Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, cynarosid và scolymosid trong lá actisô bằng phương pháp uhplc pda

Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây, dịch chiết lá Actisô còn cótác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng u, kháng HIV… Nhìn chung, ở nướcngoài có rất nhiều công trình nghiên cứu về

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA

Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

Tp Hồ Chí Minh, 02/2019

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

1 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

2 Trần Văn Quyền

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

ĐẶT VẤN ĐỀ viii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 10

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA 10

1.1.1 Vị trí phân loại 10

1.1.2 Hình thái thực vật 11

1.1.3 Phân bố sinh thái 14

1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản 14

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA 15

1.2.1 Dẫn xuất caffeoylquinic 15

1.2.2 Flavonoid 16

1.2.3 Sesquiterpen lacton 17

1.2.4 Inulin 18

1.2.5 Các thành phần khác 18

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ 19

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 19

1.3.2 Tác dụng trên gan mật 19

1.3.3 Tác dụng làm giảm cholesterol 20

1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm 20

1.3.5 Tác dụng trên tim mạch 20

1.3.6 Tác dụng trên hệ tiêu hóa 21

1.3.7 Tác dụng kháng viêm 21

1.3.8 Tác dụng kháng ung thư 21

1.3.9 Tác dụng kháng HIV 21

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ 22

1.4.1 Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV 22

1.4.2 Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu 22

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOL

TRONG ACTISÔ BẰNG HPLC 24

1.5 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG 28

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

1.6 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30

1.6.1 Nguyên liệu 30

1.6.2 Dung môi, hóa chất 31

1.6.3 Thiết bị, dụng cụ 31

1.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

1.7.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid trong lá Actisô bằng UPLC 32

1.7.2 Đánh giá quy trình định lượng 35

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

2.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CY, AC, SCO, CR TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG UPLC-PDA 41

2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký UPLC 41

2.1.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất lá Actisô 48

2.1.3 Quy trình định lượng CY, AC, CR và SCO 53

2.2 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 54

2.2.1 Khảo sát độ tinh khiết của các chất đối chiếu 54

2.2.2 Tính tương thích của hệ thống 57

2.2.3 Tính tuyến tính 59

2.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 61

2.2.5 Khảo sát tính chọn lọc 62

2.2.6 Khảo sát độ lặp lại 63

2.2.7 Khảo sát độ đúng 66

2.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AC, CY, SCO, CR TRONG ACTISÔ 68

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75

3.1 KẾT LUẬN 75

3.2 ĐỀ NGHỊ 75

CHƯƠNG 4 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loài trong chi Cynara 10

Bảng 1.2 Các đặc điểm hình thái của 9 kiểu gen của loài Actisô trồng 12

Bảng 1.3 Chương trình HPLC phân tích các hợp chất phenol 25

Bảng 1.4 Một số điều kiện định lượng các hợp chất trong Actisô bằng HPLC 26

Bảng 2.5 Một số chế phẩm trên thị trường 30

Bảng 2.6 Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích 38

Bảng 2.7 Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích 39

Bảng 3.8 Chương trình chạy tiệm tiến được lựa chọn 45

Bảng 3.9 Bảng so sánh 2 điều kiện HPLC và UPLC 48

Bảng 3.10 Bảng độ tan của AC, CY, SCO, CR 49

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết của AC, CY, SCO, CR 50

Bảng 3.12 Bảng khảo sát thời gian chiết của AC, CY, SCO, CR 51

Bảng 3.13 Bảng khảo sát số lần chiết của AC, CY, SCO và CR 52

Bảng 2.14 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập 55

Bảng 2.15 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của cynarosid phân lập 56

Bảng 3.16 Độ tinh khiết của các chất chuẩn 57

Bảng 3.17 Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu thử 57

Bảng 3.18 Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu chuẩn 58

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của AC, CY, SCO, CR 62

Bảng 3.22 Độ lặp lại acid clorogenic 64

Bảng 3.23 Độ lặp lại của cynarin 64

Bảng 3.24 Độ lặp lại của scolymosid 65

Bảng 3.25 Độ lặp lại của cynarosid 65

Bảng 3.26 Tóm tắt độ lặp lại và hàm lượng của các chất định lượng 65

Bảng 3.27 Kết quả độ đúng của acid clorogenic 66

Bảng 3.28 Kết quả độ đúng của cynarin 66

Bảng 3.29 Kết quả độ đúng của scolymosid 67

Bảng 3.30 Kết quả độ đúng của cynarosid 67

Bảng 31 Tóm tắt tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí phân loại của Actisô 10

Hình 1.2 Vị trí phân loại của Actisô trong loài Cynara cardunculus L 11

Hình 1.3 Các thế hệ lai F1 của Cynara Cardunculus L 13

Hình 1.4 Dẫn xuất của acid caffeoylquinic 16

Hình 1.5 Dẫn xuất Flavonoid 17

Hình 1.6 Dẫn xuất Sesquiterpen lacton 17

Hình 1.7 Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu của Actisô 25

Hình 1.8 Sắc ký đồ dịch chiết lá và hoa Actisô 26

Hình 1.9 Một số chế phẩm trên thị trường 29

Hình 3.10 Sắc ký đồ của AC, CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 323 nm 41

Hình 3.11 Sắc ký đồ của AC,CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 349 nm 41

Hình 3.12 Phổ hấp thu UV của acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid 42

Hình 3.13 SKĐ khảo sát dung môi pha động 42

Hình 3.14 SKĐ khảo sát chương trình chạy 44

Hình 3.15 SKĐ khảo sát tốc độ dòng 45

Hình 3.16 SKĐ khảo sát nhiệt độ cột 46

Hình 3.17 SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp HPLC 47

Hình 3.18 SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp UPLC 47

Hình 3.19 Biểu đồ độ tan của AC, CY, SCO và CR 48

Hình 3.20 SKĐ của 2 dung môi chiết EtOH 70% và Nước 49

Hình 3.21 Biểu đồ nhiệt độ chiết AC, CY,SCO và CR 50

Hình 3.22 SKĐ của 2 nhiệt độ chiết 60 o C và 100 o C 50

Hình 3.23 Biểu đồ thời gian chiết AC, CY, SCO và CR 51

Hình 3.24 Biêu đồ các lần chiết AC, CY, SCO và CR 52

Hình 2.25 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của acid clorogenic phân lập 55

Hình 2.26 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của cynarosid phân lập 56

Hình 3.28 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử 57

Hình 3.29 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn 57

Hình 3.30 Đường tuyến tính của acid clorogenic 59

Hình 3.31 Đường tuyến tính của cynarin 60

Hình 3.32 Đường tuyến tính của scolymosid 60

Hình 3.33 Đường tuyến tính của cynarosid 61

Hình 3.34 sắc ký đồ của acid clorogenic ở nồng độ LOD 62

Hình 3.35 Sắc ký đồ của cynarin ở nồng độ LOD 62

Hình 3.36 Sắc ký đồ của cynarosid ở nồng độ LOD 62

Hình 3.37 Sắc ký đồ của acid scolymosid ở nồng độ LOD 62

Hình 3.38 Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc 62

Hình 3.39 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của acid clorogenic 63

Hình 3.40 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarin 63

Hình 3.41 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của scolymosid 63

Hình 3.42 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarosid 63

Hình 3.43 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của acid clorogenic và cynarin 64

Hình 3.44 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của scolymosid và cynarosid 64

Hình 3.45 Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên hàm lượng lá tím 69

Hình 3.46 Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên lá trắng 69

Hình 3.47 Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá tím 70

Hình 3.48 Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá trắng 70

Hình 3.49 Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá tím 71

Hình 3.50 Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá trắng 71

DĐVN Dược điển Việt Nam

LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) PDA Photo Diod Array Detector (Đầu dò dãy diod quang)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Actisô (Cynara scolymus L.) là loại cây thảo sống nhiều năm có nguồn gốc từ miền

nam Châu Âu Diện tích trồng Actisô khoảng 125.000 ha/năm và sản lượng hàngnăm là 1,42 triệu tấn Trong đó, Tây Ban Nha (25.000 ha), Ý (50.000 ha) và Pháp(13.000 ha) đóng góp vào khoảng 75% tổng diện tích trồng [40]

Trên thế giới, Actisô được dùng làm thuốc và thực phẩm chức năng để trị các bệnh

về gan, mật Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây, dịch chiết lá Actisô còn cótác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng u, kháng HIV… Nhìn chung, ở nướcngoài có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây Actisô, điển hình có các nghiên cứu

về thành phần hóa học, tác dụng dược lý, phương pháp định tính, định lượng cáchợp chất chính (các flavonoid và dẫn xuất acid caffeoyl quinic), và một số thử nghiệmtrên lâm sàng như hiệu quả làm giảm triệu chứng khó tiêu và hạ cholesterol [41].Tại Việt Nam, rất nhiều chế phẩm từ Actisô với số lượng và chất lượng khác nhau,

đa dạng về hình thức từ trà túi lọc đến các dạng thuốc viên, thuốc sủi, thuốc nước đểuống Do đó, việc kiểm tra chất lượng của các sản phẩm này cần được quan tâm.Dược điển Việt Nam IV định lượng cynarin bằng phương pháp đo phổ tử ngoại(UV) Tuy nhiên phương pháp này có độ chọn lọc không cao vì trong lá Actisôngoài cynarin còn có các đồng phân khác đều có cùng phổ UV Vì vậy, cần mộtphương pháp hiện đại để định lượng chính xác hàm lượng hoạt chất có trong Actisô.Ngoài ra, cũng cần định lượng acid clorogenic, scolymosid và cynarosid – khôngnhững là các chất chứa hàm lượng đáng kể trong Actisô mà còn có tác dụng đángchú ý của Actisô như tác dụng chống oxy hoá và hạ cholesterol Nhóm nghiên cứu

đã có công trình công bố định lượng đồng thời 4 chất trên bằng phương pháp HPLC [44] Tuy nhiên, ngày nay hệ thống máy UHPLC ra đời với nhiều ưu điểmhơn so với HPLC là tốc độ phân tích nhanh, độ nhạy và độ phân giải tốt hơn, tiếtkiệm dung môi Gần đây, với nhu cầu phân tích ngày càng nhiều nên một số nơinhư trung tâm kiểm nghiệm, viện kiểm nghiệm các tỉnh thành và một số xí nghiệpbắt đầu có nhu cầu sử dụng hệ thống này và sẽ tăng dần trong tương lai

PDA-Do đó để có thể đáp ứng được với nhu cầu trên, đề tài “Xây dựng quy trình địnhtính, định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid trong

lá Actisô bằng phương pháp UPLC-PDA” được thực hiện với các mục tiêu chínhnhư sau:

1 Xây dựng qui trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic,cynarosid, scolymosid có trong lá Actisô bằng UPLC-PDA

2 Khảo sát hàm lượng hoạt chất theo các điều kiện làm khô khác nhau

3 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng thay đổi hoạt chất theo từng thời vụ thu háikhác nhau

4 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng hoạt chất theo từng bộ phận cây

5 Đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số chế phẩm từ lá Actisô

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín của A L Takhtajan công bố năm

1987 và đã sửa đổi năm 2009, vị trí của chi Cynara thuộc họ Asteraceae như sau

(Hình 1.1) [9], [31]

Bảng 1.1 Một số loài trong chi Cynara Một số loài trong chi Cynara [16], [32]

1 Cynara alba Boiss ex DC.

2 Cynara algarbiensis Coss ex Mariz

3 Cynara auranitica Post

4 Cynara baetica (Spreng.) Pau

5 Cynara cardunculus L.

6 Cynara cornigera Lindl.

7 Cynara Cyrenaica Maire & Weiller

8 Cynara humilis L.

9 Cynara hystrix Ball

10 Cynara kurdica Handel-Mazzetti

11 Cynara pygmaea Willd

12 Cynara senneni Pau ex Sennen

13 Cynara sibthorpiana Boiss & Heldr Diagn

14 Cynara syriaca Boiss Hình 1.1 Vị trí phân loại của Actisô

Trong cách phân loại trước đây, theo Rottenberg và Zohary (1996) Cynara

cardunculus L var sylvestris (Lamk) Fiori là tổ tiên của Actisô trồng hiện nay

(globe Artichoke) [var Sativa Moris, var Scolymus (L.) Fiori, ssp scolymus (L.)

Hegi] và rau ca đông lá rậm (leafy cardoon) hay rau ca đông trồng (cultivated

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliosida)

Phân lớp Cúc (Asteridae) Liên bộ Cúc (Asteranae)

Chi Cynara L.

Bộ Cúc (Asterales)

Họ Cúc (Asteraceae)

cardoon) (var altilis DC) [42].

Dựa trên nghiên cứu về đặc điểm hình thái của cây Actisô, Wiklund và cộng sự(1992) đã khẳng định rằng Actisô trồng (globe Artichoke), rau ca đông lá rậm (leafy

cardoon) và rau ca đông dại (wild cardoon) đều cùng 1 loài duy nhất là Cynara

cardunculus L

Gần đây, Pignone và Sonnante (2004) đã nghiên cứu về sinh hóa và chất đánh dấu

hóa học để phân loại Cynara cardunculus L như mô tả ở Hình 1.2, gần giống với

cách phân loại của Wiklund (1992):

Hình 1.2 Vị trí phân loại của Actisô trong loài Cynara cardunculus L.

Trong đó, Cynara cardunculus var sylvestris (Lam.) Fiori là tổ tiên của 2 loài var.

scolymus (L.) Fiori và var altilis DC.

1.1.2 Hình thái thực vật

Tên nước ngoài: artichaut (Pháp), artichoke (Anh), artischoke (Đức).

Tên Việt nam: Actisô

Tên khoa học: Cynara scolymus L Họ Asteraceae.

Nguồn gốc: Actisô là một loại thực vật cổ xưa có thể ăn được, gần với chi carduus.

Về nguồn gốc, loại thực vật này được tìm thấy ở khu vực phía bắc Châu phi Cho đếnthế kỷ 15, loài này mới được đưa từ Sicile vào Châu âu và được trồng ở Pháp, Anh vàĐức Cho đến đầu thế kỷ 20 thì mới thấy có những báo cáo sử dụng cây Actisô làm

var scolymus (L.) Fiori

Actisô trồng (Globe Artichoke)

var sylvestris (Lam.) Fiori

Actisô dại (Wild Artichoke)

var altilis DC

Actisô lá rậm (Leafy cardoon)

Cynara cardunculus L.

Thực vật học: là loại cây thân thảo lâu năm có nguồn gốc từ vùng Địa trung hải.

Phần dưới đất là một thân rễ to với một hệ thống rễ chằng chịt Thân cây thẳngđứng, có rãnh, phân nhánh và dài từ 1m đến 1,5 m Trong năm đầu tiên, các lá xếptheo hình hoa thị, lá to rộng, xanh xám, xẻ thùy sâu, gân lá nổi, không có gai,trắng và có lông ở mặt dưới Năm thứ hai xuất hiện thân cây, phía trên thân cónhững lá to hoàn chỉnh, các lá nhỏ dần từ gốc đến ngọn và tận cùng là những lákhông có cuống Lá có thể dài đến 1 m Các hoa màu xanh tím, hình ống, đặt trênmột cụm hoa màu xanh lá cây hoặc màu tím (hoa đầu) Các hoa lưỡng tính vàthường xuất hiện trong năm thứ hai Đầu cụm hoa rất lớn, có đường kính hơn 10 cmbao gồm một đế hoa, với sợi lông tua tủa, tụm lại ở đế hoa và tủa ra ở đầu Quả hìnhtrứng, nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng Hạt không có nội nhũ [7], [29].Hình thái thực vật của Actisô rất đa dạng tùy theo giống và kiểu gen khác nhau.Sara Lombardo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về mặt sinh học và hình thái sinh

học của loài dựa trên 9 kiểu gen Bảng 1.2 cho thấy các kiểu gen ảnh hưởng đến

kích thước, hình dạng (chỉ số chiều dài/ đường kính) của hoa và màu sắc bên trongngoài của lá bắc [43]

Bảng 1.2 Các đặc điểm hình thái của 9 kiểu gen của loài Actisô trồng Kiểu gen lượng tươi Khối

tỉ lệ chiều dài/ đường kính

Màu lá bắc ngoài bắc trong Màu lá Lá bắc

Concerto 201 ± 4 1,25 ± 0,08 tím đậm vàng lámạ không gai

Harmony F 1 225 ± 17 1,15 ± 0,01 xanh lá vàng không gainhưng có đầu

nhọn Madrigal F 1 219 ± 37 1,15 ± 0,03 xanh lá vàng không gai

Romanesco clone

C3 144 ± 5 1,05 ± 0,03 tím ánhxanh lá

vàng lá

mạ ánh tím không gaiTema 2000 167 ± 3 1,25 ± 0,03 tím đậm vàng ánh

tím

không gai nhưng có đầu nhọn

Tempo 176 ± 66 1,30 ± 0,03 tím ánhxanh lá vàng tím không gai

Tondo di

Paestum 210 ± 50 1,00 ± 0,02

tím ánh xanh lá nhạt vàng tím không gaiViolet de

Provence 125 ± 1 1,45 ± 0,10 tím ánhxanh lá vàng tím không gai

Violetto di Sicilia 122 ± 22 1,45 ± 0,05 xanh lá ánhtím vàng lámạ không gai

Trên thế giới, có 3 cây phổ biến là Actisô trồng var scolymus (globe Artichoke-hoa tròn), rau ca đông trồng var altilis (cultivated cardoon – hoa dài) và tổ tiên của chúng var sylvestris Trong đó, Actisô hoa tròn (globe Artichoke) thường được

trồng để lấy hoa trưởng thành còn Actisô hoa dài (cultivated cardoon) thường lấy látươi và thân Ngày nay, xuất hiện nhiều thế hệ lai F1 của chúng đa dạng về hình

1.1.3 Phân bố sinh thái

Phân bố: Actisô là giống cây tự nhiên của lưu vực Địa Trung Hải và được biết đến

từ thế kỷ thứ tư trước công nguyên như thức ăn và còn được sử dụng làm thuốc.Người Ả Rập đóng vai trò quan trọng trong việc di thực loài này đến vùng Nam ĐịaTrung Hải vào thời Trung Cổ Actisô có vị trí quan trọng trong ngành nông nghiệpcủa vùng Địa Trung Hải với hơn 800.000 ha đất trồng trọt và sản lượng thu họachhàng năm lên đến khoảng 770.000 tấn (chiếm 70% sản lượng toàn cầu) Italia dẫnđầu thế giới về sản lượng Actisô (474.000 tấn/năm), tiếp đến là Tây Ban Nha(215.000 tấn/năm), Pháp (55.000 tấn/năm), Hy Lạp (25.000 tấn/năm) Actisô cũngđược trồng ở vùng Cận Đông (Thổ Nhĩ Kỳ và Iran), Bắc Phi (Ai Cập, Morocco,Algeria, Tunisia), Nam Mỹ (Argentina, Chilê và Pêru), Hoa Kỳ (chủ yếu là ở vùngCalifornia) và còn được trồng ở Trung Quốc [25] Ở Việt Nam, Actisô được ngườiPháp di thực vào thế kỷ thứ 19 và được trồng ở Sapa (Lào Cai), Tam Đảo (VĩnhPhúc) và Đà Lạt (Lâm Đồng)

Trồng trọt: Actisô ưa khí hậu ẩm mát quanh năm Nhiệt độ thích hợp khoảng 15–18

ºC Ở Việt nam, thường trồng ở độ cao 1.000–1.500 m so với mặt biển Actisô làcây sinh trưởng mạnh, cho nên cần chọn đất dày màu, thoát nước và bón nhiều phân

Ở Việt nam, Actisô chủ yếu được trồng bằng chồi nhánh và hiện nay chưa thể thuhoạch hạt và trồng bằng hạt

Sau khi làm đất nhỏ, lên luống cao 20-25 cm, mặt luống rộng 40 cm, bổ hốc cáchnhau 70-80 cm thành một hàng giữa luống Dùng 10-15 tấn phân chuồng mục đểbón lót cho 1 ha, thúc bằng nước phân chuồng hoặc phân đạm 2-3 lần tùy tình hìnhsinh trưởng của cây Tưới thúc lần thứ nhất 15 ngày sau khi trồng, lần thứ hai cáchlần trước khoảng 20 ngày Nếu tưới thúc bằng đạm thì dùng 80-100 kg urê/ha phathành dung dịch 2%, tưới vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát Cần làm cỏ vun xới kếthợp khi tưới thúc [3]

1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản

Ngoài việc dùng đế hoa và lá bắc để ăn người ta còn dùng thân và lá tươi của Actisô

làm thuốc Lá tươi được thu hái lúc sắp hoặc đang ra hoa, rọc bỏ sống lá, sấy hayphơi khô Lá tươi và khô dùng dưới hình thức thuốc sắc 5 – 10%, hoặc cao lòng 2 –

10 g / ngày Có khi chế thành cao mềm hay cao khô để làm thuốc viên, thuốc tiêmdưới da, tiêm tĩnh mạch Ngoài ra, còn dùng dưới dạng cao lỏng đặc biệt với hìnhthức nhỏ giọt, ngày uống 1 – 3 lần, mỗi lần 10 – 40 giọt [4] Actisô được bảo quản ởnhiệt độ khoảng 5 oC trong 10 ngày, nếu sau 10 ngày thì hàm lượng các chất sẽgiảm đáng kể [4]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA

1.2.1 Dẫn xuất caffeoylquinic

Dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất trong Actisô là cynarin (acid1,3-dicaffeylquinic), dù không phải là chất chiếm hàm lượng cao nhất Hợp chấtnày được phân lập từ dịch chiết lá Actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi vàScarpati (1954) [25]

Cynarin (acid 1,3 – dicaffeoylquinic): cynarin là diester caffeic của acid quinic, là

dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất và được xem là hoạt chấtchính trong Actisô mặc dù không phải là chất chiếm hàm lượng cao nhất (Hàmlượng cynarin trong dịch chiết methanol rất thấp chỉ khoảng 1,5%) Hợp chất nàyđược phân lập từ dịch chiết lá Actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi vàScarpati, đã được các tác giả người Ý phân lập ở dạng tinh khiết (1954) [25]

Trong một số tài liệu trước đây cho rằng cynarin tồn tại trong lá tươi là acid dicaffeoylquinic rất dễ bị chuyển thành 1,5-dicaffeoylquinic trong quá trình sắc vớinước và các sản phẩm phân hủy của cynarin như acid caffeic (acid 3,4-dihydroxy

1,cinnamic), acid clorogenic (acid 5-O-caffeylquinic) và acid neo-clorogenic (acid

3-O- caffeylquinic) [7] Tuy nhiên, rất nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng

cynarin không phải là chất nguyên thủy trong cây mà nó là chất artifact được hìnhthành trong quá trình chiết xuất với nước nóng [24], [26], [33]

chất có hàm lượng cao nhất (39%), tiếp đến là acid 1,5–O–dicaffeoylquinic (21%) và acid 3,4-O–dicaffeoylquinic (11%) tính trên tổng hàm lượng acid caffeoylquinic Hàm

lượng các chất này phụ thuộc dung môi, pH, nhiệt độ trong quá trình chiết xuất [25]

1 2

3

5 4

R 1 R 2 Tên hợp chất

Rutinose OH Luteolin – O – 7 rutinosid Glucose OH Luteolin – O – 7 glucosid Ruttinose H Apigenin – O – 7 rutinosid Glucose H Apigenin – O – 7 glucosid

Hình 1.5 Dẫn xuất Flavonoid.

Các dẫn chất của luteolin bao gồm:

– Cynarosid (luteolin 7-O-β-glycopyranosid).

– Scolymosid [luteolin-7-O-[β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranosyl].

– Cynarotriosid (luteolin-7- rutinosid, 3’-glucose)

Ngoài ra, tùy theo loài còn có dẫn chất khác luteolin như apigenin 7-O-rutinosid, apigenin 7-O-glucosid hay các dẫn chất của naringenin (narirutin) như narigenin 7-

O- glucosid [23].

1.2.3 Sesquiterpen lacton

OH O

Sesquiterpen lacton là hợp chất chính tạo nên vị đắng của cây Schneider và Thiele

đã báo cáo rằng hợp chất này chỉ có trong các phần màu xanh của cây như lá, màhoàn toàn không có trong rễ Lượng sesquiterpen lacton chiếm 2,55% (trọng lượngkhô) trong dịch chiết lá Actisô [22] Gồm 2 Sesquiterpen lacton chính làcynaropicrin và grosheimin Ngoài ra, còn có sesequiterpen B- selinen vàcaryphyllen [28]

1.2.4 Inulin

Inulin chủ yếu được tìm thấy trong cây hai lá mầm thuộc họ Asteraceae gồm những

loài phổ biến như rau Diếp xoăn (Cichorium intybus L.), Actisô (C scolymus), Bồ công anh (Taraxacum officinale), Thược dược (Dalia variabilis), Lê đất (Polymia

sonchifolia) Inulin trong Actisô có chiều dài chuỗi lên đến 200 phân tử fructose

(thuộc nhóm fructan) liên kết với nhau theo liên kết β-2,1 và β-2,6 dưới dạng mạchthẳng hoặc mạch nhánh Inulin trong Actisô được xem là chất có mức độ trùng hợpphân tử cao nhất trong giới thực vật [25]

Các dược liệu giàu inulin đang trở thành loại thực phẩm chức năng được ưa thíchnhờ những lợi ích tiềm năng đối với sức khỏe con người Vì con người không cóenzym tiêu hóa fructan nên khi xuống đại tràng, chất này đóng vai trò như chất nềncho sự phát triển của hệ vi khuẩn Chế độ ăn giàu fructan có tác dụng kích thíchbifidobacteria một cách chọn lọc, giúp chúng phát triển và nhờ đó làm giảm sự tạothành những chất gây khối u Một lí do khác khiến inulin được ưa dùng là nhờ cóảnh hưởng nhất định đến thành phần hệ vi sinh vật trong ruột và có hiệu quả tốt đốivới việc hấp thu chất khoáng, lipid trong máu và ngăn ngừa ung thư đại tràng.Ngoài ra, inulin là chất có lượng calori thấp nên còn được sử dụng để sản xuất thựcphẩm giảm béo [25]

1.2.5 Các thành phần khác

Actisô cũng có chứa chất xơ, calcium, phosphor, kali, acid folic, vitamin C, niacin,

thiamin, nguyên tố vi lượng và carrotenoid.

Trong Actisô còn có một số loại enzym như oxidase, peroxidase, cynarase,ascorbinase và ribulose-1,5-diphosphate carboxylase Đặc biệt, Actisô có chứanhiều polyphenol oxidase Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủyhoạt chất trong quá trình phơi, sấy và chế biến.

Tinh dầu với các thành phần như beta – selinen, caryophyllen, eugenol,phenylacetaldehyd và decanal

Acid béo no và không no như acid stearic, acid palmitic, acid oleic và acid linoleic.Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy lá Actisô còn chứa các carbohydrat như:fructose, saccarose, glucose, hemicellulose…[35]

Tổng cộng có 15 axit amin được tìm thấy trong lá Actisô Chín trong số này là rấtcần thiết gồm: valin, threonin, methionin, isoleucin, leucin, lysin, phenylalanin,histidin, arginin Hàm lượng các axit amin toàn phần là 58,29%, trong đó axit aminthiết yếu chiếm 4,71%) [36]

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Một nghiên cứu được thực hiện trên bạch cầu của những người thường xuyên chịutác động oxy hóa cao, đã xác định được dịch chiết của lá Actisô có tính chống oxyhóa ở nồng độ từ 1 – 10 mg/ml, quá nồng độ này hoạt tính chống oxy hóa sẽ giảm.Nghiên cứu tương tự khác vào năm 2002 trên các tế bào nội mạc mạch máu trongống nghiệm cũng đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của Actisô Ngoài ra, thửnghiệm cho thấy, phân đoạn n-butanol của dịch chiết lá có tác dụng chống oxy hóamạnh nhất [27]

1.3.2 Tác dụng trên gan mật

Trên in vitro, dịch chiết Actisô có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột khỏi sự phá hủy

màng tế bào Ngoài ra, ở nồng độ 100 g/ml, dịch chiết lá Actisô (có chứa 27% acidcaffeoylquinic và 7% flavonoid) còn giúp làm tăng đáng kể hoạt động của tế bào

gan HepG2 sau khi ủ 48 giờ Cũng tại nồng độ này dịch chiết Actisô được chứngminh làm giảm tổn thương tế bào do ethanol gây ra (nồng độ 50 milimol) [17].Ngoài ra, ở nồng độ 250 mg/kg/ngày (đường uống) Actisô đã được chứng minh cókhả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của paracetamol [34].

1.3.3 Tác dụng làm giảm cholesterol

Dịch chiết lá Actisô có tác dụng ngăn cản sinh tổng hợp cholesterol ở gan Tác dụngnày là nhờ luteolin làm giảm đặc tính của HMG-CoA (enzym xúc tác quá trình sinhtổng hợp cholesterol) Hơn nữa, acid clorogenic và luteolin có thể ngăn cản quátrình gây xơ cứng động mạch nhờ ngăn cản sự oxy hoá LDL Nói chung, Actisô làmgiảm cholesterol theo 2 cơ chế song song là giảm sinh tổng hợp cholesterol và ngăn chặn

sự oxy hoá LDL khi sử dụng 1280 mg dịch chiết Actisô đã được tiêu chuẩn hóatrong 12 tuần [30]

1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm

Ba dịch chiết chloroform, Ethyl acetat, và n – butanol của lá Actisô đều có tác dụng

kháng khuẩn và kháng nấm Trong đó, có 4 vi khuẩn gram dương là: Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus, Agrobacterium tumefaciens, và Micrococcus luteus,

2 vi khuẩn gram âm là: Escherichia coli, Salmonella typhimurium Cùng 3 nấm men là: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, và

2 nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium oxalicum Trong số đó, axit chlorogenic,

cynarin, luteolin-7-rutinoside, và cynaroside có tác dụng tương đối cao hơn so vớicác hợp chất khác; và có hiệu quả hơn với nấm Nồng độ ức chế tối thiểu của cáchợp chất này là từ 50 đến 200 g/mL [38]

1.3.5 Tác dụng trên tim mạch

Rossoni và cộng sự (2005) đã chứng minh Cynara cardunculus có thể làm tăng sự

sản xuất nitric oxid nên làm giãn mạch máu ở các tế bào nội mô động mạch chủ củathú vật thí nghiệm Các tác giả cũng chứng minh được rằng luteolin và apigenin cótác dụng trên sự giãn động mạch chủ khi thêm vào thành phần để tắm xông hơi Li

và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và chứng minh được sở dĩ có sự tăng hàm lượng

nitric oxid là do enzym tổng hợp nitric oxid (nitric oxide synthase: eNOS) Cácflavonoid trong Actisô đã làm tăng hoạt tính của eNOS Thử nghiệm cũng đã chứngminh rằng chỉ có luteolin và cynarosid có tác dụng làm tăng hoạt tính của eNOSnhưng cynarin và acid clorogenic lại không có tác dụng này.

Tác dụng làm hạ lipid huyết, chống oxy hóa và làm tăng quá trình sao chép của các gentổng hợp nitric-oxid của Actisô giúp ích cho việc điều trị các bệnh về tim mạch [25]

1.3.6 Tác dụng trên hệ tiêu hóa

Với liều 125 – 500 mg/kg, Actisô được chứng minh có khả năng chống lại tác hạicủa ethanol trên hệ tiêu hóa Mặt khác, ở liều 1000 – 2000 mg/kg, Actisô có thểngăn cản tổn thương niêm mạc dạ dày do stress gây ra [21]

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết Actisô có lợi ích trong việc điều trị các bệnh rốiloạn tiêu hóa Các hợp chất cynarosid trong Actisô có tác dụng tăng co thắt hồitràng, thông qua thụ thể của chất trung gian hóa học là serotonin [39]

Dịch chiết lá Actisô được sử dụng để điều trị các bệnh dạ dày – ruột chủ yếu dựavào tác động chống lại chứng khó tiêu gián tiếp thông qua đặc tính tẩy xổ Tác dụngtấy xổ của Actisô tương tự các hợp chất acid dehydrocholic [25]

1.3.7 Tác dụng kháng viêm

Luteolin có tính kháng viêm và kháng dị ứng do có tác dụng ức chế sự thành lập

COX – 2, PGE2 và lipopolysaccaride (LPS) Luteolin còn ức chế xanthin oxidase ởliều 100 µmol/L, ức chế lipoxygenase, ức chế sự sản sinh quá mức của α – TNF lànhững chất gây viêm và gây chết tế bào [32]

1.3.8 Tác dụng kháng ung thư

Với nồng độ từ 10 – 100 M, acid clorogenic có tác dụng ức chế mạnh phosphattranslocase (một yếu tố liên quan đến kiểu hình xâm lấn của các tế bào unão) Hơn nữa, acid clorogenic còn có tác dụng ức chế sự di căn của tế bào gây rabởi sphingosin – 1 phosphat (S1P) – chất gây gián phân cho tế bào u nguyên bào xốp [14]

glucose-6-1.3.9 Tác dụng kháng HIV

Nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng hợp chất 1,5 – dicaffeoylquinic acid có trongActisô có khả năng ức chế mạnh mẽ và không độc hại HIV – 1 intergrase, mộtenzym cần thiết cho sự xâm nhập của bộ gen HIV vào tế bào vật chủ [15].

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ 1.4.1 Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

Định lượng bằng phương pháp đo quang UV-Vis

Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu và cắt nhỏ hoặc xay thành bột thô Làm ẩm với

ethanol 96% (TT) trong 30 phút, cho vào bình Soxhlet chiết với ethanol 70% (TT)

trên cách thuỷ cho tới hết hoạt chất (thử bằng phản ứng định tính A: dịch thử khôngxuất hiện màu hồng cánh sen) Cất thu hồi dung môi Cắn còn lại thêm 20 ml nước

cất, lọc qua giấy lọc Cho dịch lọc vào ống quay ly tâm và thêm 20 ml dung dịch chì

acetat 10% (TT), khuấy đều Ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút, trong 15 phút.

Gạn bỏ lớp nước Thêm vào cắn 5 ml dung dịch acid acetic 10% (TT) và 25 ml dung dịch acid sulfuric 0,05 M (TT) Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, lắc đều trong 30 phút Thêm nước cất đến vạch Lấy 20 ml hỗn hợp vào ống ly tâm

và ly tâm như trên Lấy chính xác 1 ml dung dịch trong ở phía trên, cho vào bình

định mức 50 ml Thêm methanol (TT) đến vạch Đo độ hấp thu cực đại ở bước sóng

325 nm Mẫu trắng là methanol (TT).

Hàm lượng hoạt chất trong dược liệu được tính theo công thức sau:

A x 10000/616 x P

A: Độ hấp thu của mẫu đo.

616: Độ hấp thu của dung dịch cynarin 1% trong methanol (TT) ở bước sóng 325 nm P: Khối lượng dược liệu thô (đã trừ độ ẩm).

Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,1% hoạt chất tính theo cynarin [6].

1.4.2 Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu

Phải chứa tối thiểu 0,8% acid chlorogenic (C16H18O9) (thuốc khô)

Định lượng bằng phương pháp HPLC-UV

 Chuẩn bị mẫu thử:

Dung dịch thử: Để 0,500 g thuốc bột (1000), thêm 50 ml methanol và đun hồi lưutrên cách thủy ở 70 °C trong 1 giờ Ly tâm và chuyển phần nổi vào bình định mức

200 ml Lặp lại và pha loãng thành 200 ml với nước cất

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 5,0 mg acid clorogenic trong 50 ml methanol Chuyển5,0 ml dung dịch này vào bình định mức, thêm 5 ml methanol và pha loãng thành

A 1 : diện tích của pic acit clorogenic của mẫu thử

A 2 : diện tích của pic acid clorogenic của dung dịch đối chiếu

m 1 : khối lượng của thuốc được kiểm tra trong các dung dịch thử (gam)

m 2 : khối lượng của acid clorogenic trong dung dịch đối chiếu (gam) p: hàm lượng phần trăm của acid clorogenic của dung dịch đối chiếu [14].

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG ACTISÔ BẰNG HPLC

Hiện nay có nhiều phương pháp định tính và định lượng polyphenol từ Actisô vàchế phẩm bằng phương pháp HPLC:

Katrin Schutz và cộng sự (2004) [20] đã xây dựng phương pháp định tính, định lượngacid caffeoyquinic và flavonoid trong hoa đầu Actisô như sau: 4 g hoa đầu đông lạnhđược cắt nhỏ, chiết xuất bằng MeOH 60%, khuấy trộn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.Dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi bốc hơi ở 30 oC, hòa tan cắn trong nước và điềuchỉnh đến pH 7 Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml và điều chỉnhđến vạch, chỉnh pH đến 7 trước khi mẫu được tinh khiết hoá bằng cột SPE-C18.Hoạt hoá cột với 5 ml methanol và rửa lại 10 ml nước, sau đó nạp 4 ml mẫu Cácdẫn xuất của acid hydroxycinnamic lần lượt được rửa giải với 50 ml methanol 10%(phân đoạn 1), rồi đến 50 ml methanol 100% (phân đoạn 2) Các phân đoạn đượcloại hết dung môi đến cắn rồi hoà lại với methanol 50% Khai triển trên HPLC vớicột Phenomenex ODS, Hydro-Synergi C18 (150 × 3 mm; 4 µm), thể tích tiêm mẫu

là 5 μl, phát hiện ở bước sóng 280 nm (narirutin), 320 nm (acid hydroxy cinnamic),

330 nm (dẫn xuất của apigenin) và 350 nm (dẫn xuất luteolin), nhiệt độ cột 25 oC,với điều kiện được nêu ở Bảng 1.3.

Kết quả phân tích được trình bày ở Hình 1.7.

Hình 1.7 Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu của Actisô

Bảng 1.3 Chương trình HPLC phân tích các hợp chất phenol

trong dịch chiết hoa đầu của Actisô

Thời gian (phút) Tốc dộ dòng (ml/phút) 2% AA/ H

hoa đầu vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml methanol 60%, siêu âm 25 phút, sau

đó để ổn định ở nhiệt độ phòng và điều chỉnh bằng methanol 60% cho đủ thể tích,lọc qua màng lọc milipore 0,45 μm Khai triển HPLC được thực hiện trên cộtPhenomenex ODS3 (150× 3,2 mm; 5µm), phát hiện ở bước sóng 330 nm, pha độnggồm 0,2% H3PO4/H2O (A) và acetonitril (B) với chương trình gradient như sau: 6%

B (0’), 6-30% B (20’), 30% B (5’) Chạy thêm 10 phút để ổn định cột Tổng thờigian phân tích là 35 phút, tốc độ dòng 1,2 ml/phút

Hình 1.8 Sắc ký đồ dịch chiết lá và hoa Actisô

Dịch chiết lá (A); Dịch chiết hoa đầu (B)

Một số điều kiện HPLC trong phân tích các hợp hợp chất phenol trong Actisô đượctrình bày tóm tắt trong Bảng 1.4.

Bảng 1.4 Một số điều kiện định lượng các hợp chất trong Actisô bằng HPLC

Máy Cột sắc ký

(t o cột)

Pha động Chế độ chạy

Tổng thời gian phân tích (TRT)

Tốc độ dòng

λ max

(nm)

Tài liệu

Shimadzu

HPLC-DAD

LiChrospher C 18

(250 x 4,6 mm, 5µm, 100A o ) (25 o C)

Gradient: 8-48% B

(35’) TRT: 35’

1,0 ml/phút

254, 320

330 và 210

[23]

Agilent

1100-DAD

Zorbax Eclipse (250 x 4,6 mm, 5µm) (25 o C)

Dung môi A:

0,1% AA/H 2 O

Dung môi B: ACN

Gradient: 8-15% B (20’), 15-30% B

(10’) TRT: 30’

1,0 ml/phút

mm, 4 µm) (25 o C) + tiền cột ODS

C 18 (4 x 3 mm) (25 o C)

B (8’), 100-10% B (2’).

TRT: 90’

0,4 ml/phút

280; 320; 330; 350

TRT: 38’

0,8 ml/phút

330, 280

cm x 4,6 mm) (25 o C)

Dung môi A:

0,1% TFA

Dung môi B:

0,1%TFA/ACN 95%/H 2 O

Gradient: 10-50%

B (30’), 50-100% B (5’), 100% B (2’), 100-10% B (10’).

TRT: 54’

1 ml/phút

TRT: 14’

0,8 ml/phút

15-B (25’-30’), 40-63%

B (30’-45’), 63% B (47’), 63-99% (47’-

51’) TRT: 51’

Gradient 2: 10% B, 10-40% B(25’), 40- 99% B (25’-40’).

TRT: 40’

1 ml/phút

325; 265 (λ ex ) 345 (λ em).

254 [28]

(10 x 4 mm, Merck)

TRT: 50’

1,3 ml/phút

TRT: 62’

1 ml/phút

B (4’) TRT: 28’

0,5 ml/phút

280 [28]

Chú thích: λ ex (bước sóng kích thích); λ em (bước sóng phát xạ); TRT: total running time

1.5 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG

Trà LadoActiso Công ty cổ phần dược phẩm Lâm

Đồng

Trà Atisô

Cơ sở sản xuất Vĩnh Tiến

Trà Atisô Công ty TNHH thương mại và dịch vụ Đại Gia

Cơ sở trà Hoàng Duy Công ty cổ phần dược phẩm Lâm

Đồng

Cơ sở trà Trâm Anh

Hình 1.9 Một số chế phẩm trên thị trường

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU1.6 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.6.1 Nguyên liệu

Các chất đối chiếu là: cynarin (CY), acid clorogenic (AC), scolymosid (SCO),cynarosid (CR) đã được phân lập từ các đề tài trước của nhóm nghiên cứu [1], [8].Trong đó CY, AC, CR đã được thiết lập chất chuẩn với hàm lượng tính trên nguyêntrạng lần lượt là: 94,26%; 92,39%; 91,53%

Lá Actisô: Lá tươi của 2 giống lá tím và trắng được thu hái ở phường 5, Tp Đà lạtvào tháng 3/2017, các lá được chọn là những lá to, già nằm ở gốc của thân cây Saukhi thu hái lá được rửa sạch, làm khô bằng 3 phương pháp khác nhau gồm phơi âmcan, phơi trực tiếp dưới ánh nắng, sấy ở 50-60 oC Trong đó, giống lá trắng phơi âmcan được dùng làm nguyên liệu để xây dựng quy trình định lượng Ngoài ra, lá trắng

và tím thu hái vào tháng 3, 4, 5, 6 tương ứng với độ tuổi của cây là 6, 7, 8, 9 thángtuổi được dùng để đánh giá hàm lượng hoạt chất theo từng thời vụ thu hái

Rễ và Hoa: được thu hái ở phường 5, Tp Đà lạt vào tháng 3/2017, sau đó rửa sạch,phơi âm can đến khô (độ ẩm dược liệu dưới 13%)

Tất cả các nguyên liệu trên được xay nhỏ, rây qua 2 cỡ rây 0,3 mm và 0,125 mm,lấy phần bột qua rây 0,3 mm nhưng không qua rây 0,125 mm

Một số chế phẩm dạng trà được mua trên thị trường có các thành phần được trình

bày ở Bảng 2.3

Bảng 2.5 Một số chế phẩm trên thị trường STT Ký hiệu mẫu Thành phẩn

7 TC Hoa Actisô

8 TA 60% Hoa, 20% thân, 20% rễ Actisô

9 BC Rễ, thân Actisô

10 TB Thân và lá 50%, rễ 35%, hoa 7%, cỏ ngọt 8%

1.6.2 Dung môi, hóa chất

Dung môi HPLC: acetonitril (Merck), methanol (Merck), acid formic (Merck),nước cất 2 lần

Dung môi khác: methanol, ethanol, ethyl acetat, nước cất

1.6.3 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị trong nghiên cứu hóa học

- Cân phân tích 5 số lẻ CP-2250 (Sartorius)

- Máy xác định độ ẩm MA-45 (Sartorius)

- Bể siêu âm Sonorex RK - 1028H (Bandelin, Đức)

Xử lý số liệu: Phần mềm SBSS, Microsoft Excel 2007 để phân tích thống kê, kiểm

định sự khác nhau giữa các biến bằng phân tích phương sai (anova), dùng t-test đểkiểm định 2 giá trị trung bình

1.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.7.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid trong lá Actisô bằng UPLC

1.7.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Tiêu chí lựa chọn chương trình rửa giải:

So sánh các sắc ký đồ và các thông số sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn để lựachọn điều kiện pha động tối ưu nhất Lựa chọn chương trình dung môi dựa trên cáctiêu chí sau:

 Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5); cân đối và ít kéo đuôi (0,8 ≤ As ≤ 1,5)

 Đỉnh cần định lượng đạt độ tinh khiết pic (giá trị purity angle < purity thresold)

 Thời gian lưu ngắn

 Tổng thời gian phân tích ngắn (bao gồm thời gian phân tích, rửa và cân bằng cột)

 Độ lặp lại tốt

Bước sóng phát hiện: khai triển mẫu chuẩn cynarin, acid clorogenic, scolymosid,

và cynarosid trên UPLC-PDA với dải bước sóng phát hiện từ 200 - 400 nm Chọnbước sóng có đỉnh hấp thu cực đại và ổn định

Khảo sát hệ dung môi: tiến hành thăm dò nồng độ acid thêm vào trong pha động

để cho các pic tách gọn và hạn chế kéo đuôi

 Nước acid formic 0,1% ( D) – ACN (C)

 Nước acid formic 0,2% ( D) – ACN (C)

Chương trình rửa giải: khai triển trên mẫu thử, khảo sát chế độ rửa giải sao cho các

pic của cynarin, acid clorogenic, scolymosid, và cynarosid tách rõ so với pic kế cận,ngoài ra pic cần định lượng phải đạt các thông số sắc ký như độ tinh khiết pic, hệ sốkéo đuôi (As), độ phân giải, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết…

Tốc độ dòng: triển khai trên mẫu thử với chương trình đã được lựa chọn như trên ở

tốc độ dòng khác nhau (0,3 ml/phút; 0,35 ml/phút; 0,4 ml/phút; 0,45 ml/phút và 0,5ml/phút) So sánh sắc ký đồ UPLC để chọn tốc độ dòng thích hợp

Nhiệt độ cột: triển khai trên mẫu thử với chương trình rửa giải và tốc độ dòng đã

được lựa chọn với các nhiệt độ cột là 27 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC và lựa chọn nhiệt

độ cột theo những tiêu chí đã đặt ra

1.7.1.2 Khảo sát quy trình chiết xuất trên mẫu thử

a Khảo sát dung môi chiết xuất

Lựa chọn dung môi chiết được nhiều hoạt chất cần định lượng và ít tạp chất nhất Vìhợp chất cần chiết ở đây là polyphenol nên lựa chọn 4 loại dung môi là: nước,ethanol, methanol với nồng độ khác nhau và ethyl acetat

Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá Actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi

khảo sát (methanol 40%, 70%, 100%; ethanol 40%, 70%, 96%; ethyl acetat và

nước), lắc đều Đun cách thủy trong 45 phút (các vial ngập trong nước ở 100 oC).Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức

25 ml Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore celluloseacetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn Thể tích tiêmmẫu 3 μl So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR trong dung môi khảo sát

b Khảo sát nhiệt độ chiết

Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi

đã được khảo sát lắc đều Đun trong bếp cách thủy ở 60 oC, 80 oC và 100 oC trong

45 phút Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bìnhđịnh mức 25 ml Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc miliporecellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn.Thể tích tiêm mẫu 3 μl So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR ở các nhiệt độchiết xuất cần khảo sát

c Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi

đã được khảo sát lắc đều Đun trong bếp cách thủy ở nhiệt độ đã khảo sát ở trêntrong 30 phút, 45 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30 phút Lấy vial ra để

nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml Thêmdung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 μmtrước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn Thể tích tiêm mẫu 3 μl.

So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR ở các thời gian chiết xuất cần khảo sát

d Khảo sát số lần chiết để chiết kiệt hoạt chất

Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi

đã được khảo sát lắc đều Đun trong bếp cách thủy ở nhiệt độ và thời gian đã khảosát ở trên Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bìnhđịnh mức 25 ml Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc miliporecellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn

Bã dược liệu dược chiết tiếp 3 lần nữa, mỗi lần 5 ml nước cất, thực hiện điều kiện

tương tự như trên thu được dịch chiết 2, dịch chiết 3, dịch chiết 4 Thể tích tiêm

mẫu 3 μl So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR của 4 lần chiết

1.7.1.3 Quy trình định lượng được xây dựng

Chiết xuất:

Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô Actisô cho vào vial 20 ml Thêmkhoảng 10 ml nước sôi Chiết trong cách thủy ở 100 oC trong 90 phút Lọc dịchchiết qua bông vào bình định mức 25 ml Bã dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữavới 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức,

bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trướckhi tiến hành triển khai UPLC

Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn CY, AC, SCO với nồng độ mỗi chất là 25 ppm trongmethanol, riêng CR (25 ppm) được pha trong methanol 60%, siêu âm ở 80 oC

Định lượng:

Mẫu thử và chuẩn (n = 3) sau khi lọc được tiêm vào hệ thống UPLC với điều kiệnsắc ký như sau

 Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters)

 Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện là 323 nm (CY, AC) và 349 nm (SCO, CR)

 Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm)

 Pha động: nước acid fomic 0,2% (D) – ACN (C) Chương trình rửa giải tiệm tiến như sau: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (2 phút); 19-20% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 20-10% C (0,5 phút);10% C (2,5 phút).

 Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.

 Lượng mẫu tiêm: 3 μl

 Nhiệt độ cột: 27 o C

 Thời gian phân tích: 23 phút.

Hàm lượng của CY, AC, SCO và CR trong lá và các chế phẩm Actisô được tínhtheo công thức:

100)

k Cc

Sc

St X

Trong đó: X : Hàm lượng của chất định lượng có trong dược liệu (%)

Sc: Diện tích đỉnh thu được của mẫu chuẩn (μV × s)

St: Diện tích đỉnh thu được của mẫu thử (μV × s)

Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml)

k: Độ pha loãng của mẫu đo (ml)

m: Khối lượng cao (mg)

h : độ ẩm của dược liệu

p : độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

1.7.2 Đánh giá quy trình định lượng

1.7.2.1 Kiểm tinh khiết chất đối chiếu

Các chất đối chiếu được pha với methanol và tiến hành HPLC với điều kiện là: 95% ACN (20 phút); 95% ACN (5 phút), 95-5% ACN (5 phút), 5% ACN (5 phút)

5-Sử dụng công cụ tính tích phân tự động để tính hàm lượng % của chất đối chiếu dựavào phần trăm diện tích đỉnh và các đỉnh này phải đạt độ tinh khiết pic

1.7.2.2 Tính tương thích hệ thống

Mục đích: để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp có thể xác định độphân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc ký đối với phép phân tích thực hiện.

Tính tương thích được thực hiện bằng cách chạy lặp lại 6 lần trên 1 mẫu chuẩn và 1mẫu thử theo các điều kiện đã được xác định Ghi nhận các thông số sau:

− Rt : thời gian lưu (phút)

− S: diện tích đỉnh

− N: số đĩa lý thuyết biểu kiến của cột sắc ký = hiệu năng cột

− k’: hệ số dung lượng (capacity factor)

− α : hệ số chọn lọc (seperation factor)

− As: hệ số đối xứng = hệ số kéo đuôi (Asymmetry factor)

− Rs: độ phân giải (resolution)

Tính tương thích hệ thống đạt yêu cầu khi:

- Dung dịch chuẩn cynarin 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg cynarin vào bìnhđịnh mức 5 ml, thêm methanol đến vạch

- Dung dịch chuẩn scolymosid 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg scolymosidvào bình định mức 5 ml, bổ sung thể tích vừa đủ bằng methanol

- Dung dịch chuẩn cynarosid 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg cynarosid vàobình định mức 5 ml, thêm methanol 60%, siêu âm ở 80 oC đến khi tan hoàn toàn,

và điền đủ thể tích bằng methanol 60%

Pha dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu (dung dịch 1): Lấy 1 ml dung dịch mẹ đã pha

ở trên cho vào bình định mức 5 ml, điền vừa đủ thể tích bằng methanol thu đượcdung dịch có nồng độ mỗi chất là 0,2 mg/ml (dung dịch 1) Từ dung dịch 1, pha cácgiai mẫu có nồng độ (ppm) của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosidtương ứng như sau:

Chất đối chiếu dd 2 dd 3 dd 4 dd 5 dd 6 dd 7 dd 8 Acid clorogenic 100 50 25 10 5 2,5 0,1

Ghi chú: dd là dung dịch, đơn vị là ppm

Tiến hành triển khai trên UPLC 3 lần cho mỗi dung dịch chuẩn đối chiếu với điềukiện sắc ký đã khảo sát Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh củacác dung dịch Dùng phần mềm Excel để biện luận và đưa ra phương trình hồi quituyến tính

1.7.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành đo tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn có nồng độ xác định Giả sử tín hiệutạp nhiễu đường nền thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu của pic chuẩn trong mẫuchuẩn A có nồng độ nhất định thu được là S Thiết lập tỷ lệ S/N LOD có S/N = 2/1hay 3/1 và LOQ có S/N = 9/1 hay 10/1 là chấp nhận được Từ tín hiệu S tính nồng

độ đem đo và suy ra LOD, LOQ

1.7.2.5 Khảo sát tính chọn lọc

Qui trình được tiến hành xác định tính đặc hiệu như sau:

− Dung dịch mẫu trắng: dung dịch methanol 60 %

− Dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu: cynarin, acid clorogenic, scolymosid,

− Dung dịch mẫu thử: tiến hành như qui trình chiết xuất đã khảo sát

− Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm 100 µl hỗn hợp chuẩn vào 100 µl dung dịch thử.Triển khai trên HPLC 4 dung dịch trên với điều kiện đã khảo sát, quan sát và so sánhthời gian lưu, phổ UV và pic của các chất định lượng trong các mẫu trên Yêu cầu:

− Thời gian lưu của thành phần cần định lượng trong mẫu thử phải tươngđương thời gian lưu của mẫu đối chiếu, đồng thời mẫu trắng không có đỉnhtrùng với đỉnh của thành phần cần định lượng

− Phổ UV của cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong mẫuchuẩn, mẫu thử và thử thêm chuẩn phải tương đương nhau

− Khi thêm 1 lượng chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích đỉnh của hợp chấtcần định lượng phải tăng lên so với trước khi thêm chất đối chiếu và pic củachất cần định lượng phải đạt độ tinh khiết pic

1.7.2.6 Khảo sát độ lặp lại

Độ lặp lại để đánh giá mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm khi phươngpháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu Độ lặp lại của phương phápphân tích thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (standard deviation-SD) hay độlệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation-RSD) của 1 loạt các lần đo mẫu

Để xác định độ lặp lại, người ta thường tiến hành định lượng 6 lần trong cùng 1 điều

kiện và tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% Giá trị RSD thay đổi tuỳ theo hàm lượng % chất phân tích có trong mẫu thử [19] (xem Bảng 2.9).

Bảng 2.6 Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích Hàm lượng

chất phân tích (%)

Tỷ số nồng độ

Đơn vị tương ứng RSD%