Thiết lập quy trình định tính và định lượng những vi sinh vật gây bệnh đường ruột chính trên người trong thực phẩm bằng real time pcr

Từ kết quả nghiên cứu này, phương pháp RTi-PCR do tôi xây dựng nên hoàn toàn có thể thay thế phương pháp chuẩn nuôi cấy truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong mẫu thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh

VÀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH

-

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TSKH NGUYỄN QUỐC BÌNH -

Cán bộ chấm nhận xét 1: -

-

Cán bộ chấm nhận xét 2: -

-

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày …… tháng …… năm ……

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Tp HCM, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh : 09/10/1984 Nơi sinh : Quảng Ngãi

1- TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập quy trình định tính và định lượng những vi sinh vật gây bệnh đường ruột chính trên người trong thực phẩm bằng real time-PCR 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thiết lập các quy trình để ứng dụng phát hiện và định

lượng nhanh các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kỹ thuật real time-PCR (RTi-PCR) Nội dung nghiên cứu bao gồm:

 Tối ưu môi trường tiền tăng sinh cho các vi khuẩn đích

 Lựa chọn các cặp primer đặc hiệu đối với từng loài vi khuẩn đích cho phân tích RTi-PCR

 Tối ưu và đơn giản hoá phương pháp chuẩn bị DNA cho phân tích RTi-PCR

 Xác định độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp RTi-PCR so với

phương pháp nuôi cấy chuẩn

 Ứng dụng để phân tích hiện trạng nhiễm khuẩn của một số mẫu thực phẩm

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 01/2009

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 08/2009

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TSKH NGUYỄN QUỐC BÌNH

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CB HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

Để hoàn thành luận văn này, em vô cùng biết ơn thầy Nguyễn Quốc Bình, người đã tận tâm hướng dẫn và lắng nghe em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Cám ơn cô Nguyễn Thúy Hương, người cô luôn luôn yêu thương, giúp đỡ động viên mỗi khi em khó khăn

Cảm ơn tất các thầy cô đã trang bị cho em kiến thức và kỹ năng của một người làm khoa học

Con xin cám ơn ba me đã sinh ra và nuôi dưỡng để con có được ngày hôm nay

Em cũng không thể không nhớ chị Hai, người vừa là một người chị, một người mẹ và cũng là một người bạn đã cùng em đi suốt con đường đã qua Cám ơn các anh, chị, em trong gia đình đã cho em nguồn động viên mỗi khi em tưởng chừng không thể vượt qua

Để hoàn thành tốt luận văn này em cũng vô cùng cảm ơn chị Thảo, em Việt, các anh chị tại Trung tâm Công nghệ sinh học và các cô, chị tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách khoa đã tạo cho em những điều kiện thuận lợi nhất

Để hoàn thành tốt đề tài này em cũng không thể quên sự giúp đỡ và tạo điều kiện của các anh, chị tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm TPHCM để em được thuận lợi trong nghiên cứu nhất

Đồng thời mình cả ơn tất cả các bạn, các anh chị cao học khóa

TÓM TẮT:

Các bệnh do ngộ độc thực phẩm gây nên đang là mối quan tâm của toàn xã hội cho sức khỏe cộng đồng Hiện nay, hầu hết các trung tâm phân tích, phòng thí nghiệm chủ yếu sử dụng các phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát hiện, các phương pháp này có độ nhạy cao nhưng mất nhiều thời gian, công sức và phức tạp

để khẳng định thường thì mất vài ngày cho kết quả âm tính và 5 - 7 ngày cho kết

quả dương tính Với mục tiêu “Thiết lập quy trình phát hiện và định lượng nhanh một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột chính ở người trong thực phẩm bằng real time-PCR”

Quy trình phát hiện và định lượng nhanh đối với 6 loài vi khuẩn đích bằng RTi-PCR đã được thiết lập Trong đó, 1 quy trình được thiết lập chung cho 5 loài

đích là Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes,

Bacillus cereus với một môi trường tiền tăng sinh chung và một quy trình khác

cho Vibrio parahaemolyticus Sáu cặp primer đặc hiệu cho 6 loài vi khuẩn đích,

không có hiện tượng phản ứng chéo của các cặp primer được chọn đối với chủng không phải chủng đích Phương pháp được chọn có độ nhạy cao từ 1 - 10 tế bào/phản ứng và có khả năng phát hiện được khi hiện diện của vi sinh vật đích từ

1 - 10 tế bào/25g mẫu thực phẩm trước khi làm giàu Đặc biệt chúng tôi có nghiên cứu sự hiện diện của dưới 1 tế bào vi khuẩn đích/25g mẫu mà các nghiên cứu trước đây chưa đề cập, kết quả phân tích của chúng tôi thu được có 65.00% số

mẫu nghiên cứu phát hiện được Listeria monocytogenes, 50.00% phát hiện được

Salmonella và Bacillus cereus, 41.67% đối với E coli, 37.50% dương tính với V parahaemolyticus và 30.00% đối với Shigella trong thí nghiệm gây nhiễm nhân

tạo Độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp được chọn cao, các giá trị này được tính toán trung bình tương ứng là 97.99%; 98.05%; 95.60% Từ kết quả nghiên cứu này, phương pháp RTi-PCR do tôi xây dựng nên hoàn toàn có thể thay thế phương pháp chuẩn nuôi cấy truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong mẫu thực phẩm trên phương diện độ nhạy và độ chính xác Mặt khác

với thao tác đơn giản hơn phương pháp nuôi cấy cổ điển Phương pháp này cần nên ứng dụng cho các trung tâm phân tích cho việc đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm và đặc biệt hữu ích trong các trường hợp chẩn đoán nhanh các ca ngộ độc thực phẩm

The objectives of this study were “To establish process for the rapid detection and quantification foodborne pathogenes which are major cause intestinal tracts in the human by real time-PCR”

Processes for rapid detection and quantification 6 target foodborne pathogenes was developed with the protocol used a universal culture preenrichment medium and 5 sets of specific primers for RTi-PCR to detect

Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogene and Bacillus cereus and a particular protocol for diagnosis Vibrio parahaemolyticus

The primers 100% specific as determined target species and no interference reation with non- target species was observed This method had highly sensitive, with detection limits from 1 to 10 copies/reaction as pure DNA 100% samples were possitive results as infection more than 1 cell/25g food Especially, in this study I investigated to ability present of target strains as less than 1 cell/25g food before enrichment step that was not mentioned in last studies The results of this

study is 65.00% positive Listeria monocytogenes, 50.00% positive Salmonella and

Bacillus cereus, 41.67% with E coli, 37.50% positive V parahaemolyticus và

30.00% positive result Shigella The accuracy, sensitivity and specificity is high in

comparison with traditional culture method These averange values was calculated 97.99%, 98.05%, 95.60% respectively in artificially contamination experiments For this reason, this method should replace method traditional culture to detect foodborne pathogens based on accuracy and sensitivity On the other hand, the time to finish diagnosis only spent 4 - 30 hours in comparison with classical

Especially, that is very useful for rapid diagnosis foodborne outbreaks

BAM: FDA's Bacteriological Analytical Manual

BPW: Bufferer Peptone Water

CDC: Trung tâm Kiểm dịch và Phòng bệnh Mỹ (Center for Disease Control and Prevention)

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FDA: Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug

Administration)

IMS

LA: Latex Agglutination

LB: Luria Bertani

PCR: Polymerase chain reaction

RPLA: Reverse passive latex agglutination

RTi-PCR: Real time-PCR

TSBYE: Tryptic Soya Broth Yeast Extract

USDA/ERS: Cơ quan Nghiên cứu Dịch vụ Kinh tế Nông nghiệp Mỹ (United States Department of Agricultural/Economic Research Service )

USDA: Bộ Nông nghiệp Mỹ (United States Department of Agricultural) VSV: Vi sinh vật

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT 5

2.2 CÁC VI SINH VẬT GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN VÀ NGUY HIỂM 5

2.2.1 Escherichia coli 5

2.2.1.1 Đặc điểm phân loại 5

2.2.1.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc 6

2.2.2 Bacillus cereus 8

2.2.2.1 Đặc điểm phân loại 8

2.2.2.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc 8

2.2.3 Listeria monocytogenes 9

2.2.3.1 Đặc điểm phân loại 10

2.2.3.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc 10

2.2.4 Salmonella 12

2.2.4.1 Đặc điểm phân loại 12

2.2.4.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc 13

2.2.5 Shigella 15

2.2.5.1 Đặc điểm phân loại 15

2.2.5.2 Bệnh, cơ chế và các nhân tố gây độc 17

2.2.6 Vibrio parahaemolyticus 20

2.2.6.1 Đặc điểm phân loại 20

2.2.6.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc 21

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 22

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống 22

2.3.2 Các phương pháp hiện nhanh 23

2.3.2.1 Các mini kit dựa vào sinh hóa 23

2.3.2.2 Các phương pháp miễn dịch 26

2.3.2.3 Các phương pháp dựa trên acid nucleic 32

2.4 POLYMERASE CHAIN REACTION VÀ REAL TIME- POLYMERASE CHAIN REACTION 33

2.4.1 Polymerase chain reaction 34

2.4.2 Multiplex polymerase chain reaction 35

2.4.3 Real-time polymerase chain reaction 35

2.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 40

2.5.1 Trong nước 40

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48

3.1 VẬT LIỆU 49

3.1.1 Các chủng vi sinh vật 49

3.1.2 Hóa chất 50

3.1.3 Các primer 51

3.1.4 Máy móc thiết bị 55

3.2 PHƯƠNG PHÁP 55

3.2.1 Pha chế môi trường 55

3.2.2 Tối ưu môi trường tiền tăng sinh 56

3.2.3 Các phương pháp xử lý tế bào 57

3.2.3.1 Từ canh trường thuần 57

3.2.3.2 Từ canh trường có thực phẩm 58

3.2.4 Xác định primer đặc hiệu, độ nhạy phản ứng RTi-PCR và xây dựng đường chuẩn trong phân tích RTi-PCR 59

3.2.4.1 Primer đặc hiệu 59

3.2.4.2 Xác định độ nhạy phản ứng 59

3.2.4.3 Xây dựng đường chuẩn RTi-PCR 59

3.2.5 Gây nhiễm nhân tạo với thực phẩm 59

3.2.6 Phương pháp chuẩn (phương pháp truyền thống) 60

3.2.7 Chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích RTi-PCR 63

3.2.8 Chương trình RTi-PCR 63

3.2.9 Xử lý số liệu 63

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66

4.1 KẾT QUẢ 67

4.1.1 Môi trường tiền tăng sinh 67

4.1.2 Các cặp primer đặc hiệu 67

4.1.3 Độ nhạy của ứng RTi-PCR và đường chuẩn 72

4.1.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp RTi-PCR với hai phương pháp xử lý tế bào 74

4.1.4.1 Phát hiện Salmonella 75

4.1.4.2 Phát hiện Listeria monocytogenes 75

4.1.4.3 Phát hiện Shigella 76

4.1.4.4 Phát hiện Bacillus cereus 76

4.1.4.5 Phát hiện E coli 77

4.1.4.6 Phát hiện V parahaemolyticus 77

4.1.4.7 So sánh hai phương pháp xử lý tế bào cho RTi-PCR 78

4.1.5 Phân tích hiện trạng nhiễm khuẩn của thực phẩm 80

4.2 THẢO LUẬN 81

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 86

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Tỷ lệ thương hàn do Typhi và Nontyphi tại Mỹ từ 1920 - 1995 15

Hình 2.2: Các bước trong PCR 34

Hình 2.3: Khuếch đại và phân tích định lượng trong real time PCR 36

Hình 2.4: Một số tín hiệu thông báo trong RTi-PCR 38

Hình 2.5: Kiểu đồ thị trong phân tích RTi-PCR với các nồng độ DNA ban đầu khác nhau 39

Hình 2.6: Ảnh hưởng của threshold đến đồ thị đường chuẩn 40

Hình 3.1: Xử lý tế bào vi khuẩn phương pháp bằng boiling và alkaling từ dịch khuẩn thuần 58

Hình 3.2: Quy trình gây nhiễm nhân tạo vi khuẩn đích vào thực phẩm 60

Hình 3.3: Quy trình phát hiện các vi khuẩn thuộc nhóm 1 61

Hình 3.4: Quy trình phát hiện các vi khuẩn thuộc nhóm 2 63

Hình 3.5: Quy trình chuẩn bị DNA cho RTi-PCR từ thực phẩm 63

Hình 4.1: Điện di các sản phẩm PCR sử dụng các cặp primer đặc hiệu 69

Hình 4.2: Phân tích kết quả RTi-PCR với các cặp primer đặc hiệu trên chủng đích 72

Hình 4.3 :Phân tích RTi-PCR với các nồng độ DNA ban đầu khác nhau 73

Hình 4.4: Đường chuẩn để phân tích định lượng bằng RTi-PCR 74

Hình 4.5: Hình dạng khuẩn lạc của các vi khuẩn đích trên môi trường chọn lọc 80

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: So sánh một số đặc điểm giữa Salmonella, Shigella và E coli 16

Bảng 2.2: Sự phân bố và biểu hiện bệnh của các loài Shigella 17

Bảng 2.3: Cơ chế gây bệnh của Shigella 19

Bảng 2.4: Các mini kit sinh hóa và hệ thống nhận biết tự động các vi sinh vật thực phẩm 24

Bảng 2.5: Các kit thương mại dựa trên miễn dịch học để phát hiện vi sinh vật và độc tố trong thực phẩm 27

Bảng 2.6: Các kit thương mại phát hiện vi sinh vật thực phẩm dựa trên acid nucleic 32

Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng để kiểm tra độ đặc hiệu các cặp primer 49

Bảng 3.2: Hóa chất và các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu 50

Bảng 3.3: 20 cặp primer sử dụng cho RTi-PCR 52

Bảng 3.4: Các máy móc, thiết bị sử dụng 55

Bảng 3.5: Một số môi trường tiền tăng sinh cho các vi khuẩn đích 56

Bảng 4.1: So sánh khả năng tăng trưởng của các loài vi khuẩn trên các môi trường tiền tăng sinh 67

Bảng 4.2: Các primer đặc hiệu cho giống/loài vi khuẩn đích 68

Bảng 4.3: So sánh hai phương pháp alkaling và phương pháp boiling trong xử lý tế bào 78

Bảng 4.4: Phân tích hiện trạng nhiễm khuẩn của thực phẩm sau khi làm giàu bằng RTi-PCR _ boiling và phương pháp truyền thống 80

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận thường xuyên, trở thành mối quan tâm của toàn xã hội, sức khỏe cộng đồng [53; 74] Theo thống kê của trung tâm Kiểm soát và Phòng bệnh Mỹ (Center for Disease Control and Prevention – CDC), trong những năm gần đây trung bình hàng năm có khoảng 76 triệu người bệnh và có 5,000 người tử vong Có rất nhiều nguyên nhân gây nên ngộ độc thực phẩm:

 Do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật: chủ yếu do các chủng Salmonella,

Escherichia coli (E coli), Clostridium perfringens, Listeria,…

 Do thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất: CN- , As, Cl-, Hg, Pb, Benladol, hóa chất bảo quản thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật

 Thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên như cyanua, phytate, alkaloid, nấm độc,…

Ngoài ra còn rất nhiều trường hợp ngộ độc mà không thể xác định được nguyên nhân

Trong đó, ngộ độc do vi sinh vật gây ra chiếm tỷ lệ cao nhất cả về số vụ, số người bệnh và tử vong [87] Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật có thể do vi sinh vật gây bệnh hay do các độc tố do vi sinh vật tiết ra [74] Theo thống kê của FDA, từ năm 1993 đến năm 1997 xảy ra 2,751 vụ ngộ độc thực phẩm trên lãnh thổ nước Mỹ (489 vụ năm 1993; 653 vụ năm 1994; 628 vụ vào năm 1995, năm 1996 có 477 vụ

và 504 vụ vào năm 1997) Các vụ ngộ độc này đã làm cho 86,058 người bệnh Nguyên nhân gây nên được xác định cao nhất là do vi sinh vật gây nên chiếm từ 75

- 86% Trong đó do Salmonella serotype Enteritidis chiếm cao nhất cả về số vụ,

trường hợp bệnh cũng như số người chết Nguyên nhân do hóa chất là 17%; 1% do virus, 6 - 8% do kí sinh trùng và từ 2 - 5% các nguyên nhân khác Theo thống kê của Bộ Y tế, ở nước ta trong năm 2008 có 205 vụ ngộ độc thực phẩm xảy làm có 2,258 trường hợp nhập viện và tập trung chủ yếu ở các khu công nghiệp, khu chế xuất

Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định sự hiện diện của vi sinh vật trong thực phẩm như phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường chọn lọc, khẳng

định bằng các phản ứng sinh hóa, huyết thanh và một số phương pháp không truyền thống hiện nay các phân tích dựa trên nguyên lý kháng nguyên - kháng thể (ELISA,

LA, IMS,…), dùng trở kháng, phân tích dựa trên nucleic acid (probe, PCR) [74] Tuy nhiên, các phương pháp không truyền thống đã và đang sử dụng cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thường chưa đạt được như phương pháp truyền thống, thường

là trong 1g mẫu Vì vậy phương pháp truyền thống vẫn được xem là phương pháp chuẩn Nhưng phương pháp truyền thống cho kết quả chậm, thao tác phức tạp, tốn kém và nguy hiểm cho kỹ thuật viên Vì vậy với mục đích đưa ra một phương pháp phát hiện nhanh, đơn giản, nhạy và đặc hiệu cho các vi sinh gây bệnh trong thực

phẩm, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Thiết lập quy trình định tính và định lượng những vi sinh vật gây bệnh đường ruột chính trên người trong thực phẩm bằng real time-PCR”

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT

Thống kê hàng năm tại Mỹ có khoảng 5.2 triệu trường hợp bệnh, 46,000 trường hợp nhập viện và 1,500 người tử vong do vi khuẩn gây nên Trong đó do ngộ độc thực phẩm chiếm tỷ lệ cao nhất với khoảng 4.2 triệu trường hợp bệnh (30.2%), 36,000 người nhập viện (59.9%) và 1297 trường hợp tử vong (71.7%), thiệt hại về kinh tế từ 5.6 đến 9.4 tỷ USD [59]

Theo FDA đưa ra có 14 loài vi sinh vật được quan tâm là mối nguy hại cho thực

phẩm là E coli, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia enterocolitica,

Yersinia pseudotuberculosis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens và Clostridium botulinum

Trong các loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thì do Salmonella chiếm 70%

phát hiện từ trong tã lót của trẻ em, được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium

coli commune Bốn năm sau, vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich Năm 1895, gọi bằng tên Bacillus coli Năm 1896, gọi thành Bacterium coli Sau nhiều kiểu gọi cuối cùng thống nhất là Escherichia coli [86]

Hàng năm tại Mỹ có khoảng 7,000 – 20,000 trường hợp bị nhiễm do E coli,

trong đó 150 - 300 ca tử vong, thiệt hại khoảng 230 - 600 triệu USD do chi phí thuốc thang điều trị và do giảm năng suất lao động [67]

2.2.1.1 Đặc điểm phân loại

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn Gram âm, hình que, kị khí tùy nghi,

không tạo nội bào tử, thuộc họ Enterobacteriaceae Có thể lên men lactose tạo acid

và sinh gas, phản ứng IMViC (indole, methyl red, Voges-Proskauer và citrate) cho kết quả ++ [74] Các serotype của E coli được xác định dựa trên các thử nghiệm

kháng nguyên sinh dưỡng ( somatic - O), tiên mao (flagellar - H) và kháng nguyên

vỏ (capsule - K) [74; 53 ] Hầu hết các chủng E coli thì vô hại, tồn tại trong hệ tiêu

hóa, chỉ có một số ít gây bệnh như các dòng enteropathogenic, enterotoxigenic, enterohemorrhagic and enteroinvasive [74] Enterohemorrhagic E coli (EHEC) [53],

là dòng gây bệnh nguy hiểm nhất trong các chủng thuộc E coli, sự hiện diện của vi

khuẩn này sinh ra một loại độc tố gọi là Shiga-like toxin (SLT), là nguyên nhân gây nên viêm ruột kết (tiêu chảy kèm theo máu), nó có thể đe dọa đến tính mạng do mất máu và nhiễm độc urea gọi là triệu chứng Hemolytic Uremic Syndrome (HUS)

Chính vì thế, gọi các chủng này là “Shiga toxin-producing” E coli hay STEC [87]

Chúng ta cũng có thể dòng này với tên gọi khác là verocytotoxic E coli (VTEC) vì

năm 1977, người ta đã ghi nhận một số chủng có khả năng tạo ra độc tố kết hợp không thuận nghịch với màng tế bào trong nuôi cấy tế bào Vero Phổ biến nhất

trong nhóm này được nhận biết ở Nam Phi là E coli O157:H7 Ngoài ra một số

serotype non-O157, bao gồm O26, O91,O103, O104, O111, O113, O117, O118, O121, O128 và O145 thỉnh thoảng có liên quan đến một số vụ ngộ độc ở người [61]

2.2.1.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc

E coli là một nhóm vi khuẩn lớn Mặc dù hầu hết các chủng E coli là vô hại,

chỉ có một số ít chủng gây bệnh [74] Một vài chủng E coli là nguyên nhân gây tiêu

chảy, trong khi một số khác thì gây nên các bệnh liên quan đến tiểu tiện, các bệnh đường hô hấp, viêm phổi Đa số người bị nhiễm sẽ tự khỏi và thời gian ủ bệnh từ 4 -

7 ngày [88]

Năm 1977, người ta đã ghi nhận một số chủng có khả năng tạo ra độc tố kết hợp không thuận nghịch với màng tế bào trong nuôi cấy tế bào Vero, gọi là

verocytotoxigenic E coli (VTEC) gồm hơn 100 serotype khác nhau, Escherichia

coli O157:H7 là serotype chiếm ưu thế và độc nhất trong nhóm VTEC [61]

Khi nói đến E coli gây ngộ độc thực phẩm thì thường nói đến chủng O157:H7

[87]

E coli O157: H7 là một serotype phổ biến nhất ở E coli, là nguyên nhân gây

nên nhiều bệnh ở người và động vật Nó được nhận biết đầu tiên là nguyên nhân chính gây bệnh viêm ruột kết ở người vào năm 1982 tại Oregon và Michigan Trung

bình hàng năm có khoảng 173,000 trường hợp bệnh do E coli từ thực phẩm, với

2785 người nhập viện và 78 người tử vong trong đó do E coli O157:H7 gây ra là

62,458 trường hợp bệnh, 1,843 trường hợp vào viện và 52 người tử vong [59] Theo

báo cáo của CDC trong năm 2006 đã có 204 ca nhiễm E coli O157:H7 do ăn rau

xanh xảy ra tại Mỹ, trong đó có 31 trường hợp có triệu chứng HUS, 3 trường hợp tử vong (hai trường hợp là phụ nữ ở Wisconsin, Nebraska và một trường hợp là trẻ em

2 tuổi tại Idaho) và 104 trường hợp nhập viện, xảy ra tại 26 bang

Liều lượng gây bệnh của E coli O157: H7 thấp, sắp xỉ 10 CFU [vii], một vụ ngộ độc được xác định với hàm lượng vi khuẩn này rất thấp là 2 CFU/25g [53] Đây là loài vi khuẩn chiếm một tỷ lệ cao trong gây ngộ độc tại Mỹ, Nhật và Scothland [9] Triệu chứng ban đầu khi bị nhiễm chủng này như tiêu chảy không ra máu, đau bụng

và sốt trong thời gian ngắn Có thể dẫn đến trường hợp viêm ruột kết, được biểu hiện thông qua các triệu chứng như tiêu chảy ra máu, mất nước nhẹ và đau thắt vùng bụng [87] HUS xuất hiện ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên thường xuất hiện ở trẻ em dưới 10 tuổi, kèm các biến chứng như xanh xao, xuất huyết dưới da và suy giảm tiểu cầu, ít tạo nước tiểu và rối loạn chức năng thận Tỷ lệ tử vong chiếm 3- 5%, nhiều người qua khỏi thì mang biến chứng suốt đời như suy yếu chức năng thận và thần kinh [53; 87] Yếu tố gây bệnh chính là do chủng này có tạo ra một loại độc tố

giống như độc tố Shiga được tạo ra bởi Shigella, gọi là “Shiga-like toxin” (SLT)

SLT là một protein có một tiểu phần A và 5 tiểu đơn vị B Tiểu phần B liên kết với

mô đặc hiệu, có thể làm cho độc tố dính chặt vào receptor glycolipid ở màng trong của các tế bào bề mặt Trong khi đó thì tiểu phần A được di chuyển đến tế bào chủ

và liên kết với ribosome 28s, ức chế sự sinh tổng hợp protein và dần dần giết chết các tế bào thận và cuối cùng dẫn đến HUS Cùng với SLT, một số yếu tố gây độc

của E coli O157:H7, do gene eaeA trong bộ gene mã hóa cho một protein ngoài

màng gọi là intimin, cùng với các độc tố được mã hóa bởi các gene trên plasmide có kích thước khoảng 60MDa gọi là các enterohemolysin [53]

Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E coli rất dễ bị nhiễm vào thực phẩm

từ nguồn nguyên liệu, nước hay quá trình chế biến, khi bị nhiễm chúng gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa, biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến nặng, có thể gây chết người tùy thuộc vào mức độ nhiễm, chủng bị nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người [74] Vì vậy việc kiểm soát chúng trong an toàn thực phẩm là chỉ tiêu không thể thiếu

2.2.2 Bacillus cereus

Bacillus cereus (B cereus) cũng là một vi khuẩn khá phổ biến gây nên ngộ độc

thực phẩm, theo báo cáo của CDC chiếm từ 2 - 5% tổng số các vụ ngộ độc do vi sinh vật gây ra, thuộc một trong 16 chủng gây bệnh thực phẩm được đưa ra bởi

CDC B cereus là nguyên nhân gây nên 33% vụ ngộ độc xảy ra tại Nauy từ năm

1988 - 1993, 47% tại Iceland, 22% ở Phần Lan, 0.7% tại Anh và xứ Wales và 0.8% tại Nhật [63]

2.2.2.1 Đặc điểm phân loại

B cereus là trực khuẩn, Gram dương, di động và tạo nội bào tử, có thể tăng

trưởng trong phổ nhiệt rộng từ 5 - 50oC, phát triển tốt nhất ở 35 - 40oC, pH dao động từ 4.5 -9.3, dễ tạo bào tử và bào tử rất dễ nảy mầm, làm tan máu beta, thuộc

họ Bacillaceae [87, 74], phát triển cả ở điều kiện hiếu khí và kị khí [63] Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi và trong các sản phẩm như sữa, thịt, rau quả, gia vị, sản phẩm khô như cơm rang, mì ống, mì sợi…[63; 52]

2.2.2.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc

Vi khuẩn này có thể tiết ra hai loại độc tố là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa [74] Triệu chứng gây độc bởi B cereus là đau bụng, tiêu

chảy, không sốt, bắt đầu 4 - 16h sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12

- 24h Một dạng triệu chứng khác là buồn nôn và nôn sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm 1 - 5h, không bị tiêu chảy và kéo dài 24h [74; 56; ]

Ngày 21/06/1993 một vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra tại Virginia, làm cho 82 trẻ

em dưới 6 tuổi bị ngộ độc sau khi ăn trưa, trong đó có 13 trường hợp phải nhập viện, các triệu chứng thể hiện buồn nôn (71%), đau bụng (36%) và tiêu chảy (14%) [65]

Hàng năm có khoảng 27,360 trường hợp nhiễm vi sinh vật này được báo cáo, trong đó có 8 trường hợp nhập viện và không có trường hợp tử vong xảy ra tại Mỹ [59]

Liều lượng gây độc do Bacillus cereus gây ra khoảng 105 – 106 CFU/g [69], thường xuất hiện hai triệu chứng là tiêu chảy và nôn mửa, thường chỉ xảy ra ở mức nhẹ và trung bình, có thể tự khỏi sau 4 - 48h [63; 54; 74] Tuy hiên có một trường hợp

tử vong một bé gái 7 tuổi xảy ra tại Kinrooi (Đức) năm 2003 vì nôn ói quá mức [31] Các thực phẩm thường bị nhiễm bởi vi khuẩn này là thực phẩm đóng hộp, gia vị và thực phẩm gia nhiệt [63] Sự hiện diện của vi khuẩn này tiết ra một số loại độc tố gây nên triệu chứng tiêu chảy và nôn mửa Các độc tố gây tiêu chảy được gọi chung diarrhoeal toxin là các enterotoxin, bao gồm 4 loại là hai protein phức hemolysin

BL (HBL) và nonhemolytic enterotoxin (NHE)) cùng với hai enterotoxin (enterotoxin T (bc-D-ENT) và cytotoxin K) [54] Các enterotoxin này dễ bị biến tính bởi nhiệt, trong khi đó độc tố gây nên nôn mửa được biết là cereulide hay thường gọi emetic toxin thì rất bền nhiệt [56] Cereulide là một phân tử nhỏ, có cấu trúc lặp lại ba lần của hai amino acid và hai hydroxy acid (D-OLeu-D-Ala-L-OVal-L-Val)3 gọi là cấu trúc dodecadepsipeptide và được cho rằng chúng không được tổng hợp bởi hệ thống ribosome Cereulide hoạt động như một kênh ion kali xuyên màng ti thể và gây xáo trộn quá trình photphoryl, oxy hóa [31; 63] Một nghiên cứu gần đây cho thấy cereulide gây độc đối với tế bào giết tự nhiên K trong hệ thống miễn dịch [54]

2.2.3 Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (L monocytogenes) lần đầu tiên được mô tả bởi Muray

và cộng sự vào 1926, được gọi là Bacteria monocytogenes, vì nó có ảnh hưởng lên bạch cầu đơn nhân của bọ thí nghiệm Sau đó được Pirie đổi tên thành Listerella

hepatolytica vào năm 1927 L monocytogenes là tên gọi từ năm 1940 [86] Vi khuẩn

này lần đầu tiên phân lập được từ cừu bởi Gill và từ người bởi Nyfeldt vào năm

1929 [27] Lần đầu tiên tại miền Tây Đức phát hiện một trường hợp nhiễm trùng máu

và viêm màng não năm 1952, mãi đến năm 1981 mới nhận biết là Listeria

monocytogenes gây độc thực phẩm tại Halifax (Nova Scotia) có 41 trường hợp bị

nhiễm, trong đó có 18 ca tử vong [86]

Listeria monocytogenes là nguyên nhân gây nên bệnh listeriosis rất nguy hiểm ở

người, đặc biệt ở phụ nữ mang thai và trẻ em Vì sự nguy hiểm của loài này nên chính phủ của tất cả các nước trên thế giới đều có những quy định ngặt nghèo đối với loài này trong thực phẩm, không được hiện diện trong 25 - 100g mẫu tùy loại thực phẩm [88; 27] Nó được tìm thấy ít nhất trên 37 loài thú cả thú nuôi và thú hoang

dã, 17 loài chim, một số loài cá và loài có vỏ [88]

2.2.3.1 Đặc điểm phân loại

Listeria monocytogenes là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí tùy ý, không tạo nội

bào tử, tỷ lệ G + C thấp, phát triển trong khoảng nhiệt rộng từ -0.4 - 50 oC và phát triển ở pH 4.5 - 7.0, không phát triển được khi pH = 4.0 hay thấp hơn Catalase dương tính và oxidase âm tính, làm tan máu beta và có đặc điểm di động dạng dù[27]

, thuộc họ Listeriaceae Họ này gồm sáu loài là Listeria monocytogenes, Listeria

ivanovii, Listeria seeligeri, Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listeria grayi,

trong đó chỉ có Listeria monocytogenes và L ivanovii là gây bệnh, trong khi

Listeria monocytogenes gây bệnh cả ở người và động vật thì Listeria ivanovii

thường chỉ gây bệnh ở động vật và hiếm khi xảy ra ở người [6; 74; 1; 18] Phân bố rộng trong đất, bụi, thực phẩm và phân động vật, người [88]

2.2.3.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc

Listeria monocytogenes là nguyên nhân gây nên bệnh listeriosis rất nguy hiểm

Theo thống kê tại Mỹ hàng năm có khoảng 2,500 trường hợp bị bệnh và trong đó có khoảng 500 người chết [59; 87], là vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm có tỷ lệ tử vong cao nhất (20 - 40%) [6; 85] trong 16 loài gây thực phẩm so với Shigella spp (0.7%)

[48]

, Salmonella spp (0.38%), Campylobacter spp (0.02 - 0.1%) và Vibrio spp

(0.005-0.01%) [18; 85; 65]

Người bệnh listeriosis thường kèm theo các bệnh như nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai Bệnh này đặc biệt nguy hiểm đối với phụ nữ mang thai, trẻ em, người già và người suy giảm hệ thống miễn dịch, tỷ lệ tử vong có thể đến 70% [6], khi bị nhiễm vi khuẩn này có thể kèm theo một số triệu chứng không đặc hiệu giống triệu chứng bệnh cúm như: chóng mặt, nhức đầu, mệt mỏi, co rút cơ và đau nhức khớp xương [1] Theo thống kê hàng năm có khoảng 7.4 trường hợp /triệu dân bị listeriosis tại Mỹ, với tỷ lệ tử vong 21% do ngộ độc thực phẩm [72], thời gian ủ bệnh

từ 7 đến 60 ngày [85; 25], loài này thường hiện diện trong thức ăn gia súc, rau, sữa, nước, nước thải, các thực phẩm đã qua gia nhiệt [74] Năm 1981, các tỉnh ở Canada, món rau cải trộn phải tiêu hủy vì đã nhiễm loài vi sinh vật này, trong đó có 29% người trưởng thành và 49% trẻ em dưới bảy tuổi tử vong Năm 1983, cũng phát hiện trong sữa đã thanh trùng Pasteur gây bệnh listeriosis ở Massachusetts, trong đó

có bảy trường hợp đối với thai nhi hay trẻ sơ sinh, 42 trường hợp ở người lớn, với tỷ

lệ tử vong là 39% 1/3 vụ ngộ độc listeriosis xuất hiện ở California năm 1985 ở loại

bơ Mexican, tất cả có 145 trường hợp bị nhiễm, trong đó 46 trường hợp bị tử vong (chiếm 32%) [73] Liều lượng gây độc của Listeria monocytogenes chưa được biết vì

còn phụ thuộc nhiều vào đối tượng bị nhiễm [39]

Cơ chế gây nhiễm của Listeria monocytogenes cũng đã được nghiên cứu Bước đầu tiên, L monocytogenes bám vào thành niêm mạc ruột và được giữ lại nhờ sự trợ

giúp của một họ protein bề mặt gọi là internalin (Inl), có đặc điểm giàu leucine (dây kéo leucine), có khoảng hơn 25 gene mã hóa cho nhóm protein này [62] Đáng lưu ý nhất là InlA and InlB, trong khi InlA (một protein 88 kDa, được mã hóa bởi gene

inlA) tương tác với E- cadherin để đưa tế bào vi khuẩn vào tế bào chủ, InlB (một

protein có kích thước 65 kDa) nhận biết C1q-R (hoặc Met) để dễ dàng đưa vi khuẩn vào các tế bào đặc hiệu như tế bào máu, nguyên sợi bào và tế bào biểu mô Khi vào được tế bào chủ, tế bào vi khuẩn này định vị trên màng không bào Hai yếu tố có vai trò ly giải màng không bào được tiết ra bởi vi khuẩn là listeriolysin O (LLO) và

phosphatidylinositol-phospholipase C (PI-PLC) LLO (được mã hóa bởi gene hly,

có kích thước 58 kDa), có dạng lỗ, là một độc tố thiol, là yếu tố gây bệnh chủ yếu

của vi khuẩn này PI-PLC (một protein có kích thước 33 kDa, được mã hóa bởi

gene pclA) hoạt động điều phối với phosphatidylcholine-phospholipase C

(PC-PLC), một protein có kích thước 29 kDa, hỗ trợ LLO trong bước ly giải màng

không bào Listeria monocytogenes phóng thích vào tế bào chất, tại đây chúng phát

triển và nhân lên Trong quá trình nhân lên của tế bào, chúng cần đến protein bề mặt

có tên ActA (một protein được mã hóa bởi gene ActA, có kích thước 67 kDa), nó

được sao mã đồng thời với PC-PLC và điều hòa sự hình thành cực của sợi actin đẩy

tế bào vi khuẩn tiến đến màng tế bào chất Tại màng tế bào chất vi khuẩn bao quanh cấu trúc như filopodium, kết quả hình thành màng không bào thứ cấp Sự ly giải màng không bào thứ cấp là tín hiệu bắt đầu chu kì xâm nhiễm mới, nó phụ thuộc vào PC-PLC dưới sự điều hòa của Mpl (protein có kích thước 60kDa) Các gene mã hóa cho các protein tham gia vào gây nhiễm và gây bệnh cùng thuộc một tổ hợp gene (cluster) có kích thước 9.6 kb, được điều hòa bởi một protein có kích thước 27

kDa (do gene prfA mã hóa), còn các gene mã hóa cho InlA và InlB thì định vị ở vị

trí khác trong bộ gene Ngoài ra, cũng còn một số nhân tố khác tham gia vào quá

trình gây bệnh như Iap do gene iap mã hóa Tuy nhiên cơ chế của yếu tố này chưa

được rõ [5; 18]

2.2.4 Salmonella

Salmonella có tên này sau khi được bác sĩ thú y người Mỹ, Daniel Elmer

Salmon nghiên cứu, mặc dù người đã thực sự khám phá ra loài vi khuẩn này lần đầu tiên vào năm 1885 là Theobald Smith (một trợ tá của Salmon), sau này được biết vi

khuẩn này là Salmonella enterica var Choleraesuis Sau đó Dr Salmon chủ nhiệm

dự án nghiên cứu về loài vi khuẩn này ở Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA)

2.2.4.1 Đặc điểm phân loại

Salmonella là trực trùng, Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy nghi, có khả năng di

động, hầu hết các loài có tiên mao và sinh hydrosulfur, phát triển ở nhiệt độ từ 2 -

47oC, tối ưu ở nhiệt độ 25 - 43oC, có thể phát triển trong môi trường có pH thấp như

dạ dày [53], không tạo bào tử, có đường kính khoảng 0.7 đến 1.5 µm, và chiều dài 2-

5 µm [86] Đến nay đã xác định được 2,339 serotype, các serotype này được chia

theo hệ thống Kaffmann_White dựa trên công thức kháng nguyên O và kháng

nguyên H Ngoài ra một số serotype được đặt tên riêng như Enteritidis (S

enteritidis), Typhi (S typhi), Paratyphi (S paratyphi), Typhimurium (S typhimurium)… Hầu hết các serotype khác được ký hiệu bằng công thức kháng

nguyên [74] Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, có quan hệ gần với E coli,

phân bố rộng từ vùng khí hậu nóng đến lạnh và phổ gây bệnh rộng kể cả động vật máu nóng và máu lạnh [51; 47]

2.2.4.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc

Salmonella là vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất trong thực phẩm chiếm khoảng

70% các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật, là nguyên nhân gây nên bệnh salmonellosis ở người [11; 55] Hàng năm, tại Mỹ có khoảng 1.4 triệu người mắc bệnh, trong đó có 16,000 người nhập viện và 600 trường hợp tử vong, mất khoảng 4

tỷ USD hàng năm cho thuốc than, điều trị và do giảm năng suất lao động [59] Một

số vụ nhiễm salmonellosis lớn diễn ra tại Mỹ đã được ghi nhận, năm 1985, một vụ salmonellosis xảy ra tại 6 bang có 16,284 trường hợp nhiễm bệnh, sau đó 7 trường hợp tử vong Rồi sau đó, một vụ salmonellosis lớn nhất diễn ra vào năm 1994, tại

41 bang, làm hơn 224,000 người nhiễm [30; 53] Tại các nuớc Tây Âu, nó cũng được ghi nhận là nguyên nhân gây nên nhiều vụ ngộ độc thực phẩm Chẳng hạn, tại Anh 20,000 trường hợp [34; 83] và 30,000 trường hợp được ghi nhận mỗi năm tại Anh và

xứ Wales [58], Netherlands số trường hợp viêm dạ dày được ước tính đến 4.5 triệu vào năm 1999 [71] Theo USDA thì có hơn nửa số vụ ngộ độc do vi khuẩn này gây

ra có liên quan đến thịt gia cầm, thịt heo và trứng [10] Cần thiết có một số biện pháp

giảm thiểu tác hại của Salmonella cho cộng đồng người Chẳng hạn, năm 1995, một chương trình kiểm soát Salmonella trong thịt heo theo chương trình “feed to food”

tại Đan Mạch, chương trình này đã thành công với sự giảm con số thịt heo bị nhiễm

Salmonella từ 3.5% năm 1995 xuống 0.7% vào năm 2000, đã tiết kiệm được 25.5

trệu USD [58]

Salmonellosis thường gắn liền thương hàn với viêm ruột non và các bệnh cơ hội Thương hàn thường do Typhi và Paratyphi A, B hay C gây ra [53] Các triệu

chứng bao gồm tiêu chảy kéo dài, nôn ói và đau thắt vùng bụng [87; 74; 53] Từ những năm 1800 - 1949 thương hàn do Typhi gây ra chiếm ưư thế tại Mỹ, tuy nhiên gần đây thì ít xuất hiện hơn, mỗi năm khoảng 824 trường hợp bệnh, 618 trường hợp nhập viện và 3 trường hợp tử vong mỗi năm và chủ yếu là du khách quốc tế [59] So với do các chủng Nontyphi gây ra tương ứng là 1.4 triệu trường hợp bệnh, 16,430 trường hợp vào viện và 582 trường hợp tử vong (hình 1.1) [59] Các triệu chứng của viêm ruột non thường đau bụng dữ dội, tiêu chảy, nôn và sốt Tỷ lệ tử vong do salmonellosis thường tuỳ thuộc vào độ tuổi và trung bình khoảng 0.41% [87] Đặc biệt đối với các đối tượng như trẻ sơ sinh, người già, bệnh nhân và những người có

hệ miễn dịch yếu thì tỷ lệ này cao hơn nhiều Bình thường liều lượng gây độc của Salmonella là 105 CFU, tuy nhiên cũng có trường hợp ngộ độc khi bị tiêu thụ với liều lượng thấp hơn [2]

Ước tính có khoảng 200 nhân tố tham gia vào quá trình gây độc và hầu hết do các gene trong plasmid xâm nhiễm và trên các đảo gây bệnh quy định [53] Bước đầu gây nên salmonellosis có ít nhất 6 nhân tố tham gia SPI-1 có vai trò trong sự xâm

nhiễm của Salmonella vào tế bào biểu mô thành ruột Các protein được vi khuẩn tiết

ra được phóng thích vào tế bào chủ dẫn đến sự tái sắp xếp lại khung xương tế bào, màng và hấp phụ lên đại thực bào, tiếp theo các vi khuẩn sinh sản nhanh chóng hướng đến màng không bào SPI-2 type III do các vi khuẩn còn lại tiết ra chống lại lysosome, cơ chế mà tế bào chủ thường sử dụng khi bị nhiễm khuẩn Thêm vào đó, một số độc tố khác có vai trò đáng kể trong gây bệnh Nhiều seroptype của

Salmonella enterica có tạo ra nội độc tố là polypeptide bền nhiệt là nguyên nhân

gây nên tiêu chảy Các cytotoxin định vị trên màng ngoài của màng có thể có liên

quan đến sự lan truyền của vi khuẩn Salmonella xuyên sâu vào trong các mô khác

của tế bào chủ cũng như ức chế sự sinh tổng hợp protein và sự ly giải của tế bào chủ Một endotoxin cũng hiện diện trên màng ngoài tác động lên bạch cầu gây đáp ứng viêm [53]

Hình 2.1: Tỷ lệ thương hàn do Typhi và Nontyphi tại Mỹ từ 1920 - 1995 [67]

Vì sự phổ biến và khả năng lây nhiễm của Salmonella nhanh nên luật pháp các

nước yêu cầu khá nghiêm khắc về sự hiện diện của Salmonella trong thực phẩm, không có sự hiện diện của vi khuẩn này trong 1 - 25g mẫu tùy theo loại mẫu [51; 79]

2.2.5 Shigella

Shigella là nguyên nhân dẫn đến khoảng 448,240 trường hợp tiêu chảy tại Mỹ

mỗi năm [59] Vệ sinh kém là nguyên nhân chính trong lây lan Shigella từ người

sang người qua đường thực phẩm Là một vi khuẩn có khả năng sinh sản nhanh ở điều kiện nhiệt độ phòng [87]

Shigella là nguyên nhân gây bệnh shigellosis hay “bệnh lỵ trực trùng” [74; 81] Theo the Centers for Disease Control and Prevention's Emerging Infections

Program, Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet), Shigella là

1 trong 3 loài vi khuẩn gây bệnh thực phẩm nguy hiểm cùng với L monocytogenes

và Salmonella Shigella thường nhiễm vào thực phẩm qua nguyên liệu và công nhân

chế biến [74]

2.2.5.1 Đặc điểm phân loại

Cũng như Salmonella và E coli, Shigella thuộc họ Enterobacteriaceae, là trực

khuẩn, Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, kháng acid, kháng muối, có thể tồn tại lâu trong môi trường có pH thấp [74], di động, oxidase âm tính, catalase dương tính và methyl red dương tính, Voges-Proskauer và Simon citrate âm tính, lysine

decarboxylase và arginine dihydrolase âm Tạo acid nhưng không sinh hơi khi sử dụng glucose hay các hydrocarbon khác, urease âm tính, sử dụng được malonate, có thể phát triển trên môi trường KCN agar, không tạo H2S [3, 74]

Về mặt di truyền có quan hệ gần với E coli hơn là với Salmonella Shigella có

thể phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 10 - 48oC và pH từ 6 – 8 [53] Một số đặc điểm so

sánh giữa Salmonella, Shigella và E.coli được thể hiện trong bảng 2.1 [53]

Bảng 2.1: So sánh một số đặc điểm giữa Salmonella, Shigella và E coli [53]

a

: hầu hết các thử nghiệm

b

: các chủng thuộc type I

Các thành viên của Shigella bao gồm: Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, S

sonnei và S boydii [21; 48], Các loài Shigella khác nhau có sự phân bố địa lý, biểu

hiện bệnh và hậu quả để lại của bệnh thì khác nhau[53] (bảng 2.2)

Bảng 2.2: Sự phân bố và biểu hiện bệnh của các loài Shigella [53]

Trong khi tất cả các loài đều gây bệnh ở người thì chỉ có ba loài đầu tiên có liên quan đến các vụ ngộ độc thực phẩm Shigellosis ở các nước phát triển thường do

các loài S sonnei hoặc S flexneri Tại Mỹ, shigellosis thường do S sonnei (73%) trong tổng số các ca được phát hiện, tiếp theo đó là S flexneri (20.1%), S boydii (1.6%) và S dysenteriae (0.5%) và 4.8% không xác định được, vào năm 1999

Shigellosis xuất hiện nhiều nhất vào mùa hè và mùa thu trong năm [87]

2.2.5.2 Bệnh, cơ chế và các nhân tố gây độc

Shigella là nguyên nhân gây nên bệnh shigellosis, bệnh này chỉ xuất hiện ở các

loài linh trưởng và đặc biệt là ở người [3]. Biểu hiện của bệnh là tiêu chảy ở mức trung bình đến nặng, nôn, đau bụng và mất nước [21]

Theo thống kê hàng năm, trên toàn cầu có khoảng 164.7 triệu người bị shigellosis trong đó ở các nước đang phát triển chiếm đến 163.2 triệu người còn lại

là ở các nước phát triển Tỷ lệ tử vong khoảng 0.7% Sự nhiễm S flexneri và S

dysenteriae type 1 thường biểu hiện là đi ngoài với lượng rất ít phân kèm theo máu

và cơ, cũng có trường hợp đi ngoài ra nước, còn nhiễm S sonnei và S boyii thì ít

nghiêm trọng hơn, đi ngoài ra nước và kèm theo ít máu và cơ hơn [48]

Liều lượng gây độc của Shigella rất thấp, khoảng 10 CFU [3] Thường lây từ người qua người qua con đường ăn uống do vệ sinh kém Triệu chứng ban đầu của shigellosis thường xuất hiện sau 12 - 48h sau khi bị nhiễm vi khuẩn này, với các triệu chứng lên sốt, đau nhức, mệt mỏi và chán ăn [74], sau đó sẽ bị tiêu chảy dạng nước và có thể có máu hay còn gọi là lỵ Một số có thể có triệu chứng bị vọt bẻ Thỉnh thoảng độc tố Shiga gắn vào galabiose ức chế sự sinh tổng hợp protein của thú, dẫn đến triệu chứng Hemolytic Uremic Syndrome (HUS) và chính là nguyên nhân dẫn đến suy thận và tử vong [53]

Cơ chế xâm nhiễm của Shigella không thường như các vi sinh vật gây nôn khác,

mà chúng tấn công thẳng vào khung xương tế bào biểu mô, tại đây chúng sinh sản

và phát tán trực tiếp sang các tế bào bên cạnh Các chủng Shigella chứa một số

lượng lớn nhân tố gây độc trên các plasmid xâm nhiễm Tuy nhiên các gene trên nhiễm sắc thể hiện diện trên đảo gây bệnh (pathogenicity islands) cũng có vai trò trực tiếp hay đóng góp vào quá trình xâm nhiễm hay cuộc chiến với vật chủ trong quá trình xâm nhiễm Sự hiểu biết về di truyền của quá trình xâm nhiễm cũng như

chu trình phân chia nội bào của Shigella, bao gồm các cơ chế đặc hiệu loài, kích

thích mô cũng như đáp ứng miễn dịch còn hiểu biết rất ít

Bảng 2.3: Cơ chế gây bệnh của Shigella [82]

Các loài gây độc của Shigella có thể xâm nhiễm lên bề mặt tế bào biểu mô ruột,

tại đây chúng sinh sản nhanh chóng và xâm chiếm sang các tế bào kế bên Đặc trưng của bệnh shigellosis là tiêu chảy ra máu, đau bụng khẩn Một yếu tố có kích

thước khoảng 120 - 140 MDa do plasmid xâm nhiễm mã hoá có khả năng đóng vai trò trong sự xâm nhiễm vào ruột kết, plasmid này cũng chứa một số gene có vai trò

quan trong trong sự gây độc của Shigella, sự thiếu vắng plasmid xâm nhiễm là thiếu

kiểu hình xâm nhiễm và tiếp đến là không gây độc [17]

Các gene có nhiệm vụ trong shigellosis có thể được định vị trên nhiễm sắc thể

và đa phần trên plasmid xâm nhiễm Chúng thường là đa nhân tố và có hoạt động

phối hợp và các gene tồn tại dạng cluster Các gene set1A và set1B nằm trên NST

mã hoá cho Shigella enterotoxin 1 (ShET1), là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy ra

nước, trong khi đó gen ial và ipaH có vai trò trong quá trình xâm nhiễm lên tế bào

biểu mô thành ruột [48] Hầu hết các chủng gây bệnh đều có mang một lượng lớn plasmid có kích thước từ 120 – 430 kb gọi là plasmid xâm nhiễm được miêu tả đầu

tiên ở Shigella flexneri 2a Gene virA được mô tả đầu tiên trên chủng này có vai trò

trong phát tán các tế bào trong quá trình xâm nhiễm [21]

Do khả năng lây lan nhanh và tính nguy hiểm của bệnh nên Shigella được kiểm

soát rất nghiêm ngặt trong thực phẩm, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các quy trình kiểm soát phải chặt chẽ [74]

2.2.6 Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus (V parahaemolyticus) là một vi khuẩn cùng họ với vi

khuẩn gây dịch tả Nó thường sống trong khu vực cửa sông, nước lợ và là nguyên

nhân gây nên bệnh viêm dạ dày ở người Vibrio parahaemolyticus ở cửa sông Mỹ

và Canada thường hiện diện với nồng độ cao vào các tháng mùa hè và đầu mùa thu

Là loài ưa mặn, cần muối cho sự phát triển [87] Vibrio parahaemolyticus được xem

là nguyên nhân dẫn đến khoảng 50 - 60% các vụ tiêu chảy có liên quan đến tiêu thụ

đồ biển tươi sống hay chưa nấu chín [45], là loài chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm ở Đài Loan, Nhật Bản và một số nước ven biển khác có tỷ lệ tiêu thụ đồ biển cao [36]

2.2.6.1 Đặc điểm phân loại

Cũng như loài gây nên dịch tả thuộc họ Vibrionaceae Vibrio parahaemolyticus

là vi khuẩn ưa mặn, Gram âm, là nguyên nhân gây nên viêm dạ dày cấp tính ở người [49], hình que cong, V parahaemolyticus có oxidase dương tính, kị khí tuỳ

nghi và không tạo bào tử Cũng giống như các loài Vibrio khác trong giống Vibrio

là loài di động và có roi đơn cực, phân bố rộng rãi trên toàn thế giới thường hiện diện tại khu vực cửa sông, bờ biển [86; 87]

Sự phân loại Vibrio parahaemolyticus dựa vào phản ứng huyết thanh có thể

phân loại thành 13 serotype O và 71 serotype K [36; 57] Tuy nhiên, hầu hết các vụ ngộ độc do vi sinh vật này gây ra liên quan đến serovar O3:K6 [36; 57; 49] Bắt đầu vào

1996, một bằng chứng cho thấy rằng V parahaemolyticus gây nên ngộ độc trên

toàn thế giới chủ yếu là serovar O3:K6, serovar này còn xác định có chứa một phage dạng sợi nhỏ f237 và phage này có chứa một khung đọc mở duy nhất ORF8 Hai serovar khác cũng được xác định là O4:K8 và O4:KUT cũng được xác định là

có chứa f237 nên cũng có chứa gen ORF8 Chúng được chúng minh rằng có quan

hệ gần với nhau và các nghiên cứu trên sinh học phân tử cho thấy rằng serovar O4:K8 và O4:KUT xuất phát từ O3:K6 là do có sự thay đổi kháng nguyên O và K ORF8 được đề nghị có vai trò trong gây độc của các chủng nên nó được sử dụng để làm yếu tố đích (marker) trong việc xác định các loài gây độc, một serovar đơn O4:K12 được biết là nguyên nhân gây nên các vụ ngộ độc từ 1979 - 1995 được phân lập tại vùng bờ biển Thái Bình Dương ở Mỹ [49] Năm 1998, serovar O3:K6 là nguyên nhân gây nên một vụ ngộ độc lớn tại Mỹ do tiêu thụ hàu sống Gần đây một

số nghiên cứu về lĩnh vực sinh học phân tử cho thấy các serotype O4:K68, O1: KUT, O1:K25, và O1:K41 có quan hệ là một dòng mới của O3:K6 và cho rằng có

thay đổi ít nhiều các gene liên quan đến kháng nguyên O và K

2.2.6.2 Bệnh, cơ chế và nhân tố gây độc

V parahaemolyticus là loài dẫn đầu trong các loài gây ngộ độc do ăn hải sản tại

Mỹ và nó là một vi khuẩn gây độc phổ biến nhất tại Châu Á và chiếm gần một nửa

số vụ ngộ độc tại Đài Loan, Nhật và các nước Đông Nam Á [41] Tại Nhật Bản, năm

1994, báo cáo có tất cả 605 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó xác định 224 vụ là do

Vibrio parahaemolyticus gây ra [44] Tại Mỹ, năm 1997 một vụ ngộ độc tại Tây Bắc Thái Bình Dương làm 209 trường hợp bệnh và 1 trường hợp tử vong, nhiều vụ ngộ độc cũng xảy ra tại New York và Taxas vào năm 1998 Tại Galveston Bay (Texas)

một vụ nghiêm trọng làm 416 trường hợp bệnh và là vụ ngộ độc lớn nhất tại Mỹ được báo cáo [49] Tại các nước Châu Âu thì có ít trường hợp báo cáo ngộ độc do vi sinh vật này gây nên, trong đó có hai vụ xảy ra tại Bồ Đào Nha vào năm 1989 và

1999 có liên quan đến hải sản có nguồn gốc từ Châu Á[41]

Đây cũng là loài gây nên viêm dạ dày cấp và một số trường hợp gây nhiễm

trùng máu ở người Các hải sản thường bị nhiễm Vibrio parahaemolyticus như mực

ống, cá thu, cá ngừ, cá mòi, cua, tôm và loài hai mảnh như hàu và trai Thời gian ủ bệnh khoảng 24h sau khi tiêu thụ vi khuẩn này và xuất hiện các triệu chứng như tiêu chảy, kèm theo buồn nôn và nôn, đau thắt vùng bụng và thỉnh thoảng lên sốt Các

triệu chứng do V parahaemolyticus có thể hết sau 72h nhưng cũng có thể đến 10

ngày [36; 57; 49] Các vụ ngộ độc do sinh vật gây nên thường xảy ra những tháng mùa

hè và những tháng đầu mùa thu khi mà nhiệt độ của nước cao đó cũng là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi sinh vật này [87]

Cơ chế gây độc của vi khuẩn này vẫn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên khi nghiên

cứu trên các chủng độc cho thấy hầu hết các chủng gây độc đều có mang gene tdh (thermostable direct hemolysin) hay gene trh (tdh-related hemolysin) hoặc cả hai

gene này Mặc khác, các bằng chứng nghiên cứu từ năm 1996 từ serovar O3:K6 và các serovar liên quan đều có sự hiện diện của phage hình sợi f237 có chứa ORF8,

được đề nghị đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế gây độc của Vibrio

parahaemolyticus [49]

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

Phương pháp phát hiện các vi sinh vật theo truyền thống (phương pháp chuẩn) dựa trên việc nuôi cấy, lên men trên môi trường chọn lọc và không chọn lọc và phân lập các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường chọn lọc kết hợp với các kiểm tra sinh hoá và kiểu huyết thanh Sự lên men bao gồm tiền tăng sinh trên môi trường không chọn lọc và tăng sinh chọn lọc Bước tiền tăng sinh nhằm mục đích khôi phục các tế bào bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản, trong môi trường này

thường có nhiều nhân tố kích thích cho sự tăng trưởng và thường không chứa các yếu tố chọn lọc, cùng với các điều kiện tối ưu về nhiệt độ và pH [74] Tiếp theo là bước tăng sinh chọn lọc, trong môi trường này thường chứa các yếu tố ức chế các loài không phải loài đích Phân lập loài đích trên môi trường chọn lọc agar Thường phân biệt các loài đích trên môi trường agar dựa vào hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc, từ các khuẩn lạc tiến hành các kiểm tra xa hơn như sinh hoá và kiểu huyết thanh

Phương pháp do FDA đưa ra Bacteriological Analytical Manual (BAM) hiện nay được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm phân tích vi sinh vật gây bệnh trên toàn thế giới Toàn bộ quá trình phân tích mất khoảng 5 – 7 ngày [74; 52]

2.3.2 Các phương pháp hiện nhanh

Hiện nay với sự phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là thức ăn nhanh cùng với sự gia tăng đột biến số vụ ngộ độc thực phẩm như hiện nay, cần thiết có phương pháp phát hiện nhanh các mầm bệnh và các vi sinh vật gây nhiễm trong thực phẩm để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng Các phương pháp truyền thống để phát hiện các vi khuẩn thường tốn nhiều thời gian để vi khuẩn phát triển trên môi trường nuôi cấy, tiếp theo đó còn phải phân lập, nhận biết sinh hoá và thỉnh thoảng thử nghiệm huyết thanh Gần đây, một số cải tiến kỹ thuật để nhận biết

và phát hiện nhanh hơn, thuận tiện hơn, nhạy hơn và đặc hiệu hơn các phân tích thường Các phương pháp này gọi chung là phương pháp phát hiện nhanh Các phương pháp phát hiện nhanh đều dựa trên cơ sở là sinh hoá, miễn dịch học và trên vật chất di truyền và các phương pháp cải biến từ các phương pháp thường để gia tăng tốc độ phân tích Một vài phương pháp cũng tự động hoá để giảm bớt các thao tác bằng tay Chỉ ngoại trừ một vài phương pháp, còn hầu hết các phương pháp cần

có sự tăng sinh của vi sinh vật đích trên môi trường tăng sinh trước khi phân tích [28]

Dưới đây là một số phương pháp phát hiện nhanh

2.3.2.1 Các mini kit dựa vào sinh hóa

Mini kit sinh hoá để nhận diện các chủng thuần và trong thực phẩm Hầu hết các kit theo kiểu này đều có khoảng 15 - 30 môi trường hoặc cơ chất đặc hiệu để nhận

diện một nhóm hay một loài vi sinh vật, ngoại trừ một số kit sẽ cho kết quả trong 4h, còn hầu hết các kit cần phải có thời gian ủ từ 18 - 24h Nhìn chung các mini kit sinh hoá giống khoảng 90 - 99% về cách thực hiện cũng như khuôn khổ so với các phương pháp nuôi cấy truyền thống Đa số các mini kit được thiết kế cho vi khuẩn đường ruột, còn các kit để nhận biết các loài non-Enterobacteriaceae vẫn chưa thành

công bao gồm Campylobacter, vi khuẩn hiếu khí, không lên men, vi khuẩn Gram

âm và Gram dương Các mini kit cho kết quả nhanh chóng, tiết kiệm thời gian cũng

thao tác đơn giản Phổ biến nhất trong các mini kit đã được thương mại hóa là API® 20E System (bioMerieux) được sử dụng rộng rãi trong định danh vi sinh vật, nhận diện các vi sinh vật trong thực phẩm Hiện nay, có một số cải thiện thiết bị đo đạc tự động trong mini kit sinh hoá Các thiết bị có thể ủ các phản ứng và tự động nhận biết kết quả kiểu hình so với dữ liệu được lưu trữ trên máy tính Các hệ thống tự động khác nhận biết dựa vào kết cấu hoặc biến dưỡng như acid béo, oxi hoá carbon hay đặc điểm khác [28] Sau đây là một số mini kit sinh hóa nhận biết nhanh vi sinh vật đã được thương mại hóa

Bảng 2.4: Các mini kit sinh hóa và hệ thống nhận biết tự động các vi sinh vật

thực phẩm [28]

System Format Manufacturer Organisms

APIb biochemical bioMerieux Enterobacteriaceae, Listeria,

Staphylococcus, Campylobacter, Non-fermenters, anaerobes

Cobas IDA biochemical Hoffmann

LaRoche

Enterobacteriaceae

Micro-IDb biochemical REMEL Enterobacteriaceae, Listeria

EnterotubeII biochemical Roche Enterobacteriaceae

Spectrum 10 biochemical Austin Biological Enterobacteriaceae

RapID biochemical Innovative Diag Enterobacteriaceae

BBL Crystal biochemical Becton Dickinson Enterobacteriaceae,

Vibrionaceae, Non-fermenters,

anaerobes

Minitek biochemical Becton Dickinson Enterobacteriaceae

Microbact biochemical Microgen Enterobacteriaceae, Gram

negatives, Non-fermenters,

Listeria

Vitekb biochemicala bioMerieux Enterobacteriaceae, Gram

negatives, Gram positives Microlog C oxidationa Biolog Enterobacteriaceae, Gram

negatives, Gram positives

MISb Fatty acida Microbial-ID Enterobacteriaceae, Listeria,

Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter

Walk/Away biochemicala MicroScan Enterobacteriaceae, Listeria,

Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter

Replianalyzer biochemicala Oxoid Enterobacteriaceae, Listeria,

Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter

Riboprinter nucleic acida Qualicon Salmonella, Staphylococcus,

Listeria, Escherichia coli

Cobas

Micro-ID

biochemicala Becton Dickinson Enterobacteriaceae, Gram

negatives, Non-fermenters

Malthusb conductancea Malthus Salmonella, Listeria,

Campylobacter, E coli, Pseudomonas, coliforms

Bactometer impedancea bioMerieux Salmonella

* Table modified from: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical

Latex Agglutination (LA) là phương pháp đơn giản nhất, kháng thể được phủ bởi các hạt nhựa có màu hoặc in lớp keo màu vàng được sử dụng để phát hiện nhanh kiểu huyết thanh hay type của vi khuẩn phân lập từ thực phẩm

Một biến thể khác của LA và được biết là reverse passive latex agglutination (RPLA), kiểm tra đối với các kháng nguyên hoà tan và nó được sử dụng để kiểm tra hầu hết các toxin ly trích trong thực phẩm hoặc trong dịch thuần

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) là phân tích dựa trên kháng thể phổ biến nhất để phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Chúng thường được thiết kế theo kiểu “sandwich”, một kháng thể được cố định trên