Nghiên cứu iii về thành phần dịch trích bã bột cây thông

Nghiên cứu iii về thành phần dịch trích bã bột cây thông

Phần Nghiên Cứu - Chương IV —67—

Chương IV NGHIÊN CỨU PHÂN ĐOẠN CÓ HOẠTT TÍNH LỢI SỮA :

PHAN BOAN 50KD - 100KD VA PHAN BOAN SKD - 50KD

Các kết luận ở chương HH cho biết các phân đoạn của chất trích bã hột bong

đêu chứa prolein và polisacarid Một phần đoạn có hoại tính lợi sữa phải chứa

prolcin và polisacarid với hàm lượng cao, Sự tỉnh chế kế tiếp là giai đoạn cần thiết

để ñm hiểu thêm về các phân đoạn có hoạt tính lợi sữa „

Có nhiều phương pháp để nh chế, dựa trên sự khác biệt của các phân tử về

kích thước, độ hòa tan trong dung môi, điện tích của phân tử, tính ái lực đặc biệt của vài loại nối chứa trong phân tử Với các đặc tính nêu trên những phương pháp

tịnh chế sử dụng là: sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực

IV.1 Sade ky lee gel

V.I.! Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lọc ge}

Gel thông dụng có tên thương mại sephacryl, sephadex, sepharoz, là mội loại polmer có nhánh của dextran, Nó không tan nhưng rất ngậm nước, có dạng

hình cầu tròn, đường kinh trung bình 0,1 mm,

Cho dụng dịch gel bảo hòa trong dụng môi vào cột sắc ký , tiếp đó, cho mẫu chất đầu cột Khi giải ly, các phân tử có trong lượng phân tử nhỏ , được phân bế trong dụng môi ở khoáng trống giữa các hạt gel và có thể xuyên vào nằm trong

những hạt gei Phân tử có trọng lượng phân tử lớn không chui vào các hại gel, 6 trong dung dịch, chiếm không gian giữa các hại gel, sẽ di chuyển nhanh ra khối cột

trước (Phần tổng quan 11.8)

1V.1.2 Phương pháp sắc ký lọc gel dùng gel SEPHADEX G-100 cực mịn ,áp dụng

£V.1.2.a thực nghiệm

Kich thudc cét: chiéu cao 55 em

thé tich chung 905 ml thể tích trống 280 mi Theo dõi sắc ký : bằng khúc xạ kế

Thực nghiệm : hòa tan phân đoạn 5Ö - 190 KD (2g) trong nước cất (16m) Đun nóng cách thủy vài phút, Ly tâm 9,000 vòng / phút trong l§ phút Thu được

can (50 mg) Cho dung dịch vào đầu cội sắc ký, dùng nước cất làm đụng môi giải

ly với vận tốc 0,25 mÍ / phút, Hứng chất dụng ly trong những ống nghiệm, Đông cô chân không các phân đoạn thu được,

Phần Nghiên Cứu - Chương IV — 68 —

Phân tích hàm lugng nitrogen và phân tích với máy sắc ký lồng cao áp ,dùng

cot BONDAGEL E-125, van tốc giải ly 0,5 trl/phút,một số phân đoạn

SO thứ tự "Tên "thể tích, | Chất đông cô | Hàm lượng | Phân tích

TY | ông nghiệm | phân doạn (mn chân không, nitrogen kiểm tra Chi chi

(img) (4)

2 L-10 GI 8S G

3 11-21 G2 93 37.6

4 22 - 36 G3 130 95.1 45 với HPLC {phân doan dau A}

5 37 - 48 G4 9 86.1 5.4 {phan doan chanh B)

& 49-81 G5 247 734.3 8.7 vdi HPLC -at-

7 &2 - 107 G6 218 642.8 2.5 vdi HPLC (phan doan cudi C)

Phần Nghiên Cứu - Chương IV — 69 —

HINH 20: So sánh các phân đoạn của phương pháp sắc ký lọc gel G-I00 bằng máy

HPLC, cột BONI)AGEL E -125 , phát hiện bằng tử ngoại ở 250 nm

PHAN DOAN SIEU LOC 50 - 100 KD

ape | \ me me ote meee may ae me Se 1 \

_" fime Beee Papin of 3)eec)

Earngllũs = oot Yrscale gteP =

“gH ey gL PT HE ha , “ ¬ ‘ *}

Phần Nghiên Cứu - Chương IV —70—

HÌNH 2I : Kết quả điện di các phân đoạn của sắc ký lọc gel G-100 cực mịn, áp

dụng trên phân đoạn siêu lọc 50 - LOO KD | Điện di SDS-PAGE với T= 10-20 % , C=2,7 %.Ban gel 10cmx10cm ,

dầy Imm Cường độ dòng điện không đổi 10 mA ,trong 160 phút

HINH 21

Các cột theo thứ tự từ trái qua phải

Cột Ï Chất trích thô D

Cột 2 Phân đoạn siêu lọc 50 - 100 KD

Cột 3 Chất chuẩn của hãng PHARMACIA

Cột 4 — Phân đoạn sắc ký lọc geL G3

Cội 5 Phân đoạn sắc ký lọc geL G4

Cột 6 — Phân đoạn sắc ký lọc geL G5

Cột 7 — Phân đoạn sắc ký lọc gel G6

Cội 8 — Phân đoạn sắc ký lọc geL C7

Cội 9 — Phân đoạn sắc ký lọc geL G8

Phần Nghiên Cứa - Chương IV

S6 cm 3em

615 mi

215 mi Thực hành : Hòa tan phân đoạn 50-100 KD (2g) trong nước cất, (25 mÐ, Đun cách thủy vài phút Ly tâm 15.000 vòng/phúi trong L5 phút, Thu được cặn (262 mg), Cho

phần dụng dịch trong vào đầu cột sắc ký, dùng nước cất để giải ly với vận tốc

0,3 ml/phút, Đông cô chân không các dung dịch thu được

Phân tích hàm lượng nitrogen, ham lượng đường ; phân tích bằng sắc ký lổng

cao áp ,trong mội số phân đoạn -

IV.1.3.b Kết quả

Ghi trong các bảng 24, 25 và các hình 22, 23, 24

BẰNG 24: Phương pháp sắc ký lọc gel SEPHACRYL S-200 HR, áp dụng trên phân

doan siéu loc 50 - 100 KD

Số thứ tự| Tên | Thể | Chất đông cô | Hàm lượng | Phân tích | Phân tích

TT! ống | phân | úch, ee mioget | đường | kiểm tra | Ghỉ chú nghiệm |doan} ml

7 | 64-75 ] H6 | 67 174 5.4 Ì Phân tích |với HPLC | Phân đoạn

Phần Nghiên Cứu - Chương IV we TB

BANG 25 : Két qua phan tích hầm lượng đường đơn của các phân đoạn khác nhau,

tích ramnitol | fucitol |arabinitoll xiHitol | manitol | galacttol

-Phần Nghiên Cứu - Chương 1V —_73—

HÌNH 23 : So sánh môi số phân đoạn của phép sắc ký lọc gel Sephacryl S-200HR,

phân tích bằng máy HPLUC, cột Bondagel E -125; vận tốc chây

0,5 mH/ phút ; phát hiện ở 250 nm,

3 t2 La t£ Hà ee 2

7 2Omia oles coped Phút gẽ

2 Dit erscale ssf =,0đ2n - BQ, tla 4

Phần Nghiên Cứu - Chương IV 74

HÌNH 24 : Kết quả điện di các phân đoạn của phương pháp sắc ký lọc gel SEPHACRYL S-200 HR, áp dụng trên phân đoạn 50 -100 KD Điện di SDS-PAGE véi T= 10-20 % , C=2,7 %.Bản gel I0cmxI0cm ,

dây Imm Cường độ dòng điện không đối 10 mA ,trong 160 phút

I 2 3 4 5 6 7 §

Các cột theo thứ tự từ trái qua phải

Cột Ì Phân đoạn sắc ký HI Cột 2 Phân đoạn sắc ký H2 Cội 3 Phân đoạn sắc ký H3

Cột 4 Phân đoạn sắc ký H4

Cội 5 Phân đoạn sắc ký H5

Cột 6 Chất chuẩn của Hãng PHARMACIA

Cột 7 Phân đoạn sắc ký H6 Cột 8 Phân đoạn sắc ký H7

Phần Nghiên Cứu - Chương IV —T5—

1V.1.4 Phương pháp sắc ký lỏng nhanh protein (Fast protein liquid chromatograph

FPLC) 4p dung trên phân đoan siêu lọc 50 - 100 KD

Nước cất

Acetat amonium 20 mM pH 7,4 Phosphat 50 mM pH7 + NaCl 100 mM Glucoz 1 %

Thực hành : Hòa tan phân đoạn 5 - 50 KD (82 g) trong nước cất (25 ml), dun cach

thủy vài phút Ly tâm 15000 vòng/phút trong 1Š phút Thu được cặn (130 mg) Phần dung dịch trong được cho vào đầu cột, dùng nước cất để giải ly với vận tốc 0,15 ml/phút Đông cô chân không các dung dịch thu được

Phân tích hàm lượng nitrogen, hàm lượng đường và phân tích bằng sắc ký

lỏng cao áp trong một số phân đoạn

Phần Nghiên Cứu - Chương IV

Phần Nghiên Cứu - Chương IV —T?—

HÌNH_26 : Kết quả điện di các phân đoạn của phương pháp sắc ký lỏng nhanh

protein, áp dụng trên phân đoạn 50 - 100 KD

Điện di SDS-PAGE với T=10-20 %, C= 2,7 %.Bản gel I0cmxI0cm

dầy [mm.Cường độ dòng điện không đổi 10 mA,trong 160 phút

Các cột theo thứ tự từ trái qua phải :

Cột 1 : Cột 2 : Cội 3 : Cội 4 : Cội 5 :

Cội 6 :

Cột 7 : Cội 6:

Cột 9 :

Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 6 Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 7 Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 8 Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số II Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 22 Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 27 Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 37 Chất đông cô chân không thu được từ ống nghiệm số 66

Chất chuẩn của hãng PHARMACIA

Phần Nghiên Cứu - Chương IV

BANG 26 Phương pháp sic ky loc gel SEPHACRYL S-100 HR, 4p dung

trên phân đoạn siêu lọc 5 - 50 KD

PP; SPR | Tên | Thể | Chất đông - Hàm Phân | Phân tích | Ghi chú

ống | phân | tích | cô chân lượng tích kiểm tra

nghiệm | đoạn | (ml) | không (mg) nirogen| đường

lích ramnitol |fucHoll arabinitol | xilitol| manitol | galactitol

Phần Nghiên Cứu - Chương IV —73—

HÌNH 27: Sắc ký lọc gel SEPHACRYL S-100 HR áp dụng trên phân đoạn

siêu lọc 5 - 5Ố KD, theo đối bằng khúc xạ kế,

8) Chúng tôi áp dụng sắc ký lọc gel trên 2 phân đoạn siêu lọc 50-100 KD và 3-59 KD, với các loại gei khác nhau (Sephacryi S-100 HR, Sephacryi S-200 HR, Sephadex G-100 SF, Sepharoz ), và dụng dịch giải ly khác nhau (nước cất, dung

dich acetat, dung dịch phosphat, dụng dịch giucoz , ).Kết quả thí nghiệm cho biết

là :

Các loại gel cho kết quả như nhau,

Dung dich gidi ly tốt nhất là nước cất

Hai phân đoạn siêu lọc cho kết quả gần như nhau,

bì Các sắc ký đồ có đạng tổng quái như sau :

Độ khúc xa

Phân Nghiên Cứu - Chương ƒV — 80—

HINH 2§ : So sánh một số phân đoạn của phép sắc ký lọc gel SEPHACRYL

S-100 HR , phan tích bằng máy HPLC, với cột BONDAGEL E-125,

tae z &31uzeCt 6 Time Đ——=5m1n CÃ, J2seC)

Baseline = off Y-scale step =, ABE

(1-6) 2

Phần Nghiên Cứu - Chương IV

—l

HÌNH 29 : Kết quả điện di các phân đoạn của phương pháp sắc ký lọc gel

SEPHACRYL S-100 HR, áp dụng trên phân đoạn 5 - 50 KD Điện di SDS-PAGE với T=10-20 %, C= 2,7 %.Ban gel I0cmxI0cm

đầy Imm.Cường độ dòng điện không đổi 10 mA,trong 160 phút

Cội 8:

Cội 9:

Chất trích thô D

Phân đoạn siêu lọc 5 - 30 KD

Chất chuẩn của hang PHARMACIA Phân đoạn sắc ký lọc gel JI

Phân đoạn sắc ký lọc gel J2 Phân đoạn sắc ký lọc gel J3

Phân đoạn sắc ký lọc gel J4

Phân đoạn sắc ký lọc gel J5

Phân đoạn sắc ký lọc gel J6

Phần Nghiên Citu - Chương IV

——82—

Kết quả sắc ký lọc gel cho biét 1a dù phân đoạn đầu A, phân đoạn giữa B,

phân đoạn cuối C có khác nhau về hàm lượng nirogen, protein (Bảng 28), nhưng kết quả phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp và điện di SDS-PAGE cho thấy các phân đoạn sắc ký thu được đều tương đương nhau,

Điện đi cho thấy các phân đoạn đều chứa các phân tử có trọng lượng

190-94 KD

BANG 28 : So sánh tổng quái các phân đoạn của sắc ký lọc gel, áp dụng trên

phân đoạn siêu lọc 50-100 KD

Phân đoạn | Trọng lượng chất | Hàm lượng Hàm lượng

sắc ký lọc gel thu hồi, Z Nitrogen, % | protein, %

Tém lại, phương pháp sắc ký lọc gel với nguyên tắc tách các đại phân tử

dựa trên sự khác nhau về hình dạng và kích thước của các phân tử, không có hiệu quả trong việc tách riêng các loại đại phân tử khác nhau trong chất trích

bã hột bông bởi nước

IV.2 Phương pháp sắc ký trao đổi anion

1V.2.1 Muc tiêu của nghiên cứu

Theo TREVOR ROBINSON [67], vách của thành tế bào thực vật gồm ba

loại polisacarid : ccluloz, hemiceluloz, polisacarid pectic Polisacarid pectic gồm _ các polisacarid trích ly từ thành tế bào bởi nước nóng Đây là hỗn hợp phức tạp các polimer trung tính và acid, Đế tách riêng hai loại polisacarid trên, người ta thường dùng chất trao đổi ion DEAE để tách các polisacarid có tính acid như

tra khỏi polisacarid trung tinh như araban, galactan

không gắn vào DEAE mặc dù chúng

ramnogajaciuronan

(araban, galactan

ramnogalacturonan) [36]

Các phân tích hóa học ở chương

50 - 100 KD va phan doan 5 - 50 KD chia hai loai polisacarid va protein Ap

dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để tách riêng 2 loại đại phân tử trên,

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký trao đối ion được trình bày ở phần tổng

Phần Nghiên Cứu - Chương IV —3—

Ngoài việc lựa chọn chất trao đổi lon, các điều kiện khác cũng cần được

quan tam như : dụng dịch đệm để giải ly, pH và nồng độ của dung dịch đệm

Theo WHATMAN 1701 cần chọn dung địch đệm theo tính chất đặc trưng

của nó; thí dụ dung dịch đệm borat dòng cho các chất chứa đơn vị hidrat carbon

Bang 29 cho biết khoảng cách pH cho dung dich dém

BẰNG 29 : Khoảng cách pH của vài dụng dịch đệm

Theo PHARMACIA, [58] phudng pháp ñm pH thích hợp để thực hiện sắc ký

_ trao đổi ion đối với một mẫu chất là :

1V.2.2.a Thử nghiệm với chất trao đổi anion DEAE A.50

- Chất trao đổi lon : SEPHADEX DEAE A-50, hoại động ở pH 2 - 9

( -O-CH2-CH2- TNH(C2H4)2 CÝ )

- Chất thử nghiệm : Phân đoạn siêu lọc 50-100 KD

- Đang dịch đệm : alkilamin, iris, borat, piridin, amidazol

Ding borat 0,5 M va 0,05 M

- Lý thuyết :

lg DEAE trưởng nở thành 30 mÚ trong dụng dịch nước

ig DEAE gan vdi 9g chất hemogiobin có trọng lượng phân tử 69000

Dang! ml dung dich DEAE cho | mi dung dich chifa 10 mg chất đông cô

chân không của phân đoạn siêu loc 50-100 KD

- Thực nghiệm và kết quả : Trong ống nghiệm 30 ml ,cho chất trao đối lon

DEBAE A-50 (0,1g) vào mỗi ống nghiệm theo hình 30

Cân bang gel trong mỗi ống nghiệm bằng cách rửa 10 lần, mỗi lần với lÔml

dụng dịch đệm borat 0,5M: ,có pH thay đổi như ở hình 30, Kiểm tra pH của mỗi

ống nghiệm Tiếp theo,cân bằng gel trong mỗi ống nghiệm bằng cách rửa 5 lần, mỗi lần với 10 mủ đụng dịch đệm borat 0,05 M ,có pH thay đổi như ở hình 30

Phân Nghiên Cứu - Chương IV

—#4—

HÌNH 30: Độ hoại động của chất trao đổi anion DBAE A-50 theo pH

DUNG DICH DEM VA CHAT THU NGHIEM

Cho vào mỗi ống nghiệm Í ml dụng địch có chứa !Ò mg phân đoạn

50 -100 KD Lac céc ống nghiệm trong 40 phút và để yên cho gel lắng xuống, Quan sất các ống nghiệm : chất gắn vào gel trao đổi ion DEAE 6 pH 8 - 85 Trong thí nghiệm, chọn pH để chất có thể gắn vào gel trao đối lon và cũng có thể rời gel đễ nhất

Điều kiện thích hợp là borat 0.05 M_ pH 8.5

V.2.2.b Thủ nghiệm với chất trao đổi catlion CM C-25

- Chất trao đổi catlion SEPHADEX CM C-25

- Chất thủ nghiém : phân đoạn siêu lọc 5Ó -100 KD

- Các dụng dịch đệm : acctat, cHrat, phosphat, barbiturat

Phần Nghiên Cứu - Chương ]V

—88—

HÌNH 32 : Kết quả điện di của phần dung dịch nổi ở trên trong các ống nghiệm

(với chất trao d6i cation CM C-25)

Điện di SDS-PAGE với T=10-20 %, C= 2/7 % Ban gel 10 cmx10 cm;đầy

lmm Cường độ dòng điện không đổi 10 mA , trong 160 phút

1 B3 g6 7-š | oiõ

Các cột theo thứ tự từ trái qua phải

Cột Ï : phân đoạn siêu lọc 50 -†00 KD

Cột 2 : phần nổi ở trên trong ống nghiệm, pH 3

Cột 3 : phần nổi Ở trên trong ống nghiệm, pH 3,5 Cội 4 : phần nổi Ở trên trong ống nghiệm, pH 4 Cội 5 : phần nổi ở trên trong ống nghiệm, pH 4,5 Cội 6 : phần nổi ở trên trong ống nghiệm, pH 5 Cột 7 : phần nổi ở trên trong ống nghiệm, pH 5,5 Cột 8 : phần nổi ở trên trong ống nghiệm, pH 6 Cột 9: phần nổi ở trên trong ống nghiệm, pH 6,5 Cột 10 : chất chuẩn của Hãng PHARMACIA

Phần Nghiên Cứu - Chương IV _

1V.2.2.c Đo điểm pÏ của các phân đoạn siêu lọc

- Đo pÏ bằng phương pháp điện di, sử dụng gel pobacrilamid với chất ampholyt có

Thự tự mẫu từ trên xuống dưới

Dấy lvà2 : chất trích thô bã hội bông bối Hước

Ddy3va4 : phân đoạn siêu lạc 50 -100 KD

Đấy Svà6 : phân đoạn siêu lọc 2 -20 KD Đấy7vàð + phân đoạn siêu lọc > 100 XD

Phân Nghiên Cửu - Chương IV

- Thực nghiệm : Hòa tan phân đoạn 5Ö -!00 KD (500mg) trong dụng dịch đệm borai 0, M 6 pH 8,5 (15 ml) Dun cách thủy vài phút, Ly tâm 15000 vòng / phút trong 15 phiit Thu được cặn (27,5 mg) Cho dung dịch trong vào phần trên của cội,

Ding dung dich borat 0,1 M pH 85 cộng thêm với NaCl có nồng độ tầng đần tuyến tính từ 0M đến 1M để giải ly ,với vận tốc 0,6 ml / phút,

Thu chất giải ly thu trong những ống nghiệm 10 ml, và hỗn hợp lại thành

những phân đoạn,Loại muối trong các phân đoạn bằng phương pháp siêu lọc ,với

màng lọc có độ chặn 5 KD Đông cô chân không các phân đoạn

Phân tích hàm lượng nitrogen, protein, hàm lượng đường và phân tích bằng điện di rong các phân đoạn

tích ramnitol fueitoll arabinitoll xiltol | maniHOoi| galacttol

Phân Nghiên Cứu - Chương IV