Tổng quan về thành phần dịch trích bã bột cây thông

Tổng quan về thành phần dịch trích bã bột cây thông

PHAN TONG QUAN

- — Chương I ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CÂY CÓ TÍNH LỢI SỮA

— Chương II CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ TÌM HIỂU

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH TRÍCH

BÃ HỘT BÔNG BỞI NƯỚC,

Phần tổng quan - Chương |

Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên hột bông, nhưng chỉ tập trung trên phần

sợi Với phần hột, các nghiên cứu trên dịch trích bởi eter etil cho chat gossypol,

một sắc tố rất độc, có tính ngừa thai cho đàn ông ở Trung Quốc [68].Gossypol còn

có tính ngừa thai cho phụ nữ vì nó cần ƯÓ sự sản xuất sieroid buồng trứng 123|

Gossypol có khả năng trị ung thư gan, phổi 129 và kháng H.I.V 142]

BANG 1: Một số cây thuốc VN có tính lợi sữa theo tài liệu và kinh nghiệm

Đông Y,

srr LIÊN VIỆT NĂM TÊN KHOA HỌC HO TÀI LIỆU THAM KHẢO

i | Bong bong Lygodium Mexuosum Schizaeaceae Đỗ Tất lợi |2

2 {Rong gao Gossampinus malabarica Bombacese Petelot [76]

3 | Béng vải Gossypium herbaceum Malvaceae Petelot

4° {Cho dé PhyUanthus urinaria Euphorbiaceae {Petelot

3 | Cổ sữa Euphorbia hirta Euphorbiaceas | Petelat

6 | Đính lăng Polyscias fructicosa Araliaceae Đỗ Tất Lợi

7 ]Ïï lớn (hoắc hướng) Hyplis suaveolens Lamiaceae Petelot

8 [1a thd 6 tdng Streptocaulon juventas Asclepiadaceae | Đã Tất lợi

9 |llat mo Sesanum indicum Poda Haccao Hỗ Tất Lợi

10 [Lá cách Premna integrifolia Verbenaceae Đỗ Ta Lai

1] [La mit Artocarpus integrifoba Moraceae Petelot

12 |Mướp hương Luffa cylindrica Cucurbitaceae | Peiclot

¡3 |Mùi Coriandram sativum Umbelliferae Đỗ Tất lợi

fd | lau má Centela asiaLica 1mbelhferae Petelot

1S | Rau day Corchorus oljlorius Pilaceae Petelot

16 |Sệp sộp Ficus pumila Moraceae Đã Tất Lợi

i Sung Ficus glomerata Moraceae Đỗ Tất Lợi

i8 |Sữa Alstonia scholans Apocynaceae Petelot

19 | thâu đầu Ricinus communis Euphorbiaceae |Petelot

3 | Thong thao Teuapanax papyrifera Araliaceae Petelot

31 | Thuốc đồi Pouzolzia zeylanica Unticaceae Đỗ Tất Lợi

22 | Vong nom Urythrina indica Papilionaceae |Pctelot

Một số tác gid da nghiên cứu trên dich trích hệt bởi nước như GŨ

FUCHANG, TRUNG QUỐC, năm 1983 [22] cho biét là bã hột bông chứa

38,2 - 51,1 % protein g6m 16 loai amino acid, vdi acid glutamic và arginin có hàm

lượng 21,3 % va 12,1 % trên tổng số các amino acid,

Năm 1988 YUNUSKHANOV [71], x4c dinh các anuno acid trong hội bông của 3 cây Gossypium arboreum, G barbadense va G, hirsutum Ca 3 cay déu chita

Phần tổng quan - Chương Ì —§—

amino acid nhu acid aspartic, acid glutamic, glicin va alanin Céc amino acid có

tính acid chiếm > 25,3%; amino acid có tính ba¿ chiếm < 13,6 % trên tổng số

các amino acid

LE XUAN CUONG [I cho biết việc thử nghiệm trên con trâu sữa Ấn Độ

với khấu phần gôm rơm và thức ăn tình 7,75 Kg/con/ngày, Nếu giảm khẩu phần cơ

sở nầy xuống 4,6 Kự và bổ sung thêm bánh MUH (rÏ mat va uré), cộng thêm bã hột bông (0,45 Kg) vẫn duy trì được năng suất sữa của trâu 7 livngay những tăng lợi tức cho người chăn nuôi lên 2 rupi/ngay

Nam 1989, theo GUYOMARCH [25] , dich trích hội bông bởi nước nóng

chứa polisacarid gồm ramnoz, arabinoz, xiloz, manoz va ghicoz, NGu ding chat

trích thô này để nuôi chuột cái 3 tháng tuổi, cho ăn 400 mg/ngày hoặc 500 mg/ngày, lượng mỡ sữa trong tuyến vú tăng lên 3 hoặc 4 lần

Nam [990 , PAVLOVSKAYA (Tashkent) [55], xac dinh ham ludng protein

trong hội bông Gossypium hirsuium la 31-40 % , wong G, burbudense 1a 46-48 %

va tong G herbuceum là 28-30 %

Năm 1992, KENT và cộng sự [37], nghién cfu 14 mam của cây con

Gossypium hirsutum , 14 chifa enzym loai glioxisom để chuyển cdc lipid du uit

thành hidrat carbon cần thiết cho sự tăng trưởng của cây con

Tóm tất, sự nghiên cứu trên hột bông phần đông tập trung trên các phương

pháp ly trích gossypol từ hội bởi các dung môi hữu cơ ; phần trích ly bã hội bởi nước chưa được nghiên cứu

Mục đích của chúng tôi là tim hiểu phần dịch trích của bã hội bông bởi nước

nóng , làm Lăng tính lợi sữa thco kính nghiệm dân gian,

Cũng như các loại hột nói chung, hội bông chứa những cấu tử chính như celuloz, homiceluloz, pelisacarid, protcin, lignin và các chất ở tỷ lệ rất thấp như

protein du ui, glicoproicin ,cnzym, lipid, cdc chất có mầu và các chất vô cơ

Mặc dù người ta có thể phân tích các thành phần của thành tế bào, nhưng chưa có một hình ánh nào về cấu trúc phân tử của thành tế bào của cây được trình bày về polimer, về các nối liên kết giữa polimer Thí dụ thành tế bào nhất cấp gồm các sợi cơ bản là celuloz giống như một lõi kết ứnh có kết cấu trật tự cao, được bao quanh bởi những vùng vô định hình gồm những phân tử ccluloz gắn với polisacarid

và glicoprotein một cách lỏng lẻo Polisacarid pectic va hemiceluloz là chất kết dính gắn chặt các sợi co luloz

Hiện nay, chưa có phương pháp nào có thể tách rời một loại chất ra khỏi các

chất nêu trôn, nhất là khi trích ly cây với nước, Vì vậy, nếu thời gian trích ly với

nước kéo đài, các polisacarid không tan, acid hữu cơ, anuno acid sẽ bị trích cùng lúc,

Tùy thuộc ngưồn gốc, polisacarid trích ly bởi nước có thể là gôm, chất nhầy,

tình bột, fructan, pecúc, galacturonan Chúng có thể có trọng lượng phân tử rất lớn

Phan tong quan - Chuong |

- Chất nhầy - Hidrat carbon

Acid hóa - Fructan trọng lượng

phan nhánh và dễ phân tần trong nước để tạo dạng keo

Các đại phân tử có thể có dạng hình cầu hoặc dạng chuỗi Đại phân tử hình

cầu phân nhánh mạnh, và chuỗi dây được cuộn lại chặt chế nên bền và để tỉnh chế

như giicogen, albumin, hemoglobin Đại phân tứ hình chuỗi kéo dài theo một chiều

nên dài, mỏng như sợi tóc, sợi lở và gồm ccluloz trong cây, Nó rất uốn dóo và có thể cuộn lại thành lối Các đại phân tử hình chuỗi sẽ nằm cạnh nhau thành bó và

Phan téng quan - Chuong | — =

như thế chúng có nhiều điểm tiếp xúc nhau và các đại phân tử sẽ liên kết với nhau bởi nhiều loại nối, thường nhất là nội hidrogen Thí dụ như nguyên tử hidrogen của

nhóm -NH- của một prolcin và oxigon của nhóm carbonil ở chuỗi đạt phân tử nằm

kế bên Mặc dù nổi hidrogcn rất yếu (4-8 Kcal/mol) so với một nối hóa trị nhất cấp -(80- 150 Kecal/mol), nhưng với số lượng lớn của các cầu nối dọc thco chuỗi sẽ làm các đại phân tử gắn với nhau chặt chẽ,

Các đại phần tử hình cầu,do chỉ có vài điểm tiếp xúc nhau, nên có thể dễ dàng tách rời nhau,Vì thế, các polimcr hình chuối ít tan hơn các polimer hình cầu 1471, 1671

TREVOR ROBINSON {67| nêu ra một phương pháp tổng quát để trích các

chải trong thành tế bào thực vật được trình bày trong sơ đồ 1,

1.2.2 Mô tả thực vật cây hông

Cây bông là loài cây nhỏ, sống lâu, lá có 4 đến § thùy, ít nhiều có khía, Hoa

don kom thoo 3 lá bắc lớn có răng cưa; tràng hoa mẫu vàng và trỞ nên đỏ sau khi

nở hoa, Hoa mọc ở nách hoặc trên nhánh con ngắn Trái có dạng nang hình khối

bầu dục (4-8 x 3-4) cm, có 3 đến 5 ngăn hình noãn Trong mỗi ngăn, có 6 đến 12

hội mang những sợi tợ dài, Những sợi tơ mọc lên từ bề mặt của hột

Có 4 loài bông :foai 2 diploid A Chau vdi sui day va ngan (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum), loat 2 tetraploid Chau My vi soi dai rung binh (Gossypium hirsutum L.) va vdi soi dat (Gossypium barbadense L.) [T2]

Theo PETELOT A {76|, tất cả các bộ phận của cây bông đều có tác dụng trị liệu; cây hạ sốt ; lá, hoa bổ phối Nước ngâm đậm đặc của lá, hoa có tính chống

viêm Ở Mỹ người da đcn dùng vỏ rễ làm thuốc phá thai, Dịch trích hội với nước nóng có tính lợi sữa, dùng cho phụ nữ đang cho con bú để làm tang lượng bo trong sữa,

Hột bông nghiên cứu là hội của cây Gossypium herbaceum ,ho Malvaceae

Phan iéng quan - Chuong I —8—

Chương 11 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ TÌM HIỂU THÀNH PHẦN

HOA HOC CUA DICH TRICH LY BA HOT BONG BOI NUGC,

Mười một (11) phương pháp khác nhau đã được áp dụng để tìm hiểu thành

phần hóa học cũng như hoạt tính lợi sữa của dịch trích ly bã hột bóng bởi nước Ở dạng đông cô chân không

H.1 Phương pháp siêu lọc để tách chiết sơ bộ một số cấu tử hóa học của dịch

trích ly bã hột bông hởi nước :

Trong thập niên 60, nhiều tác giả đã cô lập protcin từ bã hột bông bằng cách

cho kết tủa chất trích ly với dụng dịch muối NaCl 10 % cộng phosphat 0,1M ở

pH 7.4 1531, với dụng địch nhosphalt 3 % {15}, với dụng dịch NaC] 2 M {35] hoặc

vdi dung dich NaOH 0,015 N [8]

Cuối thập niên 70, vài tác giả đã cô lập proein trong bã hội bông bằng phương pháp siêu lọc [41], 1621 Đến cuối thập niên 80, phương pháp siêu lọc được phát triển thêm , dùng màng lọc với lỗ có đường kính khác nhau để lọc các phân tứ

có trọng lượng phân tử khác nhau, Các tác giả đã dùng phương pháp này để khảo

- sái các polisacarid có trọng lượng phần tử > F0 KD và > 30 KD của 8 loại cây vùng Trung Á, trong đó có hột cây bông 139]

HI.2 Phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ (R.LA = RADIO IMMUNO

ASSAY) để thử nghiệm tính lợi sữa của các phân đoạn siêu lọc :

H.2.1 Các yếu tố có ảnh hưởng đến sự phái triển tuyến sữa :

Với phụ nữ, tế bào của mô tiết chỉ xuất hiện trong lúc mang thai, dưới sự tác động của steroid buồng trứng (oestrogen, progesteron, corlicoid);, hormon tuyến

yên ( hormon tăng trưởng và nhất là prolacUn)

Ở các loài động vật có vú, Lyon L và cộng sự [46] chứng mình rằng steroid

buồng trứng (E2 L7 progostcron) không thể làm phát triển tuyến vú của chuột,

thỏ cái, dê cái Nếu các steroid budng trứng không hiện diện, nhưng khi cho tác

dụng một lượng cao hormon tuyến yên hoặc cấy tuyến yên vào chuột , có thé lam tăng trưởng luyến sữa]491 Khi cho tác dụng chất CB 154 ,mội chất ức chế sự lạo prolacun ở giai đoạn đầu của việc tiết sữa , sữa sẽ không tiết ra được |33]

Chính prolacun ,chớ không phải các steroid buồng trứng ,giữ vai trò chủ yếu trong việc tiết sữa Progesteron không phải là hormon tuyến sữa chính yếu mà chỉ kết hợp trong quá trình ban đầu với oestrogen làm tăng trưởng tuyến sữa, làm các

hormon tuyến sữa khác như prolacun, glucocorticoid, insulin, hormon tăng trưởng nhạy cảm hơn Trong sO nay prolactin déng vai ro quan trọng ,còn khác hormon kia chỉ góp phần làm tăng khả năng hoạt động của prolacun.

Phần tổng quan - Chương II Go

Nơi loài động vật có vú sau khi sinh ,song song với hiện lượng tiết sữa, hàm

lượng prolacun cũng tăng theo một cách đáng kể trong máu,

Đo đó, nếu dịch trích ly của cây thuốc có ảnh hưởng đến việc kích thích sự tiết ra sữa, nó cũng kích thích sự tiết ra prolacún Vì thế ,việc định phan prolactin trong huyết tương của động vật được thứ nghiệm với chất trích của cây sẽ cho biết

tính lợi sữa của dịch trích cây trên,

Chúng tôi chọn phương pháp của tác giả MESSINGER H G |50] để đo hàm

lượng prolacun trong huyết tương của trờu và chuột cái bằng phương pháp định lượng miễn dịch phóng xa , nhằm m hiểu hoạt tính tăng sữa trên trừu và chuột của

các phân đoạn siêu lọc của dịch trích bã hội hông bởi nước

Việc thí nghiệm trên các sinh vật sống không phải bao giờ cũng đạt được kết

quả khả quan vì mỗi động vậi có độ nhạy cảm hormon khác nhau Ngoài ra có

nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tiết prolacin nơi con trừu,

Hàm lượng prolactin cda itu thay d6i theo chu kỳ động dục, thời gian ngày

đêm, sự căng thẳng thần kinh khi bị lấy máu lần đầu, nhiệt độ (theo mùa có íL hay nhiều ánh nắng mặt rời) |6]

Tất cả các phương pháp đo hormon đều sử dụng phương pháp định lượng

chất miễn dịch phóng xạ Phương pháp này dựa vào sự cạnh tranh giữa một kháng

nguyên không mang tính phóng xạ và một kháng thể có mang đông vị phóng xa với số lượng biết trước, cả 2 sẽ gắn vào một kháng thể đặc biệt, có số lượng biết trước và số lượng này sẽ íLhơn hoặc bằng tổng số các kháng nguyên ,

Phản ứng chung là :

Phức kết tụ giữa kháng nguyên và kháng thể

Với sự hiện diện của một kháng nguyên không phóng xạ, phản ứng sẽ là :

và (2) sẽ cân bằng theo định luật báo toàn khối lượng, Cân bang nay sẽ đạt được

nhờ một huyết thanh miễn dich dic biét (immusérum spécifique) giúp cho việc kết tủa hai phức chất |Ag - Ác |và | Ag - Ac | Việc định lượng được thực hiện

bằng máy do số phóng xạ.

Phan téng quan - Chuong I] —] © |

Vẽ đường biểu diễn chuẩn biểu thị số phần trăm của kháng nguyên có phóng xa nối liền với kháng thể ,khi có sự hiện diện tăng dần của kháng nguyên

không phóng xXa.Song song, chuẩn bị các ống nghiệm trong đó phần trăm của các

kháng nguyên phóng xa cũng được xác định như trên, những các kháng nguyên

không phóng xa được thay thế bằng mẫu cần định phan

HÌNH 1 : Đường biểu điễn chuẩn

% hoạt tính chung của LAg -Acl

Ag chung _: Số lượng kháng nguyên chung (Ag + Ag` )

Ag : Số lượng kháng nguyên cần định phân

Ag : Số lượng kháng nguyên có gắn phóng xa

H chung: Số lượng kháng nguyên gắn vào kháng thể,

B :_ Số lượng kháng nguyên phóng xạ bị gắn

Phương trình được biểu dién bằng mội hiperbon dạng y = ——

và trong phòng thí nghiệm, các đỡ kiện được xử lý bói chương trình mấy tinh

11.3 Định phân hàm lượng đường tổng quát bằng phương pháp so màu [74]

Đường trung tính thường hiện điện trong thâo mộc là aldohexoz như D-galacioz, D-glucoz , D-mannoz hoặc những aldopentoz như D-arabinoz,

13>-xHoz hay deoxihexoz như L-ramanoz, L-fucoz ( Hình 2).

Phan téng quan - Chuong II ¬

HÌNH 2: Cấu trúc các đường trung tính trong thảo mộc

Dưới tác dụng của acid vô cơ, pcnloz và hexoz trở thanh aldehid nhv

(ormaldchid, acctaldchid, crotonaldchid cùng với dẫn xuất của furfural như

5-hidroximetilfurfural hoặc 5-mectilfurfural và các sản phẩm giảm cấp không chứa

hệ thống nối đôi liên hợp

Tỉ lệ tương đối giữa dẫn xuất của furfura] với các chất hàm sắc thay đổi tùy theo nồng độ của acid, nhiệt độ, thời gian phan ứng Phương pháp này có sai số

trung bình khoảng 9 ‘%

Định phân bằng phương pháp so màu, các tác chất orcinol, antron, phenol, cistcin được sử dụng và antron được dùng nhiều nhất

Cơ chế phản ứng: antron hay 9,10-dihidro-9-oxoantraccn trong môi trường

acid nóng , kết hợp với sản phẩm giảm cấp của đường, chất dẫn xuất của furfural

để tạo thành chất có màu xanh dương lục |34| (hình 3)

Phan ứng nay hị ức chế bởi các chất oxid hóa và được hoạt hóa hởi các chất khử hay chất kháng- oxid hóa Vài tác giả đề nghị dùng chất kháng- oxid hóa như tiourê để ổn định dung dịch antron

Độ hấp thu cực đại của các chất màu tạo thành từ chất đường ở khoảng

620 nm, nhưng độ dài sóng được đo ở 585 nm để tránh hiện tượng giao thoa gây ra bởi sự hiện diện của các protein cũng cho phẩn ứng với tác chất antron.

Phân tổng quan - Chương H —12—

Acid uronic cling cho mau yu vdi antron, cé 46 hấp thu cực đại ở 560 nm;

ở 585 nm, độ hấp thu của acid uronic không đáng kể so với độ hấp thu của các chất

dường Osammn, acid sialic không tác dụng với antron,

H.Á Định phân các đường đơn trung tính qua dẫn xuất acetat alditol bằng phương pháp sắc ký khí 191

Polisacarid thủy gidi cho monosacarid, sau d6 monosacarid acctil héa thanh

dan xuat acetat bay hoi , x4c dinh bdi phudng pháp sắc ký khí,

Điều kiện cần thiết để chuyển hóa các polisacarid thành monomer thay đổi tùy theo câu trúc và thành phần cấu tao monomer cla cdc polisacarid Với _polisacarid đơn giản, sự thủy giải rất đễ đàng và khó khăn hơn nếu polisacarid chứa

đơn vị acid uronic hoặc osamin Các nhóm amino Ở vị trí C-2 của monomer của

hầu hết các polglicosamin bị prolon hóa khi thủy giải, do đó ổn định cầu nối gHcosic, Muốn bé gấy cầu nối này, cần điều kiện mạnh mẽ bơn với HCI 4 N,

100 °C , 2 giờ.

Thông thường sau giải đoạn thủy giải, monosacarid bị khử bởi borohidrur natriurn NaBHa ,ở nhiệt độ phòng ; ngoại trừ glucoz, ramnoz bị khử chậm hơn,

Các dẫn xuất của bor sẽ tạo phức với alditol, làm ngăn cần sự acell hóa ở giải đoạn kế tiếp, Các chất này bị loại bởi motanol dudi dang borat trimetil,

Thực hiện sự aceHl hóa bởi anhidrid aceblic với xúc tác piridim, Trích các

acelat alditol vita tao thanh bdi acetal cul

Chất dẫn xuất acetat alditol rất bên, có tính bay hơi, và thường dùng để phân

tích đường trung tính bằng phương pháp sắc ký khí 169{, hoặc sắc ký lỏng cao ấp

gua dẫn xuất 2-aminopiridin [28]

11.5 Phương pháp định phân acid uronie [7A]

Có nhiều loại acid uronic như acid D-plicuronic, acid L-iduronic, acid

I>galacturonic, acid I-manuronic nhưng cho đến nay, người ta chỉ tìm thấy acid D-galacturonic va acid D-manuronic wong polosid thực vật

Phần Tổng Quan - Chương H1 —l4—

OH

Carhazol hay đibenzopirol, trong môi trường acid, nóng , kết hợp với acid uronic cho sản phẩm có màu tím đặc biệt |1 7|

Theo BOWNESS [16], sau khi so sánh phổ hấp thu tử ngoại của nhiều dẫn xuất của acid [uranic và các sản phẩm giảm cấp của acid uronic bởi H2SÓa, với

sự hiện diện hoặc khiếm diện của carbazol, chính acid 5-formill furoic là nguyên

nhân tạo ra màu

Sự hấp thu của các mâu thay đối tùy theo loại acid uronic Hexoz cũng cho

với tác chất carbazol-sulfuric một màu vàng nhạt, nhưng hấp thu cực đại ở 410 nm,

trong khi độ hấp thu cực đại của cdc acid uronic 12 530 nm

Osamin, acid sialic khéng cho phan dng vdi carbazol-sulfuric

Protcin không cho hiện tượng giao thoa, ngoại trừ ở nồng độ 200 pg/ml Neu nông độ cao hơn 200 Iig/ml, sự giẩm cường độ mầu Xây ra

Các muối natriam, kaHum, amonium làm giảm cường độ của phần ứng

Phương pháp sử dụng carbazol tiện lợi, tuy vậy mỗi lần định phân vẫn phải

đo lại các dung dịch acid uronic chuẩn để thiết lập đường biểu diễn chuẩn,

ïl.6, Phương pháp định lượng protein toàn phần :

Protcin được định lượng thoo phương pháp so màu của LOWHRY [45] Cho

đến nay, phương pháp này vẫn còn hiệu quả ,với nhiều cái tiến bằng cách sử dụng thudc thd Coomassic Brilliant Blue G.250 [65]

Khi phẩm màu Coomassie nối với protein trong môi trường acid, có sự chuyển màu của dụng dịch từ nâu đỏ qua xanh đương, tương ứng với sự dịch

chuyển độ hấp thu từ 465 mm đến 595 mm,

Phẩm màu xanh Coomassie Brilliant G-250,

Trudc day, theo DIAMANT B [16] , phdm mau gan với protein ngang qua

nhóm sulfonic, nhờ lực hấp thu tinh dién Gan day, theo COMPTON S.J.[14]

Coomassie hiện diện ở 3 trạng thái cân bằng : cauon, trung tính và anion với các

mũi hấp thu quang phổ lần lượt là 595, 650 va 465 nm Dang anion gắn với protein

- dựa trên sự dịch chuyển hấp thu từ 465 mm đến 595 mm Số lượng coomassic gắn

vào mỗi phân tử protein tỉ lệ với điện tích dương của protein :khoảng từ I,5 đến 3 phân tử chất màu cho | dién tich [64]

Thuốc thử coomassic của hãng PIERCE cực nhạy với nồng độ protcin thấp,

(thí dụ với bovine serum albumin | ug/ml) ; khong bị ảnh hưởng bởi hầu hết các

chất cần trở

Phức chất protein - phẩm màu ổn định trong thời gian 60 - 90 phút, ở nhiệt

độ phòng Tác chất được sử dụng để đo protein và polipeptid có trọng lượng phân

tử >3 KD Tuy nhiên, do nồng độ phẩm màu thay đổi theo nhiệt độ, nên cần thiết phải thiết lập đường biểu diễn chuẩn cho mỗi lần đo |59|

II.7 Định phân Amino Acid bằng máy sắc ký lồng cao áp

Trong I0 năm gần đây, người ta thường định phân các amino acid bang phương pháp sắc ký lỏng cao áp, qua dẫn xuất của amino acid với fluorenil

metilchloroformat (FMOC-CI), orthophtaldialdehid (OPA), phenilisotiocianat (PITC) [13] va 6-aminoquinolil-N-hidroxisucinimidil carbamal (AQC),

Phan Téng Quan - Chuong I —16—

Với FMỌOC

Hy -O-C- nà" ne COO"

Dẫn xuất của FMOCC

Phần ứng xảy ra nhanh ở nhiệt độ phòng; chất dẫn xuất của nó bền trong nhiều giờ Dẫn xuất FMOC bị ảnh hưởng bởi muối và các tạp chất Cần sử dụng dung môi hữu cơ để trích sản phẩm trước khi áp dụng sắc ký lỏng cao áp

PTC - amino acid có hiệu suất thấp và thay đổi bất bình thường (như asparlat,

glutamaU, nhất là khi có sự hiện điện của muối, kim loại, các lon của dụng dịch

độn Vì thế, sự chuẩn bị mẫu phân tích đòi hỏi nhiều giải đoạn như đông khô chân

không mẫu phân tích, làm bay hơi các chất dẫn xuất của amino acid, tỉnh chế chúng

bằng sắc ký trao đổi ion, cần thời gian ít nhất 105 phút để phân tích một mẫu

Véi OPA (orto-phtaldialdchid} |24|

Phương pháp này hiện đang thông dụng, vì OPA tao thành chất dẫn xuất nhanh với amino acid, Việc tách các dẫn xuất có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ phòng,

với độ nhạy cao,Phương pháp ít cho phần ứng phụ, để thao tác tự động trên may

Tuy nhiên, OPA không phản ứng trực tiếp với amin nhị như prolin,

hidroxiprolin, Do đó, cần oxid hóa vòng imino (acid) của prolin bởi cloramim-T,

6-Aminoquinolil-N-hidroxisucinimil carbamat (AQC) là tác chất cho dẫn

xuất hồn với amino acid nhất và nhị cấp ,rong vài giây đồng hỗ Sự tách các chất dẫn xuất rất dễ bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC

Phương pháp có ưu điểm là các tác chất thừa trỏ thành aminoguinolin

(AMO), với độ hấp thu À cực đại = 520 nm khác hẳn so với dé hấp thu của AQC

Các phương pháp trên đều có ưu và khuyết điểm, tùy thuộc điều kiện, sử dụng một

trong những phương pháp nêu trên để phân tích các amino acid.

Phin Téng Quan - Chuone H

Glicin(Gh) Alanin(Alanin) — VahnCVal) Leucin(Leu)

Isoleucin (He) Serin (Ser) Treonin (Thr) Phenilalanin (Phe)

Phần Tổng Quan - Chuong II —]9—

L8 Phương pháp sắc ký lọc GEL

Một trong những phương pháp đầu tiên thường được sử dụng để tính chế các

đại phân tử như protein, acid nucleic hay polisacarid là sắc ký lọc gel (chromatographic par gel filration) Nguyên tắc của phương pháp là các phân tử trong dung dịch được tách do kích thước khác nhau của chúng và tách theo phân tử khối giảm dần Các gel thông dụng có tên thương mại như Sephadex, Sephacryl, Scpharoz Chất gol là một loại polimcr phân nhánh của dextran va biacrilamid,

- không tan nhưng rất ngậm nước Nó có dạng hình cầu tròn, đường kính trung bình

là 100 pm,

Làm trương nở gel trong dung môi sẽ dùng trong phép sắc ký ; cho gel vào

cột ; cho tiếp mẫu chất vào đầu cột gol Khi giải ly, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ, phân bố trong dung môi ở khoảng trống giữa các hạt gel, nó cũng có

thể xuyên vào và nằm trong những hạt gol ; các phân tử có trọng lượng phân tử

lớn, không thể chui vào các hạt gol, nằm trong dung dịch , chiếm không gian giữa

các hạt gel Khi giải ly, phân tử lớn sẽ di chuyển nhanh ,, ra khỏi cột gel trước tiên

HÌNH 4 : Sự tách các phân tử do kích thước khác nhau bằng phương pháp sắc ký

Tùy theo mẫu chất có chứa phân tử có trọng lượng phân tử lớn hay nhỏ ,lựa

chọn loại gel thương mại có độ chặn từ ! K]) đến 20000 KI

Ưu điểm của phương pháp là bảo toàn được hoạt ứnh sinh học của protcin

khảo sát, nghĩa là, sau phép sắc ký lọc gol, cấu trúc nguyên thủy của protein vẫn

giữ nguyên

Khuyết điểm của phương pháp là khả năng tách có giới hạn.Thí dụ : protcin

là chất đa điện phân mà bề mặt của nó mang những tâm ít, nhiều ky nước ; các lâm

Phần Tổng Quan - Chuong —20——

này có thể tương tác với pha động bằng nhiều cách, làm ảnh hưởng đến thành phần chất giải ly

Tùy theo pH của dung dịch độn, lực ion, điểm đẳng điện của protein, có 3

loại tương tác giữa protein với pha ứnh của sắc ký : thí dụ protein có điện tich 4m trong dụng dịch độn ,bị giải ly lớn hơn dự đoán, so với khối lượng phân tử tương đối của — nó |!ð9], Vài loại gel thương mại của hãng PHARMACIA (Bảng 3)

BANG 3: Vai loại gel thương mại của hãng PHARMACIA

Tên Khả năng phân tích Chất cá thể Kích thước

luại gel dextran protein dang c4u ap dung hat gel

tran (um) Sephacryl 100 HR 1 Q00 - 190000 Peptid-protein 25-75

Sephacry! 200 HR 1000 - 80000 $000 - 250000 Polisacarid 25-75

Đại phân tử Sephadex G-100F 1000 - 100000 4000 - 150000 -nt- 40 - 120 Sephadex G-100 SF {000 - 100000 4000 - 100000 -nt- 20 - 50 Superoz 12 1006 - 300000 LQ00 - 300000 Dang cho may FPLC 20 - 40

Bondage! 11-125 2000 - 50000 Dang cho may HPLC 20 - 50

H.8 Phương pháp sắc ký trao đổi lan :

11.9,1,Khái niêm tổng quái về thành tế bào thực vật :

Theo TREVOR ROBINSON [671 , vách của thành tế bào thực vật gồm ba

load polisacarid rcolulo2, homicc lIlQ2, polsaocarild poobHc Nhóm polisacarid pectic

gồm tất cả các polisacarid trích ly từ thành tế bào bởi nước nóng Hemuiceluloz được trích bởi dụng dịch kiềm tương đối mạnh và phần bã còn lại sau khi trích kiềm là

celuloz,

Polisacarid pectic 1a hén hợp phức tạp polmer acid và trung tính [73|., Nó

là thành phần chú yếu trong trái, hội rau Chuối dây chánh gồm các acid D- galacturonic ni vdi nhau bằng œ 1-4 va day chánh nầy xen kẻ bởi những đơn vị

L.-ramnoz L-rammoz nối vào acid uronic bởi C-Í và C-2 của nó để tạo nên góc lệch

- 90” so với trục chánh gọi là khuýu pecbc Trên những carbon C-2, C-3, C-4 của ramnoz và acid galacturonic, đôi khi có gắn thêm những đường khác như 6-D-xHoz, 8-ID-galacloz, L-arabinoz Do chức acid, pecun để tan trong nước,

Cấu trúc tiêu biểu của pecun [79] được trình bày wong hình 5

Chất pectic của cây tìm thấy nhiều trong tế bào nhấp cấp (55 %) và liên tế bào, hiện diện nhiều trong cây 2 lá mâm hơn là cây 1 lá mầm Nó gồm hỗn hợp

araban, galactan, metil eter cla galacturonan, chứa xioz, ramnoz Cá phân tử là

một khối dị- polimer, có trọng lượng phân tứ lớn gôm 1000 đơn vị hoặc nhiều hơn,

Phân Tổng Quan - Chuang H —21—

HÌNH 5 : Cấu trúc phân tử tiêu biểu của pectin

Ở pH cao, nhiều carbon hidrat hoạt động như anion và có thể tách bởi resin

trao đối anion,/Trong vài trường hợp , có thể đồng resin trao đổi cation

H.9.2.Phương pháp sắc ký trao đổi iọn :

Kỹ thuật này dùng để cô lập và tách các chất có mang điện tích,với điều kiện là một vài chất có thể gắn bằng lực nối tĩnh điện với chất trao đổi ion và một

số chất khác không có tính chất trên, thoo tiến trình được mô tả như hình 6

Nguyên tẮc này có thể áp dụng cho chất có mang một loại điện tích đơn

giản, nhưng vẫn có thể áp dụng cho các đại phân tử như protein, mang những điện

Trong sắc ký trao đổi ion, sự lựa chọn loại ma trận (anion hay cation) thy

thuộc vào điểm đẳng điện pI của protcin, và độ bền của protein trong một khoảng

pH của dụng dịch

Hình 6A : Chuẩn bị để chất trao đổi lan mang đầy đủ các điện tích

Hình 6B : Các chất cần phân tích được cho tiếp xúc với chất trao đổi ion trong một thời gian vừa đủ để thiết lập cân bằng

Chất trao đổi ion @ + Z C— chất rao đổiion © © Z

Chất trao đổi ion mang điện tích âm và X”, VYHỲ, Z' là các lon đương Còn các

phân tử trung tính và các lon âm không gán vào cột sẽ được loại ra khỏi cật

Hình ÓC, 6D ; Những ion dương VYHT, 2” gắn vào chất nền duần tự bị đuổi ra khỏi

cột trao đổi ian khi tăng nồng độ X ; để X” có khả năng thay VHỲ và 2 trong cân

hằng trên, hoặc tăng dé pH dé chuyén YH" va Z thank ¥°, ZOH

Khi nồng độ X” được tăng; lực nổi tày thuộc vao sO dién tich cha YH* va Z* Chất càng mang điện tích lớn, nồng độ của X” phải càng lớn để duổi nó ra khỔi cội

Hoặc khi pH thay đổi lực nối tày thuộc pK cia loai ion (YH + ON === Y + HOH hoặc 7 + ON === ZOH), néu pK chaion

2 hoặc VHT càng cao, pH của dụng dịch phải lán,

Nói chung, sắc ký trao đổi anion đùng để tách các protein acid và sắc ký trao đổi caton dùng để tách protein mang tính baz [13] Tuy vậy,tầy thuộc pH, phân tử

protein c6 thé trở nên âm điện hoặc đương điện Nếu pH tăng, protein trở nên âm

điện HẠH - CH(R) - COO” và gắn vào chất trao đối anion và nếu pH thấp, acid, potcin tr nên dương điện HẠN” - CH(H) - COOH và gắn vào chất trao đổi

cation,

Phần Tổng Quan - Chuong H —23—

HÌNH 7 : Ảnh hướng của pH trên điện tích toàn phần của protein

BẢNG 4: Mội số chất trao đổi ion thông dụng

1Loại chất trao Đặc tính Nhóm chức hoạt động - | Chất phân

DEAE — A.235 | Chất trao đổi anion, baz yếu Dietilaminoetil | -

Sephadex À.50 -O-CHa-CH2- NH(C2Hs)2ÖlÐ CI

QAR A.25 | Chất trao đổi anion, baz manh | Dietil-(2-hidroxipropiDaminoetil

-O-(CH)2— CHạ-CH-CH3, CI

C2Hs OH

cM C-25 | Chất trao đổi cation, acid yéu Carboximetil + :

Sephadex C-50 -O-CH5-COO Na Na

SP C-25 | Chất trao đổi cation, acid manh Sulfopropil

Chỉ số A-25 hay C-50 với A là chất trao đổi anion; C là chất trao đổi cation

Số 50 cho biết chất trao đối ton có nhiều lễ xốp hơn, thích hợp cho đại phân tử có

trọng lượng phân tử > 30 KÔ.