Nghiên cứu và thực nghiệm thành phần hóa học của cây NEEm , họ xoan

Nghiên cứu và thực nghiệm thành phần hóa học của cây NEEm , họ xoan

3 NGHIEN CUU

3.1 Giới thiệu chung

Chúng tôi tiến hành khảo sát lá cây neem (A.izđica) được thu hái ở huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận, vào tháng 8 năm 2003 Lá neem được phơi và sấy

ở 60 °C đến khối lượng không đổi và được dùng để làm thực nghiệm

3.2 Điều chế các loại cao

l kg lá neem khô nghiền nhỏ được trích bằng Soxhlet với dung môi

MeOH, sau đó đem lọc thu được dịch trích Dịch trích này đem cô quay ở áp suất kém thu được cao MeOH thô Cho phần cao thô này hòa tan vào nước và lần lượt

chiết với các dung môi eter dầu hỏa, acetat etyl và butanol, cô quay thu hồi dung

môi ta thu được các loại cao tương ứng: cao eter dầu hỏa, cao acetat etyl, cao

- Hòa tan trong 1 lít HạO

- Chiết lần lượt với eter dầu hỏa, AcOEt,

3.3 Kết quả và biện luận

Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng trên các loại cao, trong đó cao acetat

etyl cho các vết tách tương đối rõ ràng, vì vậy chúng tôi chọn cao acetat etyl để nghiên cứu

3.3.1 Cao acetat etyl

Thực hiện sắc ký cột cao acetat etyl trên silica gel pha thường với các dung

môi giải ly lần lượt là eter dầu hóa, acetat etyl, metanol, kết hợp với sắc ký cột

ngược pha (ODS-RP18), sắc ký bản mỏng pha thường, ngược pha (RP18) và sắc

ký bản mỏng điều chế, chúng tôi đã cô lập được 6 hợp chất (N¡-Nạ)

Bằng các kết quả phổ nghiệm kết hợp với tài liệu tham khảo chúng tôi đã

nhận danh được các hợp chất này lần lượt là B-sitosterol (N¡), B-sitosterol 3-O D-glucopyranosid (N;), azadirachtoid (N3), 23-deoxyazadirachtolid (Ng), azadirachtolid C (Ns) va azadirachtolid D (Ng)

Sau đây là phần biện luận để xác định cấu trúc của các hợp chất trên

3.3.1.1 Chat N,

HO

Ni Trong phổ proton 'H-NMR, ta thấy có 6 nhóm metyl ở 0.68 (3H, s, H-18);

081 (3H, d, J=7.1 Hz, H-27); 0.84 (3H, d, J=7.3 Hz, H-27); 0.84 (3H, d, J=7.3Hz, H-26); 0.85 (3H, t, J=7.3 Hz, H-29); 0.92 (3H, d, J=6.6 Hz, H-21), 1.01 (3H, s, H- 19), một mũi ở 3.52 (1H, m, H-3) chứng tỏ đây là mũi của proton carbinol và mũi

olefin ở 5.35 (1H, br.s., H-6) Các mũi khác có nằm trong khoảng 0.7 - 2.3 ppm

So sánh với tài liệu tham khảo cho thấy chất N; là B-sitosterol

3.3.1.4 Chất N;

Ñ;

Hợp chất N; có sắc ký lớp mỏng cho vết tròn, màu hồng tím khi hiện hình

với acid sulfuric đậm đặc

Phổ !H của N¿ cho thấy có 6 nhóm methyl của steroid ở 0.68 (3H, s, H-18);

Bangl S6 liéu phé 'H-NMR (500MHz) va C-NMR (125MHz) cua N; trong

Ngoai ra, phé 'H-NMR của N¿ còn có một số tín hiệu của các proton của

đường Độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu carbon ứng với phần đường cho

thấy nó là nhân glucose

Trong phổ C-NMR ta thấy có 29 mũi cha 29C cia B-sitosterol, trong dé một mũi 76.3 (C-3) là mũi carbinol, hai mũi ở 140.7 (C-5) va 122.4 (C-6) cho thay

có nối đôi C=C Các mũi còn lại có ồ nằm trong khoảng 12.2 — 46.2 ppm

Bên cạnh đó, phổ !C_NMR còn có các tín hiệu của một đơn vị đường (các mũi nằm trong khoảng 62.1 — 101.5 ppm), được xác định là của glucopyranose

Từ những dữ kiện trên, NÑ; được xác định có cấu trúc của -sitosterol 3-O- 8-D-glucopyranosid có cấu trúc như hình vẽ

3.3.1.3 Chất Nạ

N3

Hợp chat N; dude cé lap dưới dạng tính thể hình kim, không màu, tan tốt

trong dung méi CHC] Phổ !H-NMR của NÑ¿ có 4 mũi đơn ứng với 4 nhóm methyl của limonoid ở 0.98 (23H, s, H-19); 1.01 (3H, s, H-18); 1.20 (3H, s, H-29) va 1.06 (3H, s, H-30), cho thấy N¿ là một limonoid Phổ proton của Ñ¿ có tín hiệu của 4 nhóm methin gắn với oxy ở 4.92 (1H, t, J=3.0Hz, H-1); 4.73 (1H, t, J=3.0Hz, H-3); 4.15 (1H, dd, J=8.0;8.5Hz, H-7) va 4.14 (1H, dd, J=3.0;12.5Hz, H-6) Pho 'H-,

3C_ và DEPT-NMR còn cho thấy sự hiện điện của một nối đôi ba lần thế [ồn

5.51 (1H, d, J=2.0Hz, H-15); öc 159.8 (C-14) và 120.2 (C-15)]; một nhóm acetyl (Sy 1.98 (3H, s); 5¢ 21.0 và 170.4]; một nhóm senecyloxy [õu 2.21 (3H, s, H-4`),

20

1.89 (3H, s, H-5’), 5.68 (1H, d, J=1.0Hz, H-2’)]; 8¢ 20.5 (C-4’), 27.5 (C-5’), 116.0 (C-2'), 157.6 (C-3”) và 165.6 (C-I') M6t mii d6i AB 6 3.64 (1H, d, J=7.5Hz), 3.57 (1H, d, J=7.5Hz) được xác định là của H;-28, tương ứng với mũi carbon CH;

ở ốc 77.9 cho thấy có liên kết eter giữa C-6 và C-28 trong Na

Ngoài ra, phổ 'ÌC-NMR của N¿ còn có tín hiệu của một vòng y-lacton dc 176.6 (C-23), để nghị vòng furan là một nhóm õ-lacton

So sánh số liệu của chất này với phổ của những hợp chất đã được công bố trước đây từ cây neem cho thấy N¿ là một limonoid có tên gọi là azadirachtolid”8!

đã được Nguyễn Minh Thanh và cộng sự cô lập trước đây cũng từ lá neem hái ở Ninh Thuận, có cấu trúc như hình vẽ

3.3.1.4 Chất Nụ

HạCCOO"`

Hợp chất N được cô lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu Sắc ký

bản móng pha thường với hệ dung môi giải ly CHCI;:MeOH tỷ lệ 9:1 va hiện

hình bằng acid H;SO¿ đậm đặc, Nạ cho một vết tròn màu đen

Phổ 'H-NMR của Na có 4 mũi đơn ứng với 4 nhóm methyl ở 1.01 (3H, s, H-19);

1.05 (3H, s, H-18); 1.20 (3H, s, H-29) va 1.09 (3H, s, H-30) cho thấy Na cũng là

một limonoid như N3 Ngoai ra, phé 'H- va C-NMR của hợp chất này còn có

nhiều điểm tương đồng với phổ của hợp chất Nạ Cụ thể là các tín hiệu proton

carbinol ở 4.84 (1H, t, J=2.5Hz, H-3); 4.71 (1H, t, J=3.0Hz, H-1); 4.13 (1H, dd, J=3.0; 12.5Hz, H-6) va 4.09 (1H, d, J=3.0Hz, H-7); hai mii đôi AB của H;-28 ở

3.63 (1H, d, J=7.5Hz); 3.51 (1H, d, J=7.5Hz); proton olefin 6 5.47 (1H, dd, J=1.0;

3.0Hz, H-15) Phổ !H-, 'C- và DEPT-NMR còn cho thấy sự hiện diện của một

nhóm senecyloxy [84 2.21 (3H, s, H-4’), 1.91 (3H, s, H-5’), 5.73 (1H, m, H-2’)]; 3c 20.9 (C-4’), 27.3 (C-5’), 117.1 (C-2’), 157.2 (C-3’) va 166.0 (C-1") và một nhóm acetyl [ 64 1.97 (3H, s); 5¢ 21.0 va 170.5] Điểm khác biệt duy nhất trên

phổ !C-NMR của hợp chất N¿ so với N¿ là sự biến mất của tín hiệu nhóm

carbonyl của vòng lacton (ốc 176.6 trong phổ !'C-NMR của Na) Thay vào đó, là tín hiệu của một nhóm metylenoxy ở dy 3.70 (1H, m) va 3.68 (1H, m); d¢ 60.7 (C- 23) xuất hiện trên phổ carbon của N¿ Từ đó chúng tôi giả thuyết

Bang 3 Số liệu phổ 'H-NMR (500MH2) và C-NMR (125MHz) của N¿ trong

vòng lacton của azadirachtolid (Ñ¿) đã trở thành một vòng tetrahydrofuran trong

Nà

Từ tất cả các dữ liệu trên, chúng tôi xác định Nụ là 23-deoxyazadirachtolid,

có cấu trúc như hình vẽ Chất này đã được cô lập trước đây từ lá neem.$!

một limonoid Ngoài ra, phổ !H- và !“C-NMR của hợp chất này còn có nhiều

điểm tương đồng với phổ của hợp chất N¿ Cụ thể là các tín hiệu proton carbinol ở 4.95 (1H, t, J=3.0Hz, H-1); 4.14 m (H-6) va 4.16 (H-7); hai mũi đôi AB của H;-2§

& 4.10 (1H, d, J=7.5Hz); 3.61 (1H, d, J=7.5Hz); proton olefin 6 5.50 (1H, dd, J=1.0; 3.0Hz, H-15) Phé 'H-, °C- va DEPT-NMR cdn cho thay sw hién dién cia

một nhóm senecyloxy [ồn 2.22 (3H, s, H-4'), 1.91 (3H, s, H-5’), 5.72 (1H,

'3C_NMR của Nạ) và trong phổ

26

'H-NMR của hợp chất N tín hiệu proton H-3 dịch chuyển về phía trường cao (õu

3.84 ppm ), chứng tỏ sự hiện diện của nhóm OH tự do ở C-3

Từ tất cả các dữ liệu trên, N; được xác định có cấu trúc của 3-

desacetylazadirachtolid như hình vẽ Kết quả tra cứu tài liệu cho thay chat Ng 1a

một chất chưa được công bố trên thế giới, do đó là một hợp chất thiên nhiên mới,

được đặt tên là azadirachtolid C

3.3.1.6 Chat Ng

Ñ; được cô lập dưới dạng tỉnh thể hình kim, không màu, tan tốt trong CHCl Sic ky ban mỏng pha thường với hệ dung môi giải ly CHC1I;:MeOH tỷ lệ 99:1 và hiện hình bằng acid HạSOx đậm đặc, Nạ cho vết hình bầu dục màu nâu đen

Phổ !H-NMR của Nạ có 4 mũi đơn ứng với 4 nhóm methyl ở 0.98 (3H, s, H- 19); 1.01 (3H, s, H-18); 1.20 (3H, s, H-29) va 1.06 (3H, s, H-30), cho thấy Nạ cũng

là một limonoid Phổ proton của Ñ còn có tín hiệu của 4 nhóm methin gắn với oxy ở 4.93 (1H, t, J=3.0Hz, H-1); 4.73 (1H, t, J=3.0Hz, H-3); 4.16 (1H, d, J=3.0Hz,

H=7) và 4.13 (1H, dd, J=3.0;12.5Hz, H-6) Phổ 'H-, ''C- và DEPT-NMR còn cho

thấy sự hiện diện của một nối d6i ba Jan thé (84 5.51 (1H, d, J=2.0Hz, H-15); 8c 160.1 (C-14) va 120.6 (C-15)]; một nhóm acetyl [dy 1.98 (3H,s); d¢ 21.0 va 170.4]; một nhóm senecyloxy [ôu 2.21 (3H, s, H-4’), 1.89 (3H, s, H-5’), 5.69 (1H,

Một mũi đôi AB ở 3.66 (1H, d, J=7.5Hz), 3.58 (1H, d, J=7.5Hz) được xác định là

của H;-28, tương ứng với mũi carbon CH; ở õc 77.9 cho thấy có liên kết eter giữa C-6 và C-28 trong Nạ, cho thấy Nạ cũng có cấu trúc limonoid như Nạ Điểm khác

biệt trên phổ 'ÌC-NMR của Nạ so với Ñ; là sự biến mất của tín hiệu nhóm

carbonyl trên vòng y-lacton Nhưng thay vào đó, là tín hiệu của nhóm acetal Ở ỗu

5.46 (1H, d, J=4.5Hz, H-23) và õc 98.4 Do đó, để nghị vòng lacton đã bị

hydrogen hóa thành vòng hemiacetal Ngoài ra, các tín hiệu trên phổ C-NMR

của Ng ting với các carbon trên vòng E đều xuất hiện thành từng đôi một, cho thấy N¿ là hỗn hợp hai đồng phân quang học có cấu hình đối nhau ở C-23 Tích phân trên phổ proton cho thấy hai xuyên lập thể này có tỷ lệ khoảng 2 : 1

Từ những dữ kiện trên, Nạ được xác định có cấu trúc dihydroazadirachtolid

như hình vẽ Kết quả tra cứu tài liệu cho thay chat Ng 1 một chất chưa được công

bố trên thế giới, do đó là một hợp chất thiên nhiên mới, được đặt tên là

azadirachtolid D

28

3.4 Thực nghiệm

3.4.1 Các điều kiện thí nghiệm

* Các phương tiện kỹ thuật và hóa chất dùng trong quá trình nghiên cứu và thực

nghiệm

- Dung môi thực nghiệm là dung môi đã được chưng cất lại: eter dầu hỏa (60- 90°C), cloroform (61-62°C), acetat etyl (76-78°C), metanol (64-65°C)

- Sắc ký bản mỏng:

+ Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60 Fas¿, 250m)

+ Silica gel pha ngược RP;s(Merck, RP-18 F545)

- Thuốc thử hiện hình bản mồng:

+ H;SO¿ đậm đặc

+ lod

- Sắc ký cột:

+ Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60, 40-63m)

+ Silica gel pha ngược (Cosmosil PN-75 ODS, RP18)

- Máy phổ hiệu:

+ Bruker Avance 500 (500MHz cho !H-NMR và 125MHz cho ''C-NMR)

- Dung môi chạy phổ là CDC]; nếu không được chú thích gì khác, với TMS là nội

a

chuẩn

30

3.4.2 Thu hái, xử lý và điều chế các loại cao

Lá neem được thu hái ở huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận tháng 8 năm

2003 Sau đó lá neem được phơi và sấy ở 60°C đến khối lượng không đổi, sau đó

đem nghiền nhỏ và được dùng cho phần thực nghiệm

1 kg lá neem khô nghiền nhỏ được trích bằng Soxhlet với dung môi

MeOH, sau d6 dem loc thu được dịch trích Dịch trích này đem cô quay ở áp suất kém thu được cao MeOH thô Cho phần cao thô này hòa tan vào nước và lần lượt

chiết với các dung môi eter dầu hỏa, acetat etyl và butanol, cô quay thu hồi dung

môi ta thu được các loại cao tương ứng, cao eter dầu hỏa, cao acetat etyl, cao butanol và dịch nước

3.4.3 Khảo sát cao acetat etyl

Cao acetat etyl (18,30 g) được sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi CHCI;:MeOH:H;O tỷ lệ 90:9:1 và tăng dân độ phân cực hệ dung môi thu được 12 phân đoạn và được ký hiệu là NA1, NA2 , NA12 Tiến hành sắc ký bản mỏng 12 phân đoạn trên, các phân đoạn NA3, NA4, NA5, NA6, NA9, NA12

cho các vết tách tương đối rõ ràng

Sau đây chúng tôi tiến hành khảo sát lần lượt các phân đoạn này

3.4.3.1 Khảo sát phân đoạn NA5 va NA6

Dựa vào sự so sánh trên sắc ký bản mỏng, chúng tôi thấy phân doan NAS

và NA6 giống nhau và tách tương đối rõ nên gộp chung lai NA6

Sắc ký cột phân đoạn NA6 với hệ dung môi eter dầu hỏa : acetat etyl (I1 :

1) thu được 15 phân đoạn (NA61-NA615) Cô cạn dung môi, phân đoạn NA611

xuất hiện tinh thể hình kim Rửa và kết tinh lại trong CHC]; thu được chất Nụ

Sơ đồ cô lập chất N¡

Cao acetat etyl (18.30g)

SKC, silica gel, CHCl;:MeOH:H,O

90:9:1 và tăng dần độ phân cực thu được

12 phan doan (NAI-NA12)

Vv

NA6 (2.90g)

SKC, silica gel, PE:AcOEt 1:1 va tang

dân độ phân cực thu được 15 phan đoạn

3.4.3.2 Khao sat phan doan NA12

Ở phân đoạn 12, ta thu được một kết tủa, lọc lấy kết tủa rửa và kết tỉnh lại

trong MeOH, ta thu dude No

Sơ đồ cô lập chất N;

Cao acetat etyl(18.30g)

SKC, silica gel, CHCl;:MeOH:H,0 90:9:1

và tăng dần độ phân cực thu được 12

phân đoạn (NA1-NA12)

NA 12 (0.92g)

Lọc, rửa kết tủa

Kết tủa (43.4mg)

3.4.3.3 Khảo sát phân đoạn NA4

Sắc ký cột phân đoạn NA4 với hệ dung môi eter dầu hỏa: acetat etyl 7:3

và tăng dan độ phân cực được 16 phân đoạn ký hiệu NA41-NA416 Cô cạn dụng môi, phân đoạn NA416 xuất hiện tỉnh thể hình kim Rửa kết tính lại trong CHC];

SKC, silica gel, PE:AcOEt 7:3 và

tăng dần độ phân cực thu được 16

phân đoạn (NA41-NA416)

3.4.3.4 Khảo sát phân doan NA9

Sắc ký cột ngược pha (ODS, RPI8) trên phân đoạn NA9, với hệ dung môi MeOH:H;O tỷ lệ 2:1 và tăng dần độ phân cực thu được 8 phân đoạn (NA91- NA98) Cô cạn dung môi, dựa vào sự so sánh trên sắc ký bản mồng với hệ dung môi giải ly CHCl::MeOH tỷ lệ 9:1 các phân đoạn trên, phân đoạn NA94 có các

vết tách khá rõ

Chúng tôi tiếp tục khảo sát phân đoạn NA94 trên sắc ký cột pha thường

với hệ dung môi CHCI;:MeOH tỷ lệ 9:1 và tăng dân độ phân cực thu được 7 phân đoạn NA941-NA947 Cô cạn dung môi, cho thấy phân đoạn NA943 xuất hiện tỉnh

34