ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM

Thuộc giống VibrioPhẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di dộngPhát triển ở nhiệt độ 420C, có thể tồn tại cả ở nước mặn và nước ngọt Phát triển nhanh trong thực phẩm ở nhiệt độ thường và trong thực phẩm giữ lạnh đông lạnh nhưng ở điều kiện khô không sống quá 48hRất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng bằng đun nấu.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

GIỚI

THIỆU

NỘI DUNG

Giới thiệu về Vibrio Cholerae

- Thuộc giống Vibrio

- Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di dộng

- Phát triển ở nhiệt độ 420C, có thể tồn tại cả ở nước mặn và nước ngọt

- Phát triển nhanh trong thực phẩm ở nhiệt độ thường và trong thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh nhưng ở điều kiện khô không sống quá 48h

- Rất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng bằng đun nấu

V cholerae gây bệnh dịch tả do vệ sinh kém, nguồn nước ô

nhiễm, nhưng cũng có thể gây ngộ độc thực phẩm

Các chủng V.cholerae gây dịch chủ yếu thuộc 2 nhóm huyết

thanh O1 và O139

Hình ảnh về Vibrio cholerae dưới kính hiển vi sau khi

được nhuộm màu

1 Giới thiệu về Vibrio Cholerae

Cholerae lên men không sinh khí,

có khả năng làm dịch hóa gelatin

Có khả năng khử nitrat thành nitrit

và phân giải trytophan thành indol

Vibrio cholerae phát triển được ở

vùng có nồng độ muối cao 3%

Có khả năng lên men đường glucose,

sucrose,mannose, khử lysine

Cách thức sinh trưởng của Vibrio cholerae Cách thức sinh trưởng:

Nguyên tắc

 Phát hiện V.cholera trong thực phẩm được

thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường chọn lọc.

 Những khuẩn lạc giống V.cholera sẽ được

thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.

Phạm vi áp dụng: TCVN 7905-1:2008

Môi Trường & Hóa Chất

Môi trườ ng và hóa chất Mục đích

APW ( Alkaline Phosphat Water ) Tăng sinh chọn lọc

TCBS ( Thiosulphate citrate bile salt

Dung dịch NaCl

Môi Trường & Hóa Chất

Môi trườ ng và hóa chất Mục đích

Arginine dehydrolase Thử nghiệm sinh hóa để

khẳng địnhOrnithine decacboxylase

Môi Trường APW

Natri clorua (NaCl) 10,0 g

Phục hồi sức sống các VSV bị tổn thương và nhằm gia tăng mật độ tương đối của VSV cần phát hiện,

ức chế sự phát triển VSV ko mong muốn.

Môi Trường TSA

Môi Trường TSI

Dịch chiết thịt 3,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g

Quy trình phân tích

 Bước 1: Đồng nhất mẫu

Cân vô trùng 25g mẫu hải sản vào túi PE đã vô trùng Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rời rồi thêm 225ml nước pepton kiềm APW trong túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút Ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 370C 1,00C và 420C ,20C trong 6 – 24h

Tiến hành phân tích

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng , sau đó thêm 225 ml dung dịch pha loãng APW

Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu.

Thời gian dập mẫu là 60s

 Bước 2: Tăng sinh

a Đối với mẫu thông thường

Ủ các bình chứa đã chuẩn bị ở nhiệt độ 370C 1,00C trong 6 – 8h Sau

đó, phân lập như qui định, phần còn lại ủ tiếp 16 – 24h rồi phân lập lại

b Đối với mẫu hàu

Ủ một dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 370C 1,00C trong 6 – 8h

và 16 – 24h

Ủ một dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 420C ,20C trong 6 – 8h

Tiến hành phân tích

Tăng sinh lần 1: Ủ các bình chứa đã chuẩn bị ở nhiệt độ 37oC

trong 6-8h Sau đó mang đi phân lập

Tăng sinh lần 2: Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong tăng sinh

lần 1 (được lấy từ bề mặt) cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi

trường APW Ủ trong môi trường APW ở nhiệt độ 37oC trong

24h

 Bước 3: Phân lập và đọc kết quả trên đĩa

- Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên, không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch Ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 370C 1,00C trong 18 – 24h

- Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng (tròn, hơi dẹt, bóng vàng, ở giữa đậm và

có viền mờ xung quanh)

- cấy ria lên môi trường không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ở

370C để thu sinh khối cho các thử nghiệm hóa sinh

Tiến hành phân tích

 Từ môi trường tăng sinh Dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối trên môi trường tăng sinh APW và cấy ria lên bề mặt thạch TCBS

để phân lập các khuẩn lạc đơn Ủ 37oC trong 24h

Sau khi ủ kiểm tra các đĩa Trên môi trường thạch TCBS khuẩn lạc V.cholera tròn, lớn có màu vàng (dương tính saccaro), đường kính 2-3mm

V Cholerae trên TCBS

Tiến hành phân tích

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS Nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ thì lấy tất cả các khuẩn lạc đó cấy ria lên môi trường dinh dưỡng TSA có bổ sung 1,5% muối NaCl Sau đó ủ ở

Thử nghiệm sinh hóa

TN sinh hóa sơ bộ

TN sinh hóa khẳng định

Kháng huyết

thanh

Bước 5

TN sinh hóa sơ bộ

 Thử nghiệm tính chịu mặn

Tiến hành: Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA

vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng

độ NaCl là: 0; 2; 6; 8 và 10 % Nuôi ủ ở nhiệt độ

37oC trong 18 - 24 giờ.

Tiến hành: Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA

vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng

độ NaCl là: 0; 2; 6; 8 và 10 % Nuôi ủ ở nhiệt độ

37oC trong 18 - 24 giờ.

Kết quả: V cholerae phát triển được trong ống

canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 2% và làm

đục môi trường Ở nồng độ muối cao hơn

V.cholera không phát triển nên kết quả âm tính.

Kết quả: V cholerae phát triển được trong ống

canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 2% và làm

đục môi trường Ở nồng độ muối cao hơn

V.cholera không phát triển nên kết quả âm tính.

TN sinh hóa sơ bộ

 Thử nghiệm khả năng di động

Tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn từ

môi trường TSA cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường Ủ ở 37oC trong 24h

Tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn từ

môi trường TSA cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường Ủ ở 37oC trong 24h

Đọc kết quả: Dương tính: Virio Cholera mọc lan

khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung

quanh.

Đọc kết quả: Dương tính: Virio Cholera mọc lan

khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung

quanh.

Đặt giấy lọc lên một nắp

đĩa petri, nhỏ 2 -3 giọt

thuốc thử oxidaza Dùng

que cấy vô trùng lấy các

khuẩn lạc từ môi trường

TSA ria lên vị trí đã nhỏ

que cấy vô trùng lấy các

khuẩn lạc từ môi trường

TSA ria lên vị trí đã nhỏ

 Nhuộm gram

V Cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.

TN sinh hóa sơ bộ

• Các phép thử nghiệm sơ bộ

 TN Indol

Tiến hành: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường

chứa 5ml dung dịch môi trường muối trytophan Ủ 37oC trong 24h Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử

Kowac’s.

Tiến hành: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường

chứa 5ml dung dịch môi trường muối trytophan Ủ 37oC trong 24h Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử

Kowac’s.

Kết quả: Phản ứng dương tính khi hình thành vòng

tròn đỏ (hình thành idol).

Vòng màu nâu- vàng phản ứng âm tính.

Kết quả: Phản ứng dương tính khi hình thành vòng

tròn đỏ (hình thành idol).

Vòng màu nâu- vàng phản ứng âm tính.

TN sinh hóa khẳng định

 Thử nghiệm ONPG

TN sinh hóa khẳng định

 Thử nghiệm ONPG

Tiến hành: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 0,25 ml dung

dịch muối Thêm 1 giọt toluen và lắc đều để yên 5 phút

Thêm 0,25 ml thuốc thử ONPG và trộn Ủ ở 37 0C, trong 24 h 

3 h, kiểm tra liên tục

Kết quả: Màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính (có mặt galactoxidaza) Phản ứng thường xảy ra sau 20 min Sau 24 h không có màu chứng tỏ phản ứng âm tính

-TN sinh hóa khẳng định

 Thử nghiệm TSI/KIA

Tiến hành: Dùng que cấy lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và cấy ria theo

mặt nghiêng của thạch Ủ ở 37 0C trong 24 h  3 h

Tiến hành: Dùng que cấy lấy các khuẩn lạc từ môi trường

TSA Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và cấy ria theo

mặt nghiêng của thạch Ủ ở 37 0C trong 24 h  3 h

Kết quả: Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch

nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S

Kết quả: Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch

nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S

Trên môi trường KIA, V.cholerae làm phần thạch nghiêng

có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và

không sinh H2S

Trên môi trường KIA, V.cholerae làm phần thạch nghiêng

có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và

không sinh H2S.Trên môi trường KIA (trái), môi trường TSA (phải)

Phép thử Phản ứng tiêu biểu của

TN kháng huyết thanh

Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt

nước muối

O nhóm 1 Bảng 1 – Phân biệt V cholerea O1 và V cholerae non – O1

Bảng 2 – Phân biệt các kiểu chủng huyết thanh chủng V cholerea O1

Kháng

nguyên Kháng huyết

thanh Inada

Kháng huyết thanh Ogawa

Dung dịch muối sinh

Đọc kết quả

Phát hiện hoặc không phát hiện được V.cholera trong 25

g mẫu.

Thank You!

 TN lên men – oxy hóa

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh – Leifson glucoza hoặc O/F glucoza Phủ khoảng 1 – 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống Ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 370C trong 1 – 2 ngày

V cholerae lên men glucoza làm môi

trường Hugh – Leifson từ màu tím

chuyển thành vàng Môi trường O/F từ màu xanh thành vàng

TN sinh hóa sơ bộ

TN sinh hóa khẳng định

 TN phát triển ở nhiệt độ

Cấy vi khuẩn từ TSA vào

một ống canh thang trypton

TN sinh hóa khẳng định

 TN cacbonhydrat

Phản ứng dương tính khi môi

trường có màu vàng, âm tính khi

môi trường giữ nguyên màu đỏ.

V Cholerae cho phản ứng

sacaroza, manniton, mannoza

dương tính và lactoza, cellobiza,

arabinoza âm tính

Lên men đường manniton (+) vàng hoặc vàng với bong bóng khí,

(-) đỏ

TN sinh hóa khẳng định

 TN ure

Mục đích: xác định sự hiện diện của enzyme urease ở vi sinh

vật thông qua khả năng phân hủy urea

Cơ chế: Urea + H2O Œ CO2 + H2O + NH3

Sản phẩm tạo thành là ammonia carbonat làm đổi màu chất chỉ thị

Tiến hành: Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ ở

nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ V.cholerae cho phản ứng âm

tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng

Có thể dùng đĩa ONPQ thay cho thuốc thử ONPQ Hòa tan

khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh

lý Đặt đĩa ONPQ vào đáy ống rồi ủ ẩm và đọc kết quả như trên

V cholera cho phản ứng ONPQ dương tính khi dung dịch có

ờ Nguyên tắc: xác định khả năng của một vi sinh vật

có khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid như ornithin,

lysin hay arginin làm kiềm môi trường nuôi cấy.

ng & Hóa Chất

Thử nghiệm Oxidase +