Quy trình định lượng clostridium perfringens

C.perfringenes được tìm thấy trong đất, trong phân người.Chúng thường hiện diện trong các thực phẩm nguội lạnh của cửa hàng ăn uống.Triệu chứng: đau thắt vùng bụng, tiêu chảy.Thời gian ủ bệnh: 12 – 24 giờ.Nguồn thực phẩm dễ lây nhiễm: Thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Các thành viên nhóm

8

• Đinh Hồng Ngọc

• Phạm Thị Tú Oanh

• Vy Thị Minh

• Đào Thị Thảo Uyên

• Nguyễn

Định lượng C.perfringens bằng phương pháp

đếm khuẩn lạc

Tổng quan về C perfringenes

I

Nguyên tắc Thiết bị, dụng cụ và môi trường Các bước tiến hành

II

III

IV

• Trực khuẩn kỵ khí gram (+), sinh bào tử,

nhiệt độ tối ưu từ 37 – 450C

• Gặp phổ biến trong đường tiêu hóa của người

nên thường được dùng làm vi sinh vật chỉ thị

về khả năng nhiễm phân

• Bào tử có khả năng cạnh tranh cao, nên khi tế

bào sinh dưỡng bị chết đi, bào tử vẫn sống

sót và sinh trưởng

NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C PERFRINGENS

 C.perfringenes được tìm thấy trong đất, trong phân người.

Chúng thường hiện diện trong các thực phẩm nguội lạnh của cửa hàng ăn uống.

 Triệu chứng: đau thắt vùng bụng, tiêu chảy.

 Thời gian ủ bệnh: 12 – 24 giờ.

 Nguồn thực phẩm dễ lây nhiễm: Thịt gia cầm, nhất là gia

cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác.

 Biện pháp: đun sôi nấu kĩ.

NGUYÊN TẮC

1 Định Nghĩa:

 Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình ( kết tủa đen,

do khử sunfit thành sunfua, làm cho màu khuẩn lạc bị đen ) trong môi trường chọn lọc và cho các phản ứng khẳng định dương tính khi thử bằng một trong hai kỹ thuật qui định

trong tiêu chuẩn này.

2 Nguyên tắc:

- Phương pháp hộp đổ.

- Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37o

C trong 24 giờ.

- Định lượng các khuẩn lạc điển hình.

- Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình

và tính số lượng C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu.

Thiết bị, dụng cụ và môi trường

1.Thiết bị và dụng cụ

- Cân - Dao lấy mẫu, pH kế, Erlen.

- Bể điều nhiệt - Que cấy thẳng và que cấy vòng.

- Nồi tiệt trùng - Phiến kính và lam kính.

- Tủ ấm - Ống nghiệm.

- Thiết bị nuôi cấy kỵ khí - Pipet.

- Tủ cấy - Hộp Petri.

Một số môi trường thuốc thử thường dùng.

• Thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC agar)

• Môi trường Iron - Milk

• Canh thang gan cục hoặc canh thang thịt

• Canh thang nuôi cấy nha bào

• Môi trường Lactoza gelatin

• Dung dịch thioglycolat lỏng

• Thuốc nhuộm Gram

 Môi trường thạch Tryptose – Sulfide – Cycloserine

 Môi trường thioglycolat lỏng.

 Môi trường di động Nitrat.

Dinatri hidro octophosphat

 Môi trường lactoza sunfit (LS)

 Môi trường lactoza-gelatin (LS)

0,1ml

Thioglycolate brouth, ủ kỵ khí 37oC, 18 – 24 giờ

Lactose sunfit hoặc Nitrat, Lactose-gelatin ủ hiếu khí

46 o C/18-24h

Đọc kết qua sơ bộ sau 24 giờ

- Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: tròn, lồi, bờ đều,

Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân 10g mẫu rắn (hút

V = 10ml mẫu lỏng)

Dung dịch pha loãng

SPW 90ml

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy

dập 1 phút (lắc đều bình tam giác 2-3phut)

Dịch mẫu 10-1

Bước 2: Pha Loãng Mẫu

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Để cho đông đặc Ủ trong điều kiện kỵ khí 24h

1 ml

1 ml

Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định.

• Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24h

nuôi cấy Khuẩn lạc C Perfringenes điển hình có

màu đen trên môi trường TSC Đếm các khuẩn

lạc C Perfringenes trên những đĩa có số đếm phù

hợp

• Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và chọn 1 trong hai kỹ

thuật thử khẳng định sau:

 Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS

Cấy từng khuẩn lạc vào mt

trong 24h

Kiểm tra các ống nghiệm này về sự sinh khí và có xuất hiện kết tủa màu đen => dương tính

 Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường nitrat để

thử tính di động và mt lactose-gelatin

MT nitrat

Cấy đâm sâu vào mt, ủ 37 0 C 24h, kỵ khí, thêm 0.2 - 0.5ml thuốc phát hiện nitrit

Cấy khuẩn lạc, ủ 37 0 C 24h,

kỵ khí, xuất hiện màu vàng (do hình thành axit)

và làm lạnh

ở 5 0 C kiểm tra hóa lỏng

MT lactosegelatin

(+), sinh bào tử, khử nitrat thành nitrit,

sinh acid và khí từ

lactose, hóa lỏng

gelatin được coi là C

Perfringenes.

 Thử nghiệm tính di động

Tiến hành: Làm môi

trường thạch đứng

Manitol Mobility Nitrate

Cấy sâu khuẩn lạc đã

phân lập vào môi trường

Nuôi dưỡng trong điều

kiện yếm khí 37 0 C 1 0 C,

18-24h.

 Xác định hình thể và tính chất bắt mầu

a) Chuẩn bị canh trùng thuần nhất:

• Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc điểm: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen trên đĩa thạch TSC cấy vào 1 ống môi trường canh thang thioglycolat hoặc canh thang gan cục và canh thang nha

bào

• Ủ ấm 37oC/18 - 24 giờ Thu được canh trùng thuần nhất

b) Hình thể và tính chất bắt mầu

- Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram để

xem hình thể và tính chất bắt mầu C

perfringens là trực khuẩn ngắn, bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr ( +)

- Phát hiện khả năng sinh nha bào: nhuộm Gram

từ canh thang nha bào thấy: trực khuẩn ngắn, tròn đầu, giữa có khoảng trắng sáng không bất mầu thuốc nhuộm

a) Thử nghiệm Iron – Milk

Môi trường Iron – Milk:

Sữa tươi toàn phần 1lit Sắt sunfat.7H2O 1g

Nước cất 50ml

Thử tính chất sinh vật hoá học

- Lấy 1ml canh trùng thuần nhất cho vào ống nghiệm môi trường Iron – Milk

- C.perfringen làm đông sữa nhanh ở đáy ống nghiệm và tạo ra lớp nhũ tương ở trên

b) Thử tính chất lên men đường và hoá lỏng gelatin

- Từ canh trùng thuần nhất cấy vào môi trường

lactoza gelatin Sau 24 giờ ở 37 o C, nhận định khả năng lên men đường Lactoza, và khả năng khí và chuyển màu vàng (sinh acid) Làm lạnh vào 5 0 C/1 giờ.

- Đọc kết quả sơ bộ khả năng hóa lỏng gelatin.

- Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc, ủ thêm 24 giờ/

37 0 C

c) Khả năng chuyển hoá nitrat thành

nitrit: - Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35oC/24 giờ

Nhỏ 0,2 - 0,5ml thuốc thử vào mỗi ống

- Quan sát mầu môi trường chuyển

sang màu đỏ (+)/10 phút

- Nếu trong 15 phút mà màu đỏ không hình thành thì thêm 1 lượng nhỏ bột kẽm.

 Phương pháp nuôi cấy trong ống thạch Môi trường thuốc thử:

Thạch Wilson Blair (hoặc

Dung dịch ferrous amon

b) Tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử như trên, pha loãng đến đậm độ dùng nuôi cấy

- Đun chảy thạch Wilson Blair (hoặc thạch

Perfringens selective), để nguội khoảng 500C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử Mỗi nồng độ cấy trong 2 ống Mỗi ống cho thêm 2ml dung dịch

Na2SO3 20% và 5 giọt phèn sắt 5% Lắc trộn đều

- Đun cách thủy 750C/15phút Làm đông nhanh

thạch

- Để ở 370C/18-24h

Tiêu chuẩn để xác định C perfringen Trực khuẩn ngắn:

C perfringenes trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo

công thức:

X = x R (CFU/g hay CFU/ml)

C: Tổng số khuẩn lạc C Perfringenes đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp

V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa (ml)

: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất.

Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai.

d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất R: tỉ lệ khẳng định dương tính

 Ví dụ:

• Độ pha loãng 10-2 :

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc

- Số khuẩn lạc có trong 1g thực phẩm được tính:

X = x 100 = 120

Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm có 1,2 x 10-2

vi khuẩn C.perfringens

•