

Ký hiệu đồng tế bào này là: ATCC CCL HEp-2

Dong té bao ung thy biéu bi HEp-2 do Moore, Sabachewsky va Toolan

thiết lập năm 1952 từ những khối u tạo ra ở chuột vừa đứt sữa sau khi được

tiêm mô ung thư biển bì thanh quần của một người đần ông người Cap-ca

(Caucasian) 56 tuổi Tế bào HEp-2 nhạy cấm với edenovirus 3, polyovirusl,

herpes simplex Có thể tiến hành nuôi cấy liên tục hoặc nuôi cấy đơn lớp tế

bào trong môi trường E'MEM (Eagle°s Minimum Essential Medium) có bể

sung 10% FBS 6 điều kiện 37,5°C, 5% COa

Đàng tế bào ung thư cơ RD (Rhabdomyosarcoma)

Ký hiệu dòng tế bào này: ATCC CCL 136 RD

Dong té bao ung thy RD do Mc Allister thiét lap năm 1968 từ khối u cơ Ở

vùng chậu của một bé gái 7 tuổi người Cap-ca (Caucasian) Các tế bào RD có

chứa rayoglobin và có các hoạt tính myosin ATPase Tế bào nhạy cảm với các

loai virus nhu: polHovirus 1, coxsackie A, enterovirus, herpes sunpÌex người

ta có thể nuôi cấy liên tục hoặc nuôi cấy tạo lớp đơn trong môi trường

E'MEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FPS-Fetal Bovine Serum),

aminoacid, vitamin 6 diéu kién 37,5°C, 5% CO)

4.2.2 Dung cu-thiét bi-héa chất

Dụng cụ: Đĩa nuôi 96 giếng, bình Roux, becher, erlen, eppendorf,

micropipette, dau tip cdc loai, pipette Iml, xilanh Iml, mang loc v6 tring,

buồng đếm hồng cầu, lamelle

Thiết bị: Máy cô quay, bếp đun cách thủy, tủ cấy vô trùng, cân phân tích,

máy đo CD, kính hiển soi ngược, kính hiển vi quang học, kính lúp, tủ ấm, tủ

CO,, tủ lạnh , tủ lạnh sầu, bình nitợ lỏng

Hóa chất:

Dung dich dém PBS: NaCl (Sg), KC! (0,125g), Na,HPO,.12H,O (1,803)

KH;PO¿ (0,125g), Pen-Strep 200X (800H)), Amphoteriecin B (100HÌ), nước cất

(500ml)

Trypsin/EDTA: trypsin 0,25% (25lu), EDTA 1% (S00u), PBS (24ml)

Môi trường E`MEM: bột E’MEM (4,72g), L-glutamine 200mM (5m),

NaHCO,

Trang 69

Hinh 8: Artemia (Brine shrimp)

Hình 9: Tế bào ung thư Hep-2

Hình 16: Tế bào ung thư RD

7,5% (T5mÙ, HEPES 1M (10ml), Amphotericin B 0,1% (1i25pD, Penicillin- Streptomicin 200X (2,5ml), huyét thanh (40ml), phenol đó 0,4% (1ml), nước

cất (500ml), pH 7,2

MTT 0,5 mg/ml: MTT (Smg), méi trudng BE’ MEM (10ml)

Dung dich NaCl 3%, DMSO

4.2.3 Tiến hành

e Nấm Linh chỉ (10 gam) xay nhuyễn, nấu với 600ml nước cất, đun sôi trong

20 phút Lọc lấy nước, thêm 600ml nước vào phân bã đun tiếp 20 phút

Trích thêm lần nữa Gom dịch chiết lại cô cạn Hoà tan cao trổ lại vào

nước, ở các nông độ 25; 30; 35; 40 ug/ml và sử dụng các dụng dịch này để

thử nghiệm hoại tính Brine shrirop Và pha ở các nỗng độ 100; 10; 1; 0,1;

0,01 ug/ml để thử nghiệm trên hai dòng tế bao ung thu

Xác định độc tính trén Artemia:

Cho trứng Arremia vào dung địch NaCl 3%, sục khí trong vòng 24 giờ Ở nhiệt độ phòng

Cho vào mỗi giếng 15-30 Arfemia sống, bổ sung dịch trích nấm Linh chỉ vio cdc giéng sao cho dat néng dé 25yg/ml, 30 ug/ml, 35 pg/ml, 40 pg/ml

và tổng thể tích trong mỗi giếng là 20001

Thực hiện giếng đối chứng không có hoạt chất,

A xy

Đếm số lượng Arremia chết trong mỗi giếng ở mỗi nông độ bằng kính lip

Xác định độc tính trên trên tế bào ung thư im vitro: phương pháp MTT @ -{4,5-

dimethyHhiazol-2-yl] -2,5 diphenyl! tetrazolium bromide)

© Hai dòng tế bào HEp-2 và RD được nuôi cấy trong bình Roux cho đến khi

đạt được mật độ cần thiết khoảng 4.106 tế bào/mi

Trang 71

-Bỏ môi trường cũ, rửa tế bào trong bình Roux 2 lần bằng dung dịch đệm

PBS

Tách tế bào bằng dung dịch tryspin/EDTA và pha loãng tế bào trong môi

trường nuôi cấy sao cho đạt mật độ sau cùng 100 000 tế bao/ml

Cho vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 100H1 dịch huyển phù tế bào trên (tương đương 10.000 tế bào/giếng)

Ủ tế bào ở 37,5°C, 5% CO; trong 24 giờ

Sau 24 giờ môi trường nuôi cấy được thay bằng môi trường có chứa cao

chiết Linh chi theo các nồng độ sau: 100 ug/ml; 10 pg/ml; 1 pg/ml; 0,1 ug/ml; 0,01 ug/ml

Lô đối chứng T không có hoạt chất

Lô đối chứng To để xác định lugng tinh thé formazan được tao thanh tai

thời điểm thay môi trường trong giếng nuôi bằng môi trường có chứa hoạt

chất MTT

Toàn bộ các lô được đem ủ ở 37,5°C, 5% CO;

Sau 4 giờ ú đáy của mỗi giếng của lô đối chứng To đã xuất hiện các tỉnh

thể formazan màu tím Nhẹ nhàng rút bỏ môi trường trong các giếng này

và bổ sung 100ul dung dịch isopropanol: HCI (1:1) để hòa tan các tỉnh thể

formazan Ðo ODz;e của dung dịch này

Sau 72 giờ ủ, xác định lượng tỉnh thể formazan được tạo thành ở mỗi giếng

và lô đối chứng T bằng cách: môi trường cũ có chứa hoạt chất được thay thế môi trường có chứa 0,5mg/ml MTT ủ ở 37,5°C, 5% CO; trong 4 giờ

Sau 4 giờ, môi trường cũ được rút ra nhẹ nhàng, thay thế bằng 100ul

Khi thử nghiệm ODa;o > ODa¡o đối chứng To:

Tỷ lệ phát triển tế bào khi giá trị QDas thí nghiệm lớn hơn giá tri OD 579

đối chứng To Lượng tế bào sau thời gian ủ với hoạt chất lớn hơn lượng tế

bào ban đầu cho thấy tế bào ung thư vẫn gia tăng số lượng đù bị hoạt chất

tác động

Khi thử nghiém ODs52) < OD¿;e đối chứng To:

Tỷ lệ phát triển tế bào khi giá trị ODa;a thí nghiệm nhỏ hơn giá trị ODs;o

đối chứng To Lượng tế bào sau thời gian ủ với hoạt chất nhỏ hơn lượng tế bào ban đầu cho thấy tế bào ung thư bị tiêu diệt bởi hoạt chất,

Trang 73