Quy Trình Định Lượng E.Coli

E. coli là dạng trực khuẩn Gram () kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người và động vật. Chúng thuộc loại: glucose và lactose (+); indol và MR (+); VP và Citrate ().

Quy Trình Định Lượng E.Coli

GVHD: Phan Thị Kim Liên Nhóm: 4

Danh Sách Nhóm

1. Đào Thị Mỹ Dung 2005130353

2. Nông Phương Hòa 2005130400

3. Lê Thị Thùy Linh 2005130032

4. Nguyễn Thị Thảo Nguyên 2005130352

5. Phan Thị Yến Nhi 2005130109

1 • Tình hình ngộ độc thực phẩm

2 • Đặc điểm E coli

3 • Định lượng E coli băng phương pháp đếm khuẩn lạc

4 • Định lượng E coli băng phương pháp MPN

Nội dung

1.Tình Hình Ngộ Độc

• Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli. 

• 1/6/2014: Hàng trăm công nhân Công ty Nienhsing ở Thái Bình nhập viện

là do ăn phải những suất cơm nhiễm vi khuẩn E.coli và Coliforms. 

• 8/1/ 2015: 206 công nhân của công ty may Namsung Vina bị ngộ độc do nguồn nước chế biến thức ăn chứa E coli

• Vụ ngộ độc thực phẩm khiến 107 công nhân Công ty TNHH star Fashion (Chương Mỹ, Hà Nội) phải nhập viện do ăn phải thực phẩm đã bị nhiễm

vi khuẩn và độc tố E.coli

1.Tình Hình Ngộ Độc

2.Đặc điểm E coli

Định lượng E coli băng phương pháp đếm khuẩn lạc

Nguyên tắc:

Đếm các khuẩn lạc E coli điển hình trên môi trường TBX

Kết quả biểu thị bằng số E coli trên 1g mẫu chưa pha loãng

Định Nghĩa Và Nguyên Tắc

Dụng Cụ, Thiết Bị, Môi Trường Và Hóa Chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu

TBX Nuôi cấy E coli

HCL 10%

Chỉnh pHNAOH 10%

Môi trường SPW

• Sodium Chloride 8.50 g/l

• Casein Peptone 1.00 g/l

• pH cuối cùng 7.0 ± 0.2 at 25ºC

Casein Peptone đảm bảo sự hồi sức của vi sinh vật.

Sodium Chloride cung cấp môi trường đẳng trương

Thành phần:

 Sản phầm thủy phân casein bằng enzym

 Muối mật No.3

 Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)

 Dimetyl sulfoxit (DMSO)

Xoay nhẹ trộn đều mẫu , ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược

đĩa và ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ.

Đọc kết quả Chọn các đĩa <= 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Đọc kết quả Chọn các đĩa <= 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu

Pha loãng mẫu

Cấy và ủ mẫu

Đếm và chọn lọc các khuẩn lạc để khẳng định

Các Bước Tiến Hành

Các Bước Tiến Hành

Cân mẫu chính xác 10g/25g với mẫu rắn, mẫu lỏng thì đong

10ml/25ml và cho vào túi nhựa vô trùng

Cân mẫu chính xác 10g/25g với mẫu rắn, mẫu lỏng thì đong

10ml/25ml và cho vào túi nhựa vô trùng

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml vô trùng vào túi nhựa

chứa mẫu

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml vô trùng vào túi nhựa

chứa mẫu

Tiến hành đồng nhất mẫu và dịch pha loãng, lắc đều trong 2-3 phút

Thực hiện các thao tác ở nhiệt độ phòng, và giữ ổn định

Lắc huyền phù và các dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh phần

tử có VSV lắng xuống

Lắc huyền phù và các dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh phần

tử có VSV lắng xuống Bước 1

Sử dụng pipet hút 10ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng

Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5-10 giây, để thu được dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục lặp lại

sẽ được các nồng độ tiếp theo tới khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

Sau 24 giờ nuôi cấy tiến hành đếm khuẩn lạc dưới 150

Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng khác nhau để

qui về số E.coli trong 1g mẫu

Tính Kết Quả

Tổng số E coli trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức:

Trong đó:

 C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên 4 đĩa của 2 độ pha loãng liên tiếp

 V: thể tích dịch nuôi cấy trên mỗi đĩa (ml)

 n1, n2: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất và thứ 2

 d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

Định lượng E coli bằng phương pháp MPN

•Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một thể tích mẫu

•Được thực hiện dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu

•Thông thường các độ pha loãng được chọn liên tiếp nhau

1 Nguyên tắc

Phương pháp MPN (tt)

• Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại nhiều

lần (3 lần hoặc 5 lần)

• Kết quả thống kê tính trên số lần dương tính của mỗi độ pha

• Định lượng được mật độ vi sinh vật thấp

trong một thể tích mẫu lớn

1 Nguyên tắc

• Dipotassium hydrogen phosphate 2.75g

• Potassium dihydrogen phosphate 2.75g

• Sodium lauryl sulphate 0.1g

• pH 6.8 ± 0.2 ở 25°C

Quy trình định lượng e.coli bằng phương pháp MPN

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1,10-2,10-3 …

Chuyển 1ml dịch 10-1,10-2,10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nông độ 3 ống lăp lại, ủ ở

37oC, 48 giờ

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh EC, ủ ở 44,5 +-0,2oC, 24 giờ

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Cấy lên thạch EMB, ủ ở 37oC , 24 giờ

Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44,5+-0,2 oC, 24

giờ

Thử nghiệm IMViC

E.Coli Đếm số ống canh EC (+) và IMViC ++ , tra bảng

MPN

Bước 2: Pha loãng mẫu

Bước 3: Nuôi cấy trên môi

trường tăng sinh chọn lọc 1

• Tại mỗi nồng độ được chọn, cấy mẫu lên 3 ống môi trường LSB

• Ủ 37oC/24-48h

• Quan sát hiện tượng đục/sinh khí

www.hsph.edu.vn

Bước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn

lọc 2

• Chọn các ống môi trường LSB có kết quả dương tính (đục/sinh khí)

• Cấy chuyển huyền dịch vi khuẩn từ môi trường LSB sang môi trường canh thang EC

• Ủ 44oC/24-48h

Bước 5

• Cấy lên thạch EMB, ủ ở 37oC , 24 giờ

• Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44,5+-0,2 oC, 24 giờ

E coli

www.hsph.edu.vn

Bước 5: Thử nghiệm IMViC Thử khả năng sinh Indol

• Methyl Red (MR)

• VP (Voges Proskauer)

CITRATE TEST

Tài liệu tham khảo

Giáo trình phân tích vi sinh thực phẩm

http://www.dongnamlab.com/publics/product/905/files/TBX_agar_TDS_BK146_BM069_BM171_v08.pdf

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7924-1 : 2008

ISO 16649-1 : 2001