Thực nghiệm thành phần hóa học lá cây cốc đồng

Thực nghiệm thành phần hóa học lá cây cốc đồng

Nguyeãn Thò Thu Traâm

CHÖÔNG 4

Nguyễn Thị Thu Trâm

4.1 HÓA CHẤT – THIẾT BỊ

4.1.1 Hóa chất

¾ Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: eter

dầu hỏa (60oC - 90oC); benzen; cloroform; acetat etyl; aceton; metanol và etanol

đều là hóa chất Trung Quốc và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại

¾ Silica gel Merck 60 H (15 – 40 μm) loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, trích pha

rắn

¾ Silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), Merck dùng cho sắc ký cột cổ điển

¾ Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng

dung dịch acid sulfuric 50%, thuốc thử hiện hình flavon : dung dịch FeCl3

4.1.2 Thiết bị

¾ Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher)

¾ Máy cô quay chân không Buchi –111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

¾ Cột sắc ký: cột khô, cột cổ điển

¾ Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne

¾ Máy đo góc quay phân cực KRUSS-Germany, Phòng thực tập Hóa Lý, Khoa Sư

Phạm, Trường Đại Học Cần Thơ

¾ Các thiết bị ghi phổ:

- Phổ MS : Ghi trên máy quang phổ LC-MSD-Trap-SL

- Phổ 1H–NMR, 13C–NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90, phổ COSY, phổ HSQC

và phổ HMBC : ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho

phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR

Tất cả phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học và Khoa Học

Công Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

Nguyễn Thị Thu Trâm

4.2 QUÁ TRÌNH SẮC KÝ VÀ CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ

4.2.1 Điều chế cao etanol

Bột lá khô (1kg) được ngâm dầm trong etanol ở nhiệt độ phòng trong lọ thủy

tinh (loại 10 lít), lọc, cô cạn dung môi ở 500C, thu được cao etanol Lập lại quá trình

trên nhiều lần đến khi trích kiệt

4.2.2 Điều chế các cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform, cao acetat etyl, cao

metanol

Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn

dung môi từ không phân cực đến phân cực, theo dõi quá trình bằng sắc ký lớp mỏng

rồi cô quay thu hồi dung môi sẽ thu được các loại cao tương ứng

4.2.3 Cô lập các hợp chất có trong các loại cao

Tiến hành sắc ký cột (cổ điển) các loại cao trên, sau đó sắc ký cột và sắc ký

điều chế nhiều lần trên những phân đoạn được chọn để cô lập các hợp chất Toàn

bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện hình là

dung dịch acid sulfuric 50%, dung dịch FeCl3 hoặc soi đèn UV

4.3 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

4.3.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn[2]

Thực hiện tại Bộ môn Vi sinh, Khoa Dược, Trường Đại Học Y Dược TP Hồ

Chí Minh

Các loại hợp chất dùng trong thử nghiệm:

3β-henicosanoyloxy-5α-lup-20(29)-en; hỗn hợp của β-amyrin và lupeol (1:1);

(3R,4R,5S)-12(13)a-homo-5,10-seco-8-oxa-4,5-epoxy-3,4,11-trihydroxy-5-metyl-14-etoxycarabra-1(10),6-dien-9-on và

3,7-dimetylquercetin

Nguyễn Thị Thu Trâm

Chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Streptococcus

faecalis; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus ATCC 43300 methicillin

resisant (MRSA)

Cách tiến hành: sử dụng que cấy lấy một ít vi khuẩn từ ống nghiệm chứa

chủng, sau đó pha loãng vào trong nước cất vô trùng Sử dụng Pipetteman hút 1 ml

dung dịch pha loãng có chứa vi khuẩn vào trong các đĩa Petri có chứa môi trường

dinh dưỡng Trải đều vi khuẩn rồi đặt khoanh giấy lọc (đường kính 6,0 mm) đã tẩm

hợp chất khảo sát (nồng độ 10 μg/μl) lên bề mặt thạch, ủ trong tủ ấm ở 360C trong

24 giờ Sau thời gian trên, đo đường kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm) tạo ra xung

quanh khoanh giấy tẩm hợp chất Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh

khoanh giấy lọc, xác định khả năng kháng khuẩn của các hợp chất

4.3.2 Thử nghiệm Brine shrimp[5],[12]

4.3.2.1 Dụng cụ

- Becher các loại : 500 ml, 1000 ml

- Ống nghiệm, kính lúp, đèn pin, pipette pasteur

- Pipettman 10-100 μl, 100-1000 μl

- Lọ thủy tinh

4.3.2.2 Hóa chất

- DMSO tinh khiết

- Nước biển, nước cất

- Acid ursolic (chất đối chứng dương)

4.3.2.3 Nguyên liệu

Trứng Artemia salina Leach

Nguyễn Thị Thu Trâm

4.3.2.4 Cách tiến hành

* Ấp trứng thành ấu thể

- Cân 0,5 g trứng cho vào becher, ngâm với 300 ml nước cất trong 30 phút Lọc

trứng, cho vào becher chứa sẵn 500 ml nước biển, giữ nhiệt độ trong khoảng

28-340C, để yên trong 48 giờ

- Dùng đèn pin soi cho ấu thể tập trung ở vùng có ánh sáng, dùng ống hút hút chúng

ra một becher có chứa sẵn 250 ml nước biển Chỉ sử dụng ấu thể nở trong khoảng

thời gian 48-72 giờ

* Cách pha mẫu

- Pha mẫu cái : cân 20 mg chất khảo sát cho vào lọ, nhỏ vào một ít dung môi

DMSO hoặc dung môi hòa tan chất (tổng thể tích DMSO hoặc dung môi < 100 μl),

có thể đun cách thủy nhẹ để chất tan tốt, thêm 2ml nước biển, lắc đều

- Pha mẫu chứng

+ Mẫu chứng dương : cân 5 mg acid ursolic, hòa tan bằng 50 μl DMSO rồi thêm 1

ml nước biển, lắc đều

+ Mẫu chứng dung môi trích chất : cân 20 mg dung môi trích chất cho vào lọ, nhỏ

thêm vài giọt DMSO để giúp dung môi dễ phân tán trong nước, thêm 2 ml nước

biển, lắc đều

+ Mẫu chứng DMSO : hòa tan 100 μl DMSO trong 2 ml nước biển

4.3.2.5 Cách tính

* Tính nồng độ

- Mẫu cái : có nồng độ 20mg/2ml, hút lấy 500 μl, 250 μl, 50 μl sau khi thêm nước

biển cho tổng thể tích là 5 ml thì tương đương với các nồng độ 1000 μg/ml, 500

μg/ml, 100 μg/ml, tính tương tự cho các nồng độ khác

Nguyễn Thị Thu Trâm

- Mẫu chứng dương : có nồng độ 5mg/ml, như vậy nếu hút 100 μl dung dịch này rồi

thêm nước biển cho đủ 5 ml thì nồng độ sẽ là 100 μg/ml

- Mẫu chứng dung môi trích chất : nếu pha mẫu cái ở nồng độ nào thì mẫu chứng

dung môi trích chất cũng được pha ở nồng độ đó

- Mẫu chứng DMSO : có thể không cần tính nồng độ nhưng với 100 μl DMSO/ 2ml

nước biển (sử dụng lượng bằng với lượng hòa tan cao), cũng hút lấy 500 μl, 250 μl,

50 μl thêm nước biển vào cho tổng thể tích là 5 ml

* Tính liều LC 50

Liều LC50 là liều mà mẫu thử được pha ở nồng độ xác định có thể giết chết

50% ấu thể Artemia salina trong vòng 24 giờ Nếu số lượng ấu thể chết ít hơn 50%

ở một nồng độ x nào đó và chết 100% ở nồng độ lớn hơn 10x, thì phải thử nghiệm

lại ở nồng độ trong khoảng từ x đến 10x để xác định chính xác liều LC50

4.3.2.6 Cách thử (mỗi nồng độ muốn thử được thực hiện trên 3 ống nghiệm)

Từ becher chứa ấu thể, dùng pipette pasteur hút 10 con Artemia salina cho

vào mỗi ống nghiệm, sao cho thể tích trong ống đạt khoảng 4 ml Bơm mẫu chất

vào ống thử rồi thêm nước biển cho đủ 5 ml Để yên sau 24 giờ Dùng kính lúp đếm

số ấu thể chết trong mỗi ống nghiệm, suy ra tỉ lệ con chết do dung dịch thử nghiệm

ở mỗi nồng độ