Thực nghiệm thành phần hóa học của cây thất lá mách , họ cúc

Thực nghiệm thành phần hóa học của cây thất lá mách , họ cúc

Luận án thạc sĩ Hóa Học Phan thực nghiệm

Trước khi khảo sát định tính và trích ly cô lập các hợp chất trong cây Kim

Thất Lá Tô Mách, chúng tôi chuẩn bị các phương tiện hóa chất và kỹ thuật sau:

s Tỉnh chế dung môi và chuẩn bị các thuốc thử

- Dung môi: eter dầu hỏa, benzen, cloroform, etil acetat, aceton, metanol đều được làm khan bằng Na;SO¿

- Thuốc thử: để hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng, phun xịt bằng acid

sulfuric đậm đặc và dùng hơi iod Ngoài ra, các thuốc thử phục vụ cho phần khảo sát định tính, sẽ được mô tả cụ thể trong từng phản ứng định tính ở phần sau

s* Thiết bị chính và kỹ thuật tiến hành:

Cột sắc ký (silica gel nhanh - khô): là những phễu lọc xốp có đường kính

khác nhau (tùy thuộc vào lượng cao sắp khảo sát) được gắn vào hệ thống rút khí

để tạo áp suất kém thông qua một bình tam giác có cổ ngang, nạp từ từ silica gel

(60H loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, Merck) vào cột, ép nhẹ đều tay lớp silica gel này, dưới sự trợ giúp của máy hút chân không để cho cột chặt đều Khi chiểu cao lớp silica gel trong cột đạt khoảng 4,5 - 5cm thì tiến hành bão hòa cột, bằng

cách, cho dung môi kém phân cực nhất trong số các hệ dung môi sắp dùng để

giải ly (dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để lựa chọn các hệ dung môi này), đi qua cột đến khi nào lớp silica gel trong cột trở thành một khối đồng nhất và khi rút khô dung môi mà lớp silica gel này không bị nứt gãy Sau đó, các mẫu cao sẽ được nạp lên đầu cột và tiến hành giải ly

Kỹ thuật sắc ký cột nhanh - khô nói trên, được sử dụng nhiều lần để trích

ly, cô lập các hợp chất hữu cơ

Ngoài ra, chúng tôi còn dùng một số thiết bị kỹ thuật khác đã được nêu trong phân nghiên cứu và kết quả

49

3.1 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ

Như đã được nêu ở phần nghiên cứu và kết quả: trong cây cỏ nói chung,

thường có chứa các hợp chất hữu cơ như: sterol, triterpen, alcaloid, flavon, tanin,

ølycosid, saponin , và để định tính các loại hợp chất hữu cơ này chúng tôi dựa vào những phản ứng hóa học đặc trưng cho từng loại hợp chất ở khả năng tạo màu hoặc tạo kết tủa với các thuốc thử

3.1.1 Điều chế các loại cao

Từ 1100 g bột nguyên liệu khô ngâm trích trong etanol, lọc, cô quay thu hồi dung môi, thu được 80,4 g cao etanol

Trích pha rắn silica gel trên cao etanol bằng cách nạp cột (sắc ký cột khô

nhanh), giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, cloroform, metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, các lọ cho sắc ký lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn Thu hồi dung môi, thu được các loại cao: cao eter dầu hỏa E1(2,1 g), cao eter dầu hỏa E2 (5,1 ø), cao cloroform ( 9,0 g) va cao metanol (50 g)

3.1.2 Dinh tinh sterol và triterpen: bằng phản ứng với các thuốc thử

Liebermann Burchard, Salkowski va Noller

e Tạo mẫu thử: Lấy 0,1 gam mẫu mỗi loại cao hòa tan trong 20 ml dung môi cloroform, sau 1 giờ lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thư

e Thuốc thử Liebermann Burchard: Anhidrid acetic (20 ml), acid sulfuric dim đặc (1 mì)

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từ từ thuốc thử vào, nhận thấy hỗn hợp chuyển sang màu lục đậm, hồng, cam hoặc đỏ bền trong một thời gian chứng tổ có sterol

50

Luận án thạc sĩ Hóa Học Phân thực nghiệm

© Thuốc thử Salkowski: Anhidrid acetic đậm đặc

Tiến hành cách thử như trên, nhận thấy xuất hiện màu nâu đất hay màu xanh chuyển dẫn sang nâu chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử Noller: Clorur tionil (1 ml), Sn (0,5 g)

Cũng tiến hành cách thử như trên, nhận thấy xuất hiện màu đỏ thẫm chứng

tỏ trắc nghiệm dương tính

3.1.3 Định tính flavonoid: bằng phản ứng Shibata (phẩn ứng Cianidin), phản ứng

với H;SO¿ đậm đặc

e Tao mẫu thử: Lấy 0,5 gam cao mỗi loại, cho 20 ml nước vào một becher, đun cách thủy trong 5 phút, để nguội, lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thử

se Thực hiện phản ứng Shibata (hay con gọi là phản ứng Cianidin) với thuốc thử gồm HCI đậm đặc, bột Mg kim loại và alcol isoamil

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm 5 giọt dung dịch HCI đậm

đặc và 3 đến 5 hạt Mg kim loại (khoảng 0,1 g), để yên cho đến khi dung dịch hết

sui bot Dun néng va nhỏ từ từ alcol isoamil dọc theo thành ống nghiệm, sẽ thấy xuất hiện một vòng tròn trên bể mặt dung dịch, lúc đầu màu hồng nhạt từ từ đổi màu đỏ tím, chứng tỏ có sự hiện dién cua flavonoid

e Thực hiện phản ứng thử với H;SO¿ đậm đặc

- Cho 2 mi mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt H;SO¿ đậm đặc Hỗn hợp từ vàng đậm đổi sang da cam chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid 3.1.4 Định tính tanin: bằng các thuốc thử cho phản ứng màu và trầm hiện như: Stiasny, acetat chi hodc FeCl; 1%

e Tạo mẫu thử: Lấy 0,5 gam cao mỗi loại, đun với 30ml nước trong thời gian khoảng 5 phút Lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thử

51

e Thuốc thử Stiasny: 20 ml dung dịch formol 36%, 10m1 HCI đậm đặc

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 mi mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm 1ml thuốc thử, đun nóng,

thấy xuất hiện khối vô định hình màu nâu xám chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử acetat chì: Dung dịch acetat chì bão hòa trong nước

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt acetat chì, nhận

thấy xuất hiện trầm hiện vàng nâu dạng bột chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử FeCl; 1%:

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt FeC]; 1%, nhận

thấy dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu xanh đen hoặc xanh lục chứng

tỏ trắc nghiệm dương tính

3.1.5 Dinh tinh glycosid

- Phần đường của glycosid được định tính dựa vào thuốc thử Tollens

- Phần aglicol được định tính dựa vào các thuốc thử Baljet và Molish

e Tạo mẫu thử: có hai cách để tạo mẫu thử

- Đối với cao eter dầu hỏa: ngâm cao với alcol etil, lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử

- Đối với mẫu cây khô: cân 10 gam bột khô, tận trích bang alcol etil Loc lấy

dịch trích và thêm vào đó dung dịch acetat chì 10%, lắc đều, để yên Sau đó,

thêm dung dich Na,SO, vao để loại trừ lượng chì thừa Lọc trầm hiện PbSO,, lay

dịch lọc này hòa thêm alcol etil 95% và lọc lại để lấy phần dịch làm mẫu thử (Qui trình thực hiện được trình bày trong sơ đồ 2 - sơ đồ SOOS)

52

Luận án thạc sĩ Hóa Học Phân thực nghiệm

Sơ đồ 2: Qui trình điều chế cao aleol để định tính

glicosid theo phương pháp SOOS (có sửa đổi)

Nguyên liệu

-Ngâm, tận trích bằng etanol

- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

- Chế hóa với dung dịch

acetat chì 10%

- Lọc

\

Dich loc Tram hién

a

- Chế hóa với dung dich

Na,SO, bao hoa

- Loc

t>——————————————————]

- Cô cạn dung dịch

- Hòa tan cặn trong etanol 95%

Y Dung dich alcol

(mau thi glicosid)

53

e Thuốc thử Tollens: AgNO; trong dung dịch amoniac

- Cách pha thuốc thử Tollens: Thêm dung dich NH,OH đậm đặc vào 10ml dung

dịch AgNO; 5% đến khi có trầm hiện AgOH vừa xuất hiện bị tan Tiếp tục thêm

1 giọt NaOH 10%, nếu có trầm hiện thì thêm NH,OH cho tan trầm hiện

- Cách thử: Cho 2 ml thuốc thử vào một ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch mẫu

thử, lắc nhẹ vài giây rồi để yên, thấy có một lớp gương sáng bạc bám lên thành

ống nghiệm Nếu không thấy phản ứng ở nhiệt độ thường thì nhúng ống nghiệm

vào nước nóng Đôi khi lớp gương không hình thành được do ống nghiệm không

sạch hoặc phản ứng chưa đủ thì vẫn có bạc kim loại màu xám đen kết tủa cho thấy trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử Baljet (định tính vòng lacton 5 cạnh): Acid picrie trong alcol eul 20% (20 ml), NaOH 5% (10 ml)

- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml thuốc thử vào một ống nghiệm khác, rồi thêm 2 ml mẫu thử, đun nhẹ, hỗn hợp chuyển dân sang màu da cam, có xuất hiện một ít kết tủa chứng tỏ trắc

nghiệm dương tính

e Thuốc thử Molish: Thimol xanh 2% (1- 2 giọt), Iml H;SO¿ đậm đặc

- Cho 2 mI thuốc thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml thuốc thử vào một ống nghiệm khác, cho từ từ mẫu thử vào, hỗn hợp

từ tím hồng đổi sang màu đỏ, có kết tủa, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

3.1.6 Định tính alcaloid: dựa trên các phan ứng tạo thành trầm hiện với các thuếc thử: Bouchardat, Mayer, Hager, Dragendorff và Bertrand

Có ba phương pháp xác định sự hiện diện của alcaloid

- Phương pháp Harold - St John (1959) dùng bột cây khô

- Phương pháp Debray (1961) dùng mẫu cây tươi

- Phương pháp Scheuer ( 1962) dùng cao alcol

Luận án thạc sĩ Hóa Học Phân thực nghiệm

Ở đây chúng tôi áp dụng phương pháp Scheuer

e Tao mau thu:

Cân 2 gam mẫu thử bột cây khô, trích bằng 150ml dung môi alcol etil 95%

sau 2 giờ Lọc lấy dịch alcol, cô cạn dung môi dưới áp suất kém thu được cao

alcol, hòa tan cao này trong hỗn hợp eter etil: cloroform (1:1) và HCI 1% Lấy dịch acid này làm mẫu thử

e Thuốc thử Bouchardat: I; (2,5 g); KI (5 g); nước cat (100 ml)

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, rồi nhỏ từ từ thuốc thử vào, nhận

thấy có kết tủa nâu sậm hay vàng đậm rõ rệt ngay tức khắc, kết tủa bển, không

tan trong thuốc thử dư, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử Mayer: HgC]; (1,36 g); KI (5 g); nước cất (100 m])

- Hòa tan HgC]; trong 60 ml nước, hòa tan KI trong 40 ml nước

- Trộn đều hỗn hợp, để yên, lọc Lấy dịch lọc này làm thuốc thử

Tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy xuất hiện kết tủa màu trắng chuyển sang vàng nâu, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử Hager: Dung dịch acid picric bão hòa trong nuớc

Cũng tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy xuất hiện nhiều kết tủa vàng, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thử Dragendorff: Bi(NO¿); (8 g); HNO¿ 30% (20 — 25 ml); KI (28 g);

HCI 6N (khoảng 10 ml); NaOH 6N (5Š m]) và nước cat (100 ml),

- Hoa tan 8 g Bi(NO3), trong 20 - 25 ml dung dich HNO; 30%

- Hòa tan 28 g KI bằng Iml dung dich HCl 6N, sau đó thêm 5 ml nước cất vào

Cho từ từ dung dịch Bi(NO;); pha trong acid HNO; nói trên vào, rồi thêm nước

cất cho đủ 100 ml (dung dịch D)

55

Để tạo thuốc thử, lấy 2 ml dung địch D và thêm lần lượt 20 ml nuớc cất, 5 ml

dung dịch HCI 6N và 5ml dung dịch NaOH 6N (nếu thấy xuất hiện kết tủa thì có thể thêm vài giọt dung địch HCI 6N vào) Thuốc thử này phải được bảo quản

trong bóng tối ở 4°C

Cũng tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy xuất hiện

ngay tức khắc nhiều kết tủa màu vàng cam trong dung dịch màu đỏ gạch, chứng

tỏ trắc nghiệm dương tính

e Thuốc thw Bertrand: Acid silicotungstic (5 g); nuéc cat (100 ml)

- Cho 2 ml mau thiv vao mét 6ng nghiém ding lam 6ng chuan

- Cho 2 mÌ mẫu thử vào một ống nghiệm khác, rồi nhỏ từ từ thuốc thử vào, nhận thấy có kết tủa màu vàng, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

3.1.7 Định tính iridoid

e Tạo mẫu thử: Lấy 0,5g cao cho vào 10ml alcol etil, đun hoàn lưu, lọc Sau đó,

thêm vào dịch lọc 10 m] nước cất, 2ml dung dich acetat chi 2%, loc lai lần 2 Cho H;SO¿ vào dịch lọc lần 2 để loại bỏ chì thừa bằng kết tủa PbSO¿, lọc bỏ kết tủa

Dịch sau cùng này trong một ít alcol etil dùng làm mẫu thử

e Thuốc thử Trim Hill: CH;COOH (10 ml); CuSO, 2% (1 ml); HCI dac (0,5 ml)

Cho 2 ml mẫu thử vào ống nghiệm rồi thêm 1 - 2 giọt thuốc thử, đun nhẹ,

nhận thấy dung dịch chuyển sang xanh lục, chứng tỏ trắc nghiệm đương tính

3.1.8 Định tính saponin

Saponin là một nhóm chất glycosid có đặc tính chung là khi hòa tan vào

nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bể mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt Căn

cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện của saponin

Dược điển Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: chỉ số tạo bọt là độ pha loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao cm, sau khi lắc trong ống nghiệm

tiến hành trong điều kiện qui định

56

Luận án thạc sĩ Hóa Học Phân thực nghiệm

Ðun sôi l gam bột nguyên liệu khô trong 100 ml nước cất thời gian 30 phút Lọc, để nguội, thêm nước vào cho đủ 100 ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao

lócm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml, bịt miệng ống nghiệm

và lắc từng ống theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần Để yên 15 phút

rồi đo chiều cao các cột bọt

Nếu chiều cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm đều dưới lem, chi so bọt

dưới 100 nghĩa là không có saponin

Nếu ống nghiệm thứ n có cột bọt cao lcm thi chỉ số tạo bọt được tính như

10x]

0,0lxn

sau: chỉ số tạo bọt =

Nếu ống số 1 và ống số 2 có cột bọt cao 1 em hoặc cả 10 ống đều có cột bọt

cao hơn 1 cm thì cần pha loãng để có chỉ số chính xác

Kết quả định tính sự hiện diện một số hợp chất hữu cơ trong cây Kim Thất

Lá Tô Mách được trình bày trong bảng 3 ở phần nghiên cứu và kết quả

3.2 TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ

3.2.1 Sắc ký cột silica gel áp dụng trên cao eter dầu hỏa E1 của sơ đồ 1

Cao eter dầu hỏa EI (2,1 g) được nạp vào đầu cột silica gel Giải ly cột bằng

các hệ dung ly tăng dần tính phân cực từ eter dầu hỏa đến cloroform Dung dịch

qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50 ml, những lọ cho sắc ký lớp mỏng giống

nhau gộp chung thành | phan đoạn Kết quả sắc ký cột trình bày trong bảng 3

* Khảo sát phân đoạn E1-2 của bảng 3

Phân đoạn E1-2 (7-10) của bảng 3 có trọng lượng 103 mg, ở dạng dầu vàng

Tiến hành sắc ký điểu chế nhiều lần giải ly bằng dung môi cloroform Thu được chất 26 mg dạng dâu vàng, sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất, được đặt tên

là hợp chất LYCOEI