Vì những yêu cầu trên, đề tài “ Xây dựng quytrình định tính và định lượng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp chủng Bắc Mỹ trên heo PRRSV bằng kỹ thuật real-time RT-PCR sử dụng m
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI-RÚT GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG BẮC MỸ TRÊN HEO (PRRSV) BẰNG
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI-RÚT GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG BẮC MỸ TRÊN HEO (PRRSV) BẰNG
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, con xin gửi lời cám ơn gia đình luôn quan tâm động viên con trong suốtquá trình học tập
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủnhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt nhữngkiến thức hay và phong cách làm việc tốt cho em trong suốt 4 năm học
Tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô Viện công nghệ sinh học và môi trường, Đạihọc Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốtthời gian thực tập
Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và KS.Võ Khánh Hưng đã tận tình hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp
Thầy Phạm Hùng Vân, chị Thùy Trang và các anh chị trong phòng thí nghiệmcông ty Nam Khoa đã giúp đỡ em nhiều trong quá trình làm thí nghiệm
Các bạn cùng nhóm nghiên cứu, các bạn lớp DH07SH Chân thành cảm ơn bạnNguyễn Văn Chí và KS Nguyễn Phan Thành đã giúp đỡ em trong quá trình thựchiện đề tài
Trang 4TÓM TẮT
Bệnh do vi-rút PRRS gây ra trên heo đang xảy ra, gây nhiều thiệt hại kinh tếcho ngành chăn nuôi thế giới và Việt Nam Tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạpkhi xuất hiện biến chủng PRRSV Bắc Mỹ độc lực cao tại Trung Quốc, gọi tắt làHV-PRRS (highly virulent PRRS) Các chủng PRRSV phát hiện tại Việt Nam đãđược xác định phần lớn thuộc dòng PRRSV Bắc Mỹ trong đó có cả PRRSV độc lựccao Do vậy, việc xây dựng quy trình định tính và định lượng PRRSV dòng Bắc Mỹ
là cần thiết cho công tác phòng chống bệnh Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dòTaqman là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong định tính và địnhlượng vi-rút PRRS nhiễm trên heo Vì những yêu cầu trên, đề tài “ Xây dựng quytrình định tính và định lượng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp chủng Bắc
Mỹ trên heo (PRRSV) bằng kỹ thuật real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman”
đã được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường và Công ty NamKhoa
Kết quả đạt được gồm xây dựng thành công quy trình định tính và địnhlượng PRRSV; ứng dụng quy trình real-time PCR chẩn đoán 20 mẫu thực địa, kếtquả 11/20 mẫu dương tính với PRRSV dòng Bắc Mỹ (tỷ lệ 55%)
Trang 5The reproductive and respiratory syndrome has been spreading and causingsevere economic devastations for the international and Vietnam livestock Thesituation has become complexly when the highly virulent virus in China mutatedfrom North American PRRSV appears In Vietnam, PRRSV is determined to beNorth America PRRSV and even HV-PRRSV Therefore, establishing theprocedure for detecting and quantifying PRRSV is necessary Taqman based realtime RT-PCR is the sensitive and specific method to detect and quantify PRRSV.For all these reasons, the thesis: “To establish the procedure to detect and quantifyreproductive and respiratory syndrome virus by using the Taqman based real timeRT-PCR” is performed at the Institute Research of Biotechnology and Environmentand Nam Khoa company
The result achieves: The research established successfully the procedure to detectand quantify NA PRRSV The procedure was applied to test 20 samples which 11samples are positive with the NA PRRSV (55%)
Trang 6MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
SUMMARY iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH viii
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Yêu cầu 2
1.3 Nội dung thực hiện 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo 3
2.2 Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo 3
2.2.2 Biến chủng PRRSV độc lực cao tại Trung Quốc 4
2.2.3 Cấu trúc vi-rút PRRS 6
2.3 Chẩn đoán vi-rút PRRS 7
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 7
2.3.2 Phương pháp phát hiện kháng thể 7
2.3.3 Phương pháp RT-PCR 7
2.3.4 Phương pháp nested RT-PCR 8
2.4 Kỹ thuật real-time PCR chẩn đoán PRRSV 8
2.4.1 Kỹ thuật real-time PCR 8
2.4.2 Các chất phát huỳnh quang sử dụng trong real-time PCR 8
2.4.3 Nguyên lý hoạt động real-time sử dụng mẫu dò Taqman 10
Trang 72.4.4 Thành phần phản ứng real-time PCR dùng mẫu dò Taqman 11
2.4.5 Tiêu chuẩn của một phản ứng PCR định lượng tối ưu 11
2.4.6 Thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng real-time PCR 13
2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về PRRSV 14
2.5.1 Nghiên cứu trên thế giới 14
2.5.2 Một số nghiên cứu tại Việt Nam 14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.2 Vật liệu 16
3.3 Hóa chất và thiết bị 16
3.4 Phương pháp tiến hành 17
3.4.1 Thu nhận mẫu 17
3.4.2 Ly trích RNA từ dịch vi-rút và huyết thanh 19
3.4.3 Thiết kế mồi và mẫu dò real-time PCR đặc hiệu PRRSV dòng Bắc Mỹ .20
3.4.4 Kiểm tra khả năng hoạt động của cặp mồi F7-R7VN 20
3.4.5 Phản ứng Onestep Taqman real-time RT-PCR trên mẫu thực địa 21
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1 Thiết kế cặp mồi và mẫu dò cho phản ứng real-time PCR 22
4.2 Kiểm tra sự hoạt động của cặp mồi F7-R7VN 24
4.3 Phản ứng Onestep Taqman real-time RT-PCR với mồi F7-R7VN và mẫu dò P7 24
4.4 Xây dựng đường chuẩn cho định lượng PRRSV .25
4.5 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng 26
4.6 Ứng dụng quy trình Onestep Taqman Real-time RT-PCR trên mẫu thực địa 27
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
5.1 Kết luận 31
5.2 Đề nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC
Trang 9DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số cặp chất phát và hấp thụ huỳnh quang thường sử dụng 9
Bảng 3.1 Mẫu sử dụng trong quy trình phát hiện PRRSV bằng Taqman real-time PCR 18
Bảng 3.2 Cặp mồi và mẫu dò thiết kế cho phản ứng real-time 20
Bảng 3.3 Thành phần và nồng độ hóa chất trong phản ứng RT-PCR 20
Bảng 3.4 Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR 21
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng Onestep Taqman real-time PCR 21
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt phản ứng Onestep Taqman real-time PCR 21
Bảng 4.1 Kết quả chạy mẫu thực địa 28
Trang 10DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Sự phân bố vi-rút PRRS khu vực Đông Nam Á từ 2007 - 2010 5
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen vi-rút PRRS 6
Hình 2.3 Cấu tạo của mẫu dò Taqman 9
Hình 2.4 Cơ chế phát quang của Taqman trong phản ứng real-time PCR 10
Hình 2.5 Biểu đồ thể hiện các giai đoạn của tín hiệu huỳnh quang 11
Hình 2.6 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng 13
Hình 4.1 Vị trí bắt cặp của mồi xuôi F7 trên ORF7 PRRSV dòng Bắc Mỹ 22
Hình 4.2 Vị trí bắt cặp của mồi R7VN trên PRRSV dòng Bắc Mỹ 23
Hình 4.3 Vị trí Taqman bắt cặp vào DNA PRRSVdòng Bắc Mỹ 23
Hình 4.4 Chạy RT-PCR với dịch pha loãng dịch vi-rút và mẫu huyết thanh 24
Hình 4.5 Phản ứng định tính Taqman real-time PCR 25
Hình 4.6 Biểu đồ khuếch đại các độ pha loãng dịch vi-rút từ 100đến 10-5 25
Hình 4.7 Đường chuẩn độ pha loãng dịch vi-rút từ 100đến 10-5 26
Hình 4.8 Đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi F7-R7VN 27
Hình 4.9 Đường phát tín hiệu huỳnh quang của mẫu thuyết thanh thực địa 29
Hình 4.10 Hàm lượng vi-rút PRRSV của mẫu H2 và H14 trên đường chuẩn 29
Hình 4.11 Tương quan giữa dịch vi-rút từ Navetco và vacxin IngelVac 30
Trang 11Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi heo có vị trí quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu Hàng năm,37,7% số lượng thịt được cung cấp trên thế giới là thịt heo (Tổ chức Nông lương thếgiới – FAO, 2009) Riêng ở Việt Nam, chăn nuôi heo chiếm 58% GDP nông nghiệphàng năm (FAO, 2011) Hiện nay, ngành chăn nuôi heo đang đối mặt với nhiều dịchbệnh nguy hiểm, một trong số đó là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo(PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome) hay bệnh heo tai xanh Bệnh
do một loại vi-rút gọi là PRRS gây ra, có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi của heo, nhưng tập
dịch địa phương ở nhiều nước trên thế giới (Trung Quốc 80%, Đài Loan là 94,7 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là 97% ) và gây tổn thất lớn cho người chăn nuôihàng trăm triệu đô la
-PRRS bùng nổ tại Việt Nam năm 2007 Qua nghiên cứu giải mã gen vi-rút nàytại Mỹ và Trung Quốc cho thấy, các mẫu vi-rút gây dịch PRRS tại Việt Nam có mứctương đồng về amino axit rất cao, lên tới 99 - 99,7% so với dòng vi-rút PRRS thể độclực cao của Trung Quốc Điều này cho thấy, dòng vi-rút PRRS ở nước ta hiện naythuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống vi-rút PRRS Trung Quốc (Viện chăn nuôi,
bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) Hiện dịch bệnh đã có mặt tại nhiều tỉnh củaViệt Nam và diễn biến phức tạp, vì vậy phát hiện vi-rút PRRS dòng Bắc Mỹ là vấn đềcần thiết phải được thực hiện
Real-time PCR là một kỹ thuật mới, đã được áp dụng rộng rãi nhờ một số tính ưuviệt: phát hiện nhanh, tính đặc hiệu cao, định lượng chính xác Real-time PCR sử dụngmẫu dò Taqman có độ đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện và định lượng vi-rút nhiễmtrên heo ở mức độ thấp, giúp xác định chính xác PRRSV dòng Bắc Mỹ, hỗ trợ việc sửdụng vacxin hiệu quả và công tác phòng chống bệnh Được sự hướng dẫn của PGS.TS
Nguyễn Ngọc Hải và KS Võ Khánh Hưng, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định
tính và định lượng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp dòng Bắc Mỹ trên heo(PRRSV) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman”
Trang 121.2 Yêu cầu
Xây dựng và ứng dụng quy trình Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman
để định tính và định lượng vi-rút PRRS dòng Bắc Mỹ trên heo nhằm phục vụ công tácnghiên cứu
1.3 Nội dung thực hiện
Thiết kế mồi, mẫu dò đặc hiệu dòng PRRSV Bắc Mỹ cho phản ứng Taqmanreal-time RT-PCR
Tiến hành quy trình real-time RT-PCR định tính và định lượng PRRSV dòngBắc Mỹ trên mẫu thực địa
Trang 13Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh gây sảy thai ở heo nái vàrối loạn đường hô hấp trên heo sơ sinh và heo choai (Christianson và ctv, 1992) Bệnhđược phát hiện lần đầu tại Bắc Mỹ và Canada năm 1987, sau đó lan sang châu Âu vàchâu Á vào những năm 1990 (Murakami và ctv, 1994) Ban đầu, bệnh có nhiều tênkhác nhau nhưng đến năm 1992, tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) công nhận tên chínhthức của bệnh là PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome)
Bệnh do vi-rút PRRS gây ra và lây lan tới hầu hết các nước trên thế giới Ở ViệtNam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyếtthanh dương tính) Các nghiên cứu về bệnh trên những trại heo giống tại các tỉnh phíaNam cho thấy tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% chotới 68,29% Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rấtcao, như ở Anh là 60 - 75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú y, 2007)
Bệnh PRRS gây thiệt hại kinh tế lớn do làm tỷ lệ sinh giảm 10 - 15%, giảm sốlượng con sống sót sau sinh, tăng lượng con chết khi sinh, heo hậu bị có thể sinh sảnkém, đẻ sớm, tăng tỷ lệ sảy thai (2 - 3%), bỏ ăn giai đoạn sinh con
đặc biệt là ở heo con cai sữa Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, trong vòng 3 - 5 ngày cảđàn có thể bị nhiễm bệnh Thời gian nung bệnh khoảng 5 - 20 ngày Heo bệnh thường
bị bội nhiễm bởi những bệnh kế phát khác như: dịch tả heo, phó thương hàn, tụ huyết
trùng, E coli, Streptococcus, Mycoplasma spp., Salmonella
2.2 Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo
Vi-rút PRRS thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades, có cấu trúc vỏ bọc dạng chuỗi đơn RNA Arterivirus gần với equine arteritis virus (EAV),
Lactic Dehydrogenase virus (LDHV) và simian hemorrhagic fever virus (SHFV) (Dea
và ctv, 2000)
Trang 142.2.1 Các dòng vi-rút PRRS và sự phân bố của chúng
Hiện nay đã xác định được hai kiểu gen vi-rút chính: dòng châu Âu (vi-rútLelystad hay type EU) và dòng Bắc Mỹ (VR–2332 hay type NA) Type EU chiếm ưuthế tại châu Âu trong khi type NA được tìm thấy ở châu Mỹ (cả miền Bắc và Nam) vàchâu Á (FAO, 2011) Tuy nhiên, bên trong mỗi dòng lại có sự khác nhau về chuỗi hợpchất hữu cơ của protein vi-rút
2.2.2 Biến chủng PRRSV độc lực cao tại Trung Quốc
Thông thường, các dòng vi-rút này gây chết với tỷ lệ thấp, nhưng tháng 7/2006,Trung Quốc đã bùng nổ đợt dịch PRRS và phát hiện biến chủng vi-rút Bắc Mỹ gọi tắt
là HV-PRRS có độc lực cao, tốc độ lây lan và khả năng gây chết cho heo nhanh hơn,chứng tỏ vi-rút đã có sự biến đổi phức tạp Biến chủng vi-rút này có thể gây chết đến20% heo bệnh, kể cả heo trưởng thành Các loại mầm bệnh này đã làm hàng triệu heo
bị ốm, chết và phải tiêu hủy Từ 1/1/2007 đến 22/8/2007, Trung Quốc đã có 826 đợtdịch trên 26 tỉnh thành, làm 257.000 con heo nhiễm bệnh, 68.000 heo bị chết và175.000 con bị tiêu hủy (FAO, 2011) Các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong,Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hưởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủytới 20 triệu heo để ngăn chặn dịch lây (Cục Thú y) Sự biến đổi của vi-rút được giảithích do áp lực chọn lọc và sự thay đổi tập quán chăn nuôi, sự liên kết dịch tễ của một
số lượng lớn động vật và điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm…tại Trung Quốc(FAO, 2011)
Xiaofang Hao (2011) đã nghiên cứu vùng gen ORF7 và Nsp2 của bảy trình tự
gen PRRSV phân lập được từ Trung Quốc và so sánh với 93 trình tự trên ngân hànggen trong đó có 91 trình tự đã phân lập từ Trung Quốc, 1 trình tự Bắc Mỹ VR-2332 vàmột trình tự vi-rút vacxin nhược độc RespPRRS MLV thì thấy có sự mất một số aminoaxit trên protein Nsp2 của 75/100 trình tự Trung Quốc này Ngoài trình tự HB2sh bịmất mười hai amino axit tại vị trí 470 - 481, 74 trình tự còn lại có bốn kiểu đột biếnkhác nhau Sáu mươi bốn trình tự từ ngân hàng gen và sáu trình tự phân lập được(07N, 128, PC, TS, XIN, và XB) bị mất ba mươi amino axit trong đó 1 ở vị trí 482 và
29 amino axit khác tại vị trí 533 - 561 của Nsp2 Trong khi trình tự CG và GDQY2 bị
mất 36 và 29 amino axit tại vị trí 471 - 506 và 533 – 561 thì trình tự YN9 bị mất lầnlượt 25 và 29 amino axit tại vị trí 478 - 502 và 533 - 561 Riêng trình tự Em2007 bịmất amino axit vị trí 499 - 566 Trình tự nt (nucleotide) của 98 trình tự PRRS Trung
Trang 15Quốc trên tương đồng với nhau tới 90,9 - 100% và 88,6 - 100% trình tự amino axit, tất cảđều thuộc dòng Bắc Mỹ Những dòng này có độ tương đồng tới 91,4 - 100% nt và 91,1
- 100% amino axit so với dòng VR-2332 and vacxin RespPRRS MLV còn so với dòngchâu Âu là 67,8 - 71,1% nucleotide và 62,5 - 65,8% amino axit
Hình 2.1 Sự phân bố vi-rút PRRS khu vực Đông Nam Á từ 2007 đến giữa năm 2010
(FAO, 2011).
Hiện nay, dòng HV-PRRS đã lây sang vùng Đông Nam Á Trong năm 2007, ViệtNam và Philipin đều phát hiện sự có mặt của dòng vi-rút này Thái Lan tìm thấy dòngvi-rút độc lực cao năm 2008 nhưng tình hình dịch bệnh bùng phát chậm, năm 2008phát hiện 25 trường hợp đến 2009 tăng nhẹ lên thành 33 Kết quả nghiên cứu củaYoujun Feng và ctv (2007) đã khẳng định dòng vi-rút PRRS tại Việt Nam và TrungQuốc tương đồng với nhau, đều là dòng độc lực cao và bị mất 30 axit amin trong vùng
Trang 16Nsp2 Tại Việt Nam, đồng bằng Sông Hồng và các tỉnh miền Nam là nơi có sự hiện
diện của vi-rút PRRS cao nhất (FAO, 2011)
2.2.3 Cấu trúc vi-rút PRRS
Vi-rút PRRS là vi-rút RNA sợi đơn, thẳng, có vỏ bọc với đường kính 50 – 60 nm,
bề mặt khá nhẵn và có lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25 – 35 nm(Cavanagh, 1997; Cho và Dee, 2006)
Bộ gen vi-rút dài khoảng 1,5kb, gồm chín khung đọc mở (ORFs-open readingframes) gồm ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7
mã hóa cho những thành phần khác nhau của vi-rút Vùng ORF1a và ORF1b dài
1,2kb, chiếm gần 75% bộ gen, mã hóa cho 12 protein không cấu trúc (Nsp - nonstructural protein), từ Nsp1 đến Nsp12, bản chất là các enzyme polymerase giúp cho việc nhân lên của vi-rút, trong đó vùng gen mã hóa Nsp2 có sự biến đổi di truyền chủ yếu trong
sự nhân bản vi-rút (Roongtham Kedkovid, 2010)
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen vi-rút PRRS. ORF1a, ORF1b: Protein không
cấu trúc, ORF2a, ORF3, ORF4 (GP2, GP3, GP4): Protein màng, ORF5 (E):
Protein vỏ ngoài, ORF6 (M): Protein gian màng, ORF7 (N): Protein Capsid
(www.porcilis-prrs.com/images/genome.jpg).
Các khung đọc mở khác gồm ORF2a, ORF2b và các ORF từ 3-7 mã hóa cácprotein cấu trúc GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, M và N một cách chuyên biệt(Xiaofang Hao và ctv, 2011) nhưng chỉ có ba khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trongtổng hợp vi-rút, đó là ORF5, ORF6 và ORF7 Sản phẩm GP2a (mã hóa bởi ORF 2a),GP2b (ORF2b), GP3 (ORF 3), GP4 (ORF 4), và GP5 (ORF5) là những protein được
Trang 17glycosyl hóa Trong khi ORF6 mã hóa protein màng (M) thì nucleocapsid (N) được
mã hóa tại vùng ORF7, có vai trò gây đáp ứng kháng thể sớm nhất (Plana-Duran vàctv, 1997) Đa số các xét nghiệm chẩn đoán bệnh PRRS chủ yếu là phát hiện kháng thểchống lại protein nhân (Mateu và Diaz, 2008)
2.3 Chẩn đoán vi-rút PRRS
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào
Phương pháp nuôi cấy vi-rút được thực hiện trên môi trường đại thực bào túiphôi heo (PAMs: pulmonary alveolar macrophage) và dòng tế bào thận khỉ châu Phi(MARC-145, CL2621) Han-Kook Chung và ctv (2002) cho rằng vi-rút PRRS dòngBắc Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145, còn dòng châu Âu phát triển nhanh hơntrên PAM Phương pháp này cho độ chính xác cao nhưng tốn kém, phức tạp và thờigian xét nghiệm lâu
2.3.2 Phương pháp phát hiện kháng thể
Phương pháp xét nghiệm kháng thể trong huyết thanh như phản ứng kháng thểhuỳnh quang trực tiếp (IFA), phản ứng trung hòa huyết thanh (SNV - serum virusneutralization), và ELISA (enzyme – linked immunosorbent assay) đều được sử dụng choviệc phát hiện kháng thể đặc hiệu với vi-rút PRRS Yoon và ctv (1995) cho rằng IFA có
độ đặc hiệu cao đến 99,5% nhưng độ nhạy khác nhau giữa các cá thể, phụ thuộc vàothao tác xét nghiệm, sự khác biệt giữa kháng nguyên và kháng thể trên cơ thể heo IFA
có thể phát hiện kháng thể vi-rút PRRS trên heo đã nhiễm từ 2- 3 tháng, nhưng khôngthể phát hiện kháng thể vi-rút PRRS ở heo bị nhiễm sau 5 tháng ELISA có độ nhạy vàđặc hiệu cao, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng kháng thể một cách nhanh chóng,đơn giản nhưng tỷ lệ dương tính giả cao Các kỹ thuật phát hiện kháng thể vi-rút cóchung nhược điểm: chỉ cho biết heo bị nhiễm vi-rút từ vacxin hay thực địa chứ khôngchứng minh được vi-rút hiện có tồn tại trong cơ thể heo hay không
2.3.3 Phương pháp RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán phân biệt hai dòng vi-rútPRRS NA và EU trên vùng gen ORF7 của hai dòng này Đây là vùng có tính bảo tồncao và có sự khác biệt lớn giữa hai dòng PRRSV (Egli và ctv, 2001) Hai dòng này có
độ tương đồng về gen khoảng 52 đến 81 % Dựa trên cở sở đó nhiều cặp mồi đã đượcthiết kế đề phát hiện PRRSV nói chung và để phân biệt dòng PRRSV Bắc Mỹ với châu
Trang 18Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Tuy nhiên, RT-PCR khó phát hiện vi-rút PRRS dòng Châu
Âu và không đủ nhạy để phát hiện vi-rút PRRS ở mức nhiễm thấp (Huỳnh Thị ThuHương, 2009)
2.3.4 Phương pháp nested RT-PCR
Phương pháp nested RT-PCR (nRT-PCR) giúp tăng độ nhạy của PCR và pháthiện vi-rút ở hàm lượng thấp nhưng nguy cơ ngoại nhiễm cao do phải mở nắp ốngPCR lần hai (phản ứng inner) để cho sản phẩm PCR lần một vào (sản phẩm phản ứng outer)
2.4 Kỹ thuật real-time PCR chẩn đoán PRRSV
2.4.1 Kỹ thuật real-time PCR
Khác với các kỹ thuật PCR truyền thống, định tính bằng cách điện di trên gelagarose sau khi phản ứng kết thúc, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sựtích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Khả năng này được thựchiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tănglượng DNA tỉ lệ với sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang Chất phát huỳnh quang baogồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệuvới mồi gọi là mẫu dò Kết quả được thiết bị gọi là máy luân nhiệt gắn bộ phận thunhận huỳnh quang thu nhận, cho phép kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi phản ứngxảy ra Tín hiệu huỳnh quang thu nhận được phản ánh lượng sản phẩm khuếch đạitrong mỗi chu kỳ (Bio-Rad)
2.4.2 Các chất phát huỳnh quang sử dụng trong real-time PCR
Có nhiều loại chất phát huỳnh quang được sử dụng nhưng thông dụng nhất làSYBR Green (thuốc nhuộm gắn vào DNA) và mẫu dò Taqman
2.4.2.1 SYBR Green
SYBR Green chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang khi nó ở dạng
tự do trong dung dịch nhưng khi liên kết với mạch đôi DNA, tín hiệu huỳnh quang sẽtăng lên một ngàn lần Ưu điểm của SYBR Green là thiết kế phản ứng đơn giản (chỉcần hai mồi, không cần mẫu dò), kiểm tra được nhiều gen nhanh chóng, chi phí banđầu thấp nhưng đặc tính liên kết với bất cứ DNA mạch đôi nào cũng chính là trở ngạilớn nhất của real-time PCR sử dụng SYBR Green Khi có sự hiện diện của các sảnphẩm không đặc hiệu có thể làm tăng tín hiệu huỳnh quang tổng và ảnh hưởng đến độchính xác của kết quả định lượng Hơn nữa, không thể sử dụng thuốc nhuộm liên kết
Trang 19DNA cho phản ứng mutilplex bởi không thể phân biệt được tín hiệu huỳnh quang từcác sản phẩm khác nhau Chính vì vậy thường phân tích đường cong nóng chảy (melt-curve)
để nhận diện các sản phẩm phản ứng khác nhau trong phản ứng với SYBR Green (Bio-Rad)
2.4.2.2 Mẫu dò phân hủy (Taqman probe)
Mẫu dò Taqman là những trình tự oligonucleotide bổ sung đặc hiệu với DNAđích, dài khoảng 24 đến 30 base với đầu 5’gắn chất phát huỳnh quang (reporter) vàđầu 3’ gắn chất hấp thụ tương ứng (quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang đượcphát ra từ reporter
Hình 2.3 Cấu tạo của mẫu dò Taqman.
(Bio-Rad Laboratories, Inc Real-Time PCR-kỹ thuật và ứng dụng).
Việc chọn reporter phù hợp với quencher rất quan trọng, cần chính xác và hiệuquả Có nhiều loại chất phát huỳnh quang nhưng thường sử dụng cặp chất phát và hấp
thụ huỳnh quang fluorescein (FAM, chất phát màu xanh) và Black Hole Quencher 1.
Ưu điểm của mẫu dò Taqman là rất đặc hiệu, tỉ lệ huỳnh quang phát cao, có khả năngthực hiện các phản ứng đa mồi (Bio-Rad)
Trang 202.4.3 Nguyên lý hoạt động real-time sử dụng mẫu dò Taqman
2.4.3.1 Cơ chế khuếch đại của real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman
Điểm khác biệt quan trọng nhất của real-time PCR so với các kỹ thuật PCR khác
là sử dụng enzyme có hoạt tính 5’-3’ exonuclease Chính nhờ đặc tính này mà enzyme
có thể cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang khi nó tiếp xúc trong quá trình kéo dài
Hình 2.4 Cơ chế phát quang của Taqman trong phản ứng real-time PCR. 1.mồi và probe gắn đặc hiệu vào DNA bắt đầu quá trình kéo dài, 2 enzyme kéo dài DNA, tiếp xúc với đầu 5’ của probe, 3.enzyme cắt đứt đầu 5’ của probe nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease, tín hiệu huỳnh quang bắt đầu phát, 4.quá trình kéo dài kết thúc, probe bị tách hoàn toàn khỏi DNA (http://cgr.otago.ac.nz/SLIDES/TAQMAN/SLD008.HTM).
Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang bị hấp thụ do chúng nằm gầnchất hấp thụ Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA của phản ứng khuếch
đại, mẫu dò liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’-3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của enzyme Taq DNA Polymerase hay Tth DNA Polymerase sẽ cắt
đầu 5’ của mẫu dò và phóng thích chất phát huỳnh quang ra ngoài môi trường Kết quả
là, chất phát huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu (hình2.3) (Bio-rad)
2.4.3.2 Đồ thị khuếch đại tín hiệu huỳnh quang trong phản ứng real-time
Nguyên lý hoạt động của real-time PCR được thể hiện trên đồ thị hình 2.4với mối tương quan giữa trục hoành là số chu kỳ phản ứng còn trục tung là mứchuỳnh quang phát ra của từng phản ứng Đồ thị khuếch đại thể hiện hai giai đoạn:giai đoạn hàm mũ và giai đoạn bão hòa Ban đầu tín hiệu ở mức tín hiệu nền không
Trang 21thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu mặc dù sản phẩm khuếch đại đã tăng theo hàm mũ.Đến thời điểm xác định, tín hiệu huỳnh quang đạt ngưỡng phát hiện của máy, haychu kỳ ngưỡng Ct (threshold cycle), tín hiệu huỳnh quang sẽ liên tục nhân lên theohàm mũ logarit Do chu kỳ ngưỡng được đo lường trong giai đoạn hàm mũ khi cácthành phần phản ứng chưa cạn kiệt nên real-time PCR có thể được sử dụng để tínhtoán một cách chính xác và tin cậy lượng khuôn mẫu ban đầu hiện diện trong phảnứng Khi các thành phần phản ứng trở nên cạn kiệt, phản ứng sẽ bị chậm lại tiến tớigiai đoạn bão hòa (chu kỳ 28-40).
Hình 2.5 Biểu đồ thể hiện các giai đoạn của tín hiệu huỳnh quang trong
2.4.5 Tiêu chuẩn của một phản ứng PCR định lượng tối ưu
PCR định lượng dựa vào mối tương quan giữa mẫu ban đầu và giá trị chu kỳngưỡng Ct thu được từ phản ứng khuếch đại, do vậy tối ưu phản ứng real-time PCR rấtcần thiết cho việc định lượng chính xác và lặp lại thí nghiệm Các tiêu chuẩn của phảnứng real-time PCR tối ưu bao gồm :
Trang 22- Hiệu quả khuếch đại cao: E (efficiency) = 90-105%.
- Mức đồng nhất qua các phản ứng lặp lại
Cách đánh giá hiệu quả mức độ tối ưu của phản ứng real-time PCR là chạy mộtloạt các độ pha loãng bằng nhau và lấy kết quả đó xây dựng đường chuẩn Mẫu thínghiệm có thể đã biết trước nồng độ hoặc chưa biết nồng độ (ví dụ cDNA) Đườngchuẩn được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị giá trị logarit lượng mẫu ban đầu hay hệ sốpha loãng của mẫu chưa biết nồng độ với giá trị ngưỡng thu được trong phản ứngkhuếch đại của từng độ pha loãng Phương trình hồi quy tuyến tính với hệ số tương
giá mức độ tối ưu của phản ứng real-time PCR (Bio-rad)
đường hồi quy, hay chính là mức độ tuyến tính của dữ liệu Mức độ tuyến tính chophép đo lường sự biến thiên giữa các lần lặp lại và hiệu quả khuếch đại trên các mẫu
có lượng ban đầu khác nhau Sự khác biệt lớn của giá trị chu kỳ ngưỡng qua các lần
Đường chuẩn được dựng từ 7 chuẩn ở hình 2.6 với trục tung: chu kỳ ngưỡng – Ct
và trục hoành: giá trị logarit của số lượng bản sao ban đầu (Log Starting Quantity) cóđơn vị là số bản sao (copy number) Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa log sốbản sao ban đầu (X) và chu kỳ ngưỡng (Y) Thông qua chu kỳ ngưỡng được thể hiệnqua hình 2.4, giá trị log số bản sao ban đầu được xác định theo phương trình Y = a.X + b
Đồ thị này còn thể hiện các mẫu dương tính qua các mẫu cần kiểm tra - các hiển thịtương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu trên đường chuẩn Theo Too(2001), số bản sao trình tự đích ban đầu càng nhiều tương ứng với số chu kỳ ngưỡngcàng thấp
Hiệu quả khuếch đại có giá trị gần 100% là chỉ thị tốt nhất cho phản ứng chínhxác và có thể lặp lại Trong thí nghiệm, hiệu quả khuếch đại cần nằ trong khoảng từ90-105% Hiệu quả khuếch đại thấp có thể do mồi không đặc hiệu hoặc phản ứng chưatối ưu Hiệu quả phản ứng trên 100% có thể do thao tác bơm hút mẫu sai trong dãy phaloãng hay sự đồng khuếch đại các sản phẩm không đặc hiệu như cấu trúc nhị trùng củacặp mồi (primer-dimer) Khi hiệu quả khuếch đại trên 105% cần xem lại vấn đề tối ưuquy trình phản ứng hoặc độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò
Trang 23Hình 2.6 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng.
Đối chứng dương: DNA được cho vào PCR mix để sản phẩm khuếch đại có kíchthước và trình tự giống hệt sản phẩm DNA quan tâm Thông thường đối chứng (+) làdung dịch pha loãng ở nồng độ biết trước của plasmid đã được chèn đoạn DNA đích.Đối chứng nội: là DNA khuếch đại song song với DNA đích nhưng có kíchthước khác trình tự DNA đích khác hoàn toàn hoặc khác một phần so với trình tựDNA đích (khi sử dụng mẫu dò) (Phạm Hùng Vân, 2009)
2.4.6 Thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng real-time PCR
Thiết kế mồi cần chú ý những nguyên tắc sau:
- Mồi có hàm lượng GC từ 50-60%
- Tránh cấu trúc thứ cấp, điều chỉnh vị trí mồi ở bên ngoài cấu trúc thứ cấp củatrình tự đích nếu cần
- Tránh lặp lại base G và C hơn 3 lần
- Thiết kế base G và C ở đầu cuối của mồi
- Kiểm tra trình tự của mồi xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp bổsung đầu 3’ (tránh tạo hiện tượng primer-dimer)
Trang 24- Kiểm tra lại sự đặc hiệu bằng các công cụ chuyên dụng như Basic LocalAlignment Search Tool…
Để phản ứng xảy ra tốt, đoạn DNA nên có kích thước khoảng 75 - 200 bp, vì vậy nênthiết kế mồi khuếch đại sản phẩm DNA kích thước này
Thiết kế mẫu dò:
Giống như mọi thí nghiệm định lượng khác, real-time PCR sử dụng mẫu dòTaqman yêu cầu sự khuếch đại hiệu quả và đặc hiệu sản phẩm Nguyên tắc thiết kếmẫu dò cũng tương tự mồi nhưng đặc biệt mẫu dò nên có nhiệt độ bắt cặp cao hơn Tm
Mẫu dò thường ngắn hơn 30 nucleotide và không có base G ở đầu 5’ vì nó có thểhấp thụ tín hiệu huỳnh quang ngay cả khi probe bị cắt đứt Trình tự mẫu dò cần có tỷ
lệ GC khoảng 30 - 80% và có nhiều base C hơn G
2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về PRRSV
2.5.1 Nghiên cứu trên thế giới
Egli và ctv (2001) đã sử dụng kỹ thuật PCR truyền thống và real-time PCR sửdụng Taqman để phát hiện và định lượng hai dòng vi-rút EU và NA của PRRS và xác
Wasilk và ctv (2004) so sánh độ nhạy và đặc hiệu trong phát hiện vi-rút PRRScủa kỹ thuật real-time PCR so với nested PCR trên mẫu huyết thanh và tinh dịch giữa,kết quả nghiên cứu cho thấy real-time RT-PCR phát hiện lượng vi-rút ở giới hạn thấphơn, độ nhạy được quan sát vào khoảng 33 bản sao/ml
Lurchachaiwong và ctv (2008) sử dụng real-time RT-PCR để phát hiện nhanh vàxác định hai dòng NA và EU của vi-rút PRRS với SYBR Green I, Taqman và giải
Xiao và ctv (2008) phát hiện PRRSV gây độc lực cao gây ra trận dịch lớn tạiTrung Quốc năm 2006 bằng kỹ thuật real-time PCR với mẫu dò Taqman Kết quả cho
2.5.2 Một số nghiên cứu tại Việt Nam
Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân (2007) tiến hành khảo sát 1082 mẫu huyếtthanh tại 21 trại chăn nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi thuộc hai tỉnh miền Đông
Trang 25Nam Bộ từ 2003 - 2005 nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi-rút PRRS khu vực này bằng kỹthuật ELISA phát hiện kháng kháng thể Kết quả đã xác định tỷ lệ heo nhiễm PRRSVhai tỉnh này là 36,78% và 85,71%.
Kim Văn Phúc và ctv (2007) khảo sát 23 mẫu nghi nhiễm PRRSV bằng kỹ thuậtnested RT-PCR, kết quả các mẫu nhiễm dòng Bắc Mỹ, không có mẫu nhiễm dòngchâu Âu
Nhóm các nhà khoa học Việt Nam và Trung Quốc đã xác định đặc tính của dòngvi-rút phân lập từ các ổ dịch trên heo xảy ra tại Việt Nam năm 2007, có sự tương đồng
bộ gen khoảng 99%, các dòng này đều bị mất 30 amino axit trên protein không cấutrúc số 2 (nsp-2) (Feng và cs, 2009)
Lê Thanh Hòa và ctv (2008) phân tích trình tự ORF6 trên mẫu heo bệnh tạiQuảng Nam (TXMT1), kết quả cho thấy TXMT1 này thuộc type NA, có tỷ lệ đồngnhất về thành phần nucleotide và tỷ lệ tương đồng về amino axit rất cao (99 - 100%)với các dòng của Trung Quốc; thấp hơn so với dòng VR2332 (94 % về nucleotide, 96
%về aa); và rất thấp với dòng Lelystad (69 % nucleotide; 79 % aa) Điều này cho thấydòng TXMT1 của Việt Nam có biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phátsinh với các dòng PRRSV độc lực cao của Trung Quốc
Huỳnh Thị Thu Hương (2009) sử dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi-rút PRRStrên các mẫu cho ELISA dương tính và trên máu, kết quả mẫu cho thấy chỉ nhiễmPRRSV type NA với tỷ lệ 19,89% và khả năng phát hiện vi-rút trong máu cao hơntrong huyết thanh
Theo Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2010), phân tích ORF5 của vi-rút PRRS tại ĐồngNai và Tp.HCM cho thấy chúng thuộc nhóm Bắc Mỹ, cùng nhóm với chủng vi-rútPRRS độc lực cao của Trung Quốc So sánh trình tự aa của protein GP5 giữa cácchủng PRRSV Tp.HCM và Đồng Nai với chủng vacxin BSL-PS100 cho thấy không có
sự đột biến mất hay thêm vào, có khác biệt lớn tại vùng peptide tín hiệu (aa 1-31),vùng chức năng trung hòa sơ cấp, vùng chức năng không trung hoà và mang tính trộimiễn dịch
Các nghiên cứu về PRRS tại Việt Nam đã xác định phần lớn vi-rút gây bệnhPRRS ở nước ta thuộc dòng Bắc Mỹ bao gồm cả nhóm Bắc Mỹ cổ điển và biến chủngđộc lực cao có nguồn gốc từ Trung Quốc