P2 thực nghiệm thành phần hóa học của cây tô mộc

P2 thực nghiệm thành phần hóa học của cây tô mộc

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

=——_————ễễ

Luan dn Thạc sĩ Khoa học Hóa học

4.1 HOÁ CHẤT NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG

NGHIÊN CỨU

4.1.1 NGUYEN LIEU

Mẫu cây Tô Mộc được thu hái tại ấp Lạc Sơn xã Quang Trung huyện Thống

Nhất, tỉnh Đồng Nai vào khoảng tháng 9 năm 1998 và các tháng 2, 3, 4, 5, 6, năm

1999 Nhận danh cây có tên khoa học là Caesalpinia Sappan Linn bGi PGS Lé Công Kiệt, Bộ môn Thực Vật, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố

Hồ Chí Minh

4.1.2 HOÁ CHẤT

— Eter đầu hoả (60 - 90°C) chưng cất lấy phân đoạn sôi ở 60-90°C làm khan bằng Na

— Đietileter làm khan vdi CaCl chung cat lấy phân đoạn sôi ở 34,5°C,

Na›SÒx„ khan

— Metanol :chưng cất lấy phân đoạn sôi ở 65°C làm khan bing Na.SO,

Acetat etil :chung cất lấy phân đoạn sôi ở 75°C làm khan bằng Na;SOk,

— Benzen : làm khan sơ bộ bằng CaCh;, chưng cất lấy phân phân đoạn sôi ở

80 -81°C làm khan lại bằng Na

~ Cloroform :lấc với nước cất (d lệ 2 CHCH : ! HO) nhiều lần, lóng lấy

phần CHCI:, làm khan bằng CaCl; chưng cất lấy phân đoạn sôi ở 61°C, đựng dụng môi trong bình màu nâu để trong tối

— Etanol : chưng cất lấy phân đoạn sôi 6 78°C

~ Celite 545 (Acid silicic) MERCK

— Silicagel sử dung cho cét sic ky : silicagel GO MERCK, cé hat 0,063 - 0,100 mm

Luan án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

~ Sắc kí lớp mỏng : bản mồng silicagel loai 25 DC — Plastikfolien 20x 20

cm, Kieselgel 60 F254 Merck

— Sắc ký bản đầy loại Art 5715, DC - Fertigplatten, Reselgel 60 F254

Schichtdicke 0,25 mm Merck,

~ Ống chuẩn HCI 0,1N

4.1.3 THIẾT BỊ

— Cân điện tử METTLER TOLEDO AB 204

~ Bộ chưng cất tĩnh đầu CLEVENGER

— Lò vi sóng gia dung TOSHIBA ER -— 657 VL cái tiến,

~ Máy cô quay đuổi dung môi HEIDOLPH WB 2000

—~ Máy khuấy từ IKAMAXRET

— Khúc xạ kế WYA - § Abbe Refractometer,

— Triền quang kế WZZ.~ 2 Automatic Polarimeter

— Bộ soxhlet có dung tích 2 lit

— Cột sắc ký có kích thước 2,5 x 50 cm

—~ Máy đo nhiệt độ nóng chấy ELECTROTHERMAL 9100 Digial và khối Maquenne

- Máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC ~ MS) HBWLETTPACKARD 6890

Series H

~ Phổ hồng ngoại IR ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BRUKER-IFS 48

va EQUINOX 55

~ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-RMN ghi trên máy cộng hướng từ hạt nhân BRUKER AC.200, tần số cộng hướng 200MH¿

PHẦN THỰC NGHỆM Trang 69

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

— Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ÚC kết hợp kỹ thuật DEPT trên máy cộng

hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.200, tần số cộng hướng 5OMH¿ của Trung Tam Dich Vu Phan Tich và Thí Nghiệm Tp.HCM

— Phổ EI-MS ghi trên máy HP-5989 - MS của Viện Hóa Học Hà Nội,

— Phố tử ngoại được ghi trên máy UV LS 28 USA của Khoa Hóa Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh,

— Đo khối phổ bằng máy sắc ký lồng cao áp ghép khối phổ LC/MS”: LCQ -

FINNGAN - THERMOQUEST,

— Phân tích hầm lượng các nguyên tố bằng quang phố phát xạ nguyên tứ, máy DX8 phòng phân tích quang phổ thuộc Liên Đoàn Địa Chất Việt Nam,

4.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ CẤU TỬ

HỮU CƠ TRONG GỖ TÔ MỘC

4.3.1 ĐIỀU CHẾ CAO METANOL

Gỗ tươi đem về đếo bổ phần vỏ, cưa thành khúc chế nhỏ và đem phơi

nắng, sau đó sấy khô (60 — 90°C) đến khi khối lượng không đổi, xay nhuyễn

thành bội,

Bột gỗ khô (75g) được tận trích với dung môi metanol (2 lQ trong soxhiet, Lọc, cô cạn dung môi ở 45°C thu được cao metanol (10,058)

4.2.2, ĐỊNH TÍNH /30J/37)/381/39/140)

4.2.2, STEROL

$ Điều chế dung dịch thử

- Hòa tan bột gỗ khô (1g) trong claroform (50 mì), lọc

- Hòa tan mẫu cao (0,1 g) trong cloroform (30 mì), lọc

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

% Thuấc thử LIEBERMANN ~ BURCHARD

Anhidrid acetic (20 ml); H, SỐ¿ đậm đặc (1 mÙ,

Phản ứng đương tính khi xuất hiện mầu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ,

s* Thuốc thử SAI,KOWSKI

Hạ SỐ¿ đậm đặc

Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ

4.2.2.2 TANEN

$% Điều chế dung dịch thứ

- Nấu mẫu gỗ khô (5g) với nước cất (100 m]) trong 30 phút để nguội, lọc

- Nấu mẫu cao (1g) với nước cất (100 ml) trong 30 phút để nguội, lọc

** Phản ứng STKASNY

- Formol 36% (20 ml); HCI đậm đặc (10 mỊ),

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện mầu đỏ

% Thuốc khử GELATTIN mặn

- Gelatin (22); dung dich bao hia NaCl (100 mlb)

Phản ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu vàng nhạt để lâu hóa nâu

+ Đung địch FeCh 13⁄4 trong nước

Phần ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang mầu xanh với 2 giọt FeCh 1% trong nước,

4.2.2.3 FLAVON

s* Điều chế dung dịch thứ

- Nấu bột gỗ khô (5g) với nước cất (100 m) trong 30 phút để nguội, lọc

- Nấu mẫu cao (1g) với nước cất (100 ml) trong 30 phút để nguội, lọc

+ Phần ứng SHIBATA

- Ống nghiệm 1 làm đối chứng: 2 mi dung dịch thứ

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

- Ống nghiệm 2: 2 mì dung dich thứ, thêm HCI đậm đặc (3 ml) và bột Mg

kim loại (0,1g), để yên đến lúc hết súi bọt khí, thêm từ từ alcol iso-amil theo

thành ống nghiệm, đun nóng nhẹ,

Phần ứng đương tính khi xuất hiện một vòng màu hồng chuyển sang đó tím, 4.2.2.4, ALKALOID

% Dieu ch€ dung dich thd

- Hòa tan bột gỗ khô (5ø) trong dung dịch HƠI 1%, đun nhẹ 6 80°C trong 1

giờ, để nguội, lọc,

- Hòa tan mẫu cao (1g) trong dung dịch HƠI 1%, đun nhẹ ở 80°C trong 1 gid, dé ngudi, loc

** Thuốc thử BOUCHADAT

~ b (2,58); KI (5g); nước cất (100 mỹ),

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện mầu nâu,

$ Thuốc thử MAYER

- HegCh (6,8g); KI (2,5g); nude cit (100 ml)

Phân ứng đương tính khi xuất hiện trầm hiện mầu nâu

4.2.2.5 GLICOSID

+ Điều chế dung dịch thử

Lấy mẫu gỗ khô (10g) trích với ctanol 60% (50 ml) trong 24 giờ, lọc, chế

hóa dịch lọc với dung dịch acetat chì 20% (50 mÙ, lọc, chế hóa dich loc dung dich Na,SQ, bão hòa (30 ml), lọc, cô cạn dung địch ở 40°C, thu được cặn, Hòa tan cặn này trong etanol 95% và lọc, lấy dịch lọc này để thứ

% Thuốc thứ TOLLEN

- AgNO, 0,05N (10 mb; NaOH 6N (igiot); thém dung dich amoniac vừa đủ

để trầm hiện tan,

Phan ứng dương tính khi xuất hiện lớp tráng bạc,

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

“®===—ễễễ

*%* Thuốc thử MOLISH Thimol xanh 2% (1 ~ 2 glọt); H;SO¿ đậm đặc (1 m)),

Phản ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu đỏ

4.2.2.6 SAPONIN

ĐÐun sôi lg bột gỗ khô trong 100 ml nước cất trong 30 phút Lọc, để nguội, thêm nước cất vào cho đủ 100 ml Lay 10 ống nghiệm có chiều cao 15 cm, đường kính 15 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3 10 mi nước sắc Tô Mộc, thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10 ml Lắc mỗi ống theo chiều dọc của ống trong 20 giây Để yên 15 phút rồi đo chiều cao các cột bọt

Nếu chiều cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm dưới 1 cm, chỉ số bọt dưới 100 thì ta kết luận không có saponin

CSB = 10x £

c

CSB : chi s6 bot

d :chiều cao cột bọt (cm)

c : lượng mẫu trong ống nghiệm (g)

4.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO METANOL CỦA GỖ TÔ MỘC

4.3.1 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH HỢP CHẤT A;

4.3.1.1 ĐIỀU CHẾ CAO METANOL

Tận trích bột gỗ khô cây Tô Mộc (75g) với metanol (1,5 lit) tong dung cu soxhlet đến khi dịch trích không màu và thứ dịch trích không còn vết trên mặt kính đồng hồ Thu hồi dung môi ở 45°C dưới áp suất kém, thu được cao metanol I

(10,05g)

a

PHAN THUC NGHEM Trang 73

Luan dn Thac si Khoa học Hóa học

Để loại bớt nhựa, chúng tôi tiếp tục hòa tan cao metanol vào 1 lượng metanol vừa đủ tan và đem ngâm lạnh trong 24 giờ Lọc, loại bó nhựa đen, cô cạn dung môi ở 45°C thu được cao metanol H (9,3g) Qui trình này được trình bày trong sơ đồ 7,

Để loại nhựa hoàn toàn, chúng tôi lại tiếp tục cho cao metanol Il (5g) qua cột sắc kí với chất hap phy celite (35g), đụng môi giải ly là acetal eHl Cô cạn dung môi dưới áp suất kém ở 45°C thu được cao acetat cdil (3,4g)

4.3.1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT TRÊN CAO METANOI,

Hoa tan cao acetat etil viva thu dude (3,4g) trong etyl acetat vừa đủ lan rồi

cho vào cội silicagel (55g) Tiến trình sắc kí cột silicagel giải ly với hệ dung môi

benzcn, acetat cũi, metanol, nước khoảng 1 gioUgiây, hứng mỗi phân đoạn 50ml,

cột sắc ký có kích thước 2,5 x 50 cm, các chất hấp phụ đều đã được hoạt hóa ở

120°C

4.3.1.3 PHUONG PHAP SAC KY LGP MONG SILICAGEL

~ Dong ban méng có kích thước 20x 100 mm va 40100 mm

~ Hé dung méi gidi ly :cloroform:metanol: acid acetic (7:1:0,5) hodc hoi iod bão hòa,

— Hòa tan cặn từng phân đoạn trong dung môi metanol, Chấm dung dich trên

bản mồng rồi sấy bản mỏng ở 100°C Nhúng bản mỏng trong dụng môi giải ly Khi mức dung môi cách mép bán ! cm, lấy bản ra và sấy bản ở 100°C,

— Phun thuốc thử hiện vết

4.3.1 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH HỢP CHAT A,

— _ Sử dụng phân đoạn 10 của bảng 3.6 trong hệ dung ly benzen: AcOEt

(4:6) để 1y trích hợp chất A;

PHẦN THỰC NGHỆM Trang 74

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

—==—- — _ễễ==eễ=

— Phương pháp sử dụng là sắc ký bản dày silicagel kích thước 20x20cm

—_ Hệ dung môi giải ly: cloroform: metanol: acid acetic (7:1,5:0,5)

—_ Bản dày silicagel được hoạt hóa ở 120°C

— _ Bột rắn màu cam thu được của phân đoạn 10 đem hòa tan vào 1 lượng metanol vừa đủ tan

Mỗi 1 bản dày sử dụng 20mg chất Sau đó, chấm dung dịch chất lên bản dày, rồi để khô dung môi Nhúng bản dày vào bình dung môi giải ly đã

được bão hòa dung môi Khi mức dung môi cách mép ban | cm, lay ban ra va

để khô tự nhiên

— Ta tiến hành cạo từng vệt chất đã được tách rời ra với các màu sắc khác

nhau

— Rửa giải bằng metanol, lọc, cô cạn dung môi ở 45°C dưới áp suất kém

— _ Kiểm tra từng chất thu được bằng sắc ký lớp mỏng silicagel

— _ Hợp chất A; thu được ở vệt màu vàng nhạt, khi sắc ký lớp mỏng cho vệt tròn màu xanh, thuốc thử hiện vết là FeCl; 1% trong etanol 95%

4.4 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH TINH DẦU TÔ MỘC

4.4.1 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DẦU BÉO TỪ GỖ TÔ MỘC

— Tận trích bột gỗ cây Tô Mộc (75g) trong eter đầu hỏa (60°C - 90°C) (1,50

lit) trong soxhlet dén khi dịch trích không màu và không con vết trên mặt kính

đồng hồ

~ Thu hồi dung môi ở 40°C dưới áp suất kém, thu được cao eter dau thé mau

vàng đậm (1,88)

— Cho cao eter đầu thô (1,8g) vào cột sắc ký silicagel sử dụng eter dầu (60°C

- 90°C) để rửa giải, sau đó toàn bộ dung môi qua cột được cô cạn ở 40°C dưới

áp suất kém cho đầu béo màu vàng nhạt (1,2g)

—————— ——-

PHẦN THỰC NGHỆM Trang 75

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

““======—— —————

Qui trình này được trình bày trong sơ đồ 3.7, 3.8

4.4.2.PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH TINH DẦU TÔ MỘC

4.4.2.1 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC CỔ ĐIỂN

— Cho 300g nguyên liệu và 1200 ml nước vào bình cầu 2000 ml

— Ráp hệ thống (phụ lục 14)

— _ Tiến hành cất kéo tinh dau trong khoảng thời gian từ 3 - 8 gid

— Để nguội, trích lại tỉnh dầu bing dietil eter

— Làm khan bằng Na;SO¿ khan

— Lọc, thu hồi dung môi dưới áp suất kém

— Cân xác định lượng tinh đầu ly trích được

4.4.2.2 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC CÓ SỰ HỖ TRỢ

CỦA VI SÓNG

— Cho 50g nguyên liệu và 200 mÌ] nước vào bình cầu 1000 ml

Ráp hệ thống (phụ lục 15)

— Chiếu xạ mẫu ở công suất 600W trong khoảng 6-16 phút

— ĐỂ nguội và tiếp tục làm các bước như phương pháp cổ điển

4.4.2.3 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC CÓ CHIẾU XẠ

VI SÓNG KHÔNG THÊM NƯỚC VÀO NGUYÊN LIỆU

- _ Cho 50 g nguyên liệu vào bình cầu 1000m1

- Ráp hệ thống (phụ lục 16)

Chiếu xạ mẫu ở công suất 600W trong khoảng 4,5 - 6,5 phút

- _ Để nguội và tiếp tục làm các bước như phương pháp cổ điển

4.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ SỐ VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC

Xác định các chỉ số vật lý và hóa học trên tinh đầu lá Tô Mộc được ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển với thời gian chưng cất 6 gid

PHAN THUC NGHEM Trang 76

Luận án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

4.5.1 CHỈ SỐ VẬT LÝ

Tiến hành xác định tỉ trọng, độ quay cực và chỉ số khúc xạ của tinh dau lá Tô

Mộc tại bộ môn Hóa Hữu Cơ, Khoa Hóa Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 4.5.1.1 Tl TRONG

Cho khoảng 5,0 mi nước cat hai fin vio binh do tong dén khi day bình,

cần trên cân phân tích xác định khối lượng nước và bình (maun„sve) ĐỂ bình khô

hoàn toàn ,làm tương tự cho tính đầu, xác định khối lượng tinh dau va binh

(munn+rp) Mỗi thí nghiệm làm 3 lần, tính giá trị trung bình: 2s, 9arasr

TÍ trọng của tinh dau 6 29°C dudc tính theo công thức :

de = Mbiaht+TD — Wbinh

20 7 ee

Mbinh+auéc — M bian

kết quả trung bình (2?) ghi trong phần nghiên cứu,

4.5.1.2 BO QUAY CUC

Cho 10ml tỉnh đầu vào ống đo độ triền quang dài 1 dm, thực hiện việc đo khả năng lầm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực trên triền quang kế WZZ-2

AUTOMATIC POLARIMETER Thực hiện phép đo 3 lần ở 30°C va tinh két qua trung bình,

4.5.1.3 CHỈ SỐ KHÚC XẠ

Mỗi lần đo, nhỏ vài giọt tĩnh đầu lên lãng kính của máy khúc xạ kế

WYA-S Abbe Refractometer, chỉnh máy Ghi nhận nhiệt độ và chỉ số khúc xạ

N

của tỉnh đầu Thực hiện phép đo 3 lần và tính kết quả trung bình

4.52 CHÍ SỐ HOÁ HỌC

PHẦN THỰC NGHỆM Trang 77