Quy trình định tính samonella

Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín. Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa bảo quản không tốt) Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao. Khi tiếp xúc phân người và súc vật có nhiễm salmonella. Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

• Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín.

• Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa bảo quản không tốt)

• Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao

• Khi tiếp xúc phân người và súc vật có nhiễm salmonella.

• Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”

• triệu chứng đau bụng, tiêu chảy

• Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín

• Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa bảo quản không tốt)

• Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao

• Khi tiếp xúc phân người và súc vật có nhiễm salmonella.

• Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”

• triệu chứng đau bụng, tiêu chảy

Salmonella xâm nhập vào

cơ thể????

TRIỆU

CHỨNG

 Tiêu chảy, đau bụng, buồn ói và ói, sốt, đau đầu,…

 Thường xảy ra khoảng 12-36h sau khi ăn

 Các triệu chứng có thể kéo dài từ 2 ngày đến 1 tuần

Không ăn / uống sữa hoặc những sản phẩm từ sữa chưa thanh trùng

Rửa sạch hoa quả, rau củ trước khi ăn

Giữ thực phẩm ở nhiệt độ 4.40C hoặc -180C

Chỉ ăn thức ăn đã nấu chín

Rửa sạch các dụng cụ sau khi thái các thực phẩm sống

Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình từ

Tính chất hóa sinh

Lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose

 Không sinh indol, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane

 Hầu hết các chúng đều sinh H2S.

Môi trường và hóa chất Mục đích

Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Tăng sinh sơ bộ

Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RVS)

Tăng sinh chọn lọc

Selenit xystin/ Tetrathionat (TT)

Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)

Phân lập

Hektoen Entric Agar (HE)

Phương pháp thực hiện

Phương pháp thực hiện

*Quy trình định tính

BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH

25g mẫu Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher

60 giây

25g mẫu + 225ml BPW

Ủ ở 37 độ C trong 24h

18-Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm.

Là sử dụng môi trường tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế.

Tên môi trường Thành phần

Dung dịch Buffered Peptone Water

(BPW)

Pepton 10gNaCl 5gNa2HPO4 3,5gKH2PO4 1,5g

BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH

Ngoài ra còn có thể sử dụng một số môi trường:

-Môi trường dịch thể Tryptic soy broth(TSB)

Tên môi trường Thành phần

Trypticase Soy Broth (TSB)

BƯỚC 2: TĂNG SINH

Tên môi trường Thành phần

RVS

Pepton từ đậu tương: 4,5 g/lNatri clorua: 7,2 g/l Kali dihydro phosphat : 1,44 g/l Magie clorua khan (MgCI2): 13,4 g/l Oxalat xanh malachit: 0,036 g/l

Canh RVS ức chế vi khuẩn khác nhờ MgCI2 bằng cách tác động lên tế bào vi khuẩn và nhờ màu xanh Malachite ức chế các vi khuẩn Gr(+)

Tên môi trường Thành phần Hàm lượng

Natri thiosulfat ngậm 5 phân tử nước (Na2S2O3.5H2O)

47,8 g

BƯỚC 2: TĂNG SINH

CHỌN LỌC

BƯỚC 2: TĂNG SINH

CHỌN LỌC

Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella

Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella cần dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu

Một số môi trường tăng sinh

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Mục đích:

Nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE…

Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng

khác nhau Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dạng Salmonella phải dùng tôi thiểu 2 môi trường chọn lọc

phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu.

Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng

khác nhau Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dạng Salmonella phải dùng tôi thiểu 2 môi trường chọn lọc

phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu.

Môi trường XLD : khuẩn lạc có màu hồng trong suốt,

có hay không có tâm đen Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc

• Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc.

Môi trường HEMôi trường HE

Tâm đen

Môi trường BS (Bismuth Sulfite Agar)

Môi trường BS (Bismuth Sulfite Agar)

Polypeptone (hay peptone) 10g Cao thịt 5g Dextrose 5g Na2HP04 (anhydrous) 4g FeS04 (anhydrous) 0,3g Bismuth sulfite 8g Brilliant green 0,025g Agar 20g

Nước cất 1lít

Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím.

Bước 5 :Khẳng định

 Nhằm xác nhận lại các khuẩn lạc đặc trưng cho Samonella

xuất hiện trên môi trường phân lập.

 Bước này dựa trên việc sử dụng các thử nghiệm sinh hóa và

thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella.

Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường TSI (+)

• Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống

đáy

Ống 1: môi trường TSI không có VSV Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt) Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh và sinh H2S

Thử nghiệm urea (-)

Được thực hiện trên môi trường urea lỏng , chứa chỉ thị đỏ

phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH

6.8-8.4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn

lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc

nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48 giờ

Salmonella không phân giải urea thành NH3 nên không làm

thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn

giữ nguyên màu vàng cam.

Thử nghiệm VP(-)

Môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi

trường MR-VP), pH 6.9 Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi

trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ

18-24 giờ trên môi trường KIA Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử

trực tiếp vào ống môi trường Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm

nhất 4 giờ

Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có

hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường

Thử nghiệm khả năng sinh indol (-)

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ về ống chứa

5ml môi trường tryptone water

Salmonella không sinh indol nên xuất

hiện màu vàng ở ống nghiệm.

 Cho que cấy vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ trong môi trường

vô trùng có chứa 0,25ml dung dịch nước muối sinh lý Thêm một giọt toluen và lắc ống.

kết quả âm tính.

Thử nghiệm ONPG

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng

hiện vạch đen

Kovac’s

40%

Kiểm tra các phản ứng kháng huyết thanh

Mục đích: Khẳng định Salmonella phân lập được

 Kiểm tra sự tự kết dính của các chủng:

Cho 1 giọt dung dịch nước muối sinh lý lên phiến kính sạch Dàn đều khuẩn lạc cần thử trong giọt dung dịch sao cho thu được một thể huyền phù đồng nhất Lắc nhẹ phiến kính trong 30-60s

Salmonella có 3 loại kháng nguyên:

Kháng nguyên O(kháng nguyên thân): bền với nhiệt, được dùng để chia thành nhóm

Kháng nguyên H(kháng nguyên tiên mao): không bền với nhiệt

dùng để định loại, có bản chất là protein

Kháng nguyên Vi: không bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn kháng nguyên O

Nhỏ 1 giọt anti-O hoặc H lên một lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ môi trường để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60s Quan sát phản ứng dương tính khi xảy ra hiện tượng ngưng kết.

Giải thích các kết quả các phép thử khẳng dịnh

dương tính

Salmonella