Bài soạn sinh học phân tử

Sinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tửSinh học phân tử

Bài 2: CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA RNA

- Cũng như DNA, RNA là đại phân tử sinh học được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân,đơn phân là nucleotide Mỗi đơn phân (nucleotide) được cấu tạo từ 3 thành phần sau:+ Đường ribose: C5H10O5

+ 1 nhóm phosphate: PO4

3-+ 1 trong 4 loại bazơ nitơ (C, G, A, U)

RNA có cấu trúc gồm một chuỗi polyribonucleotit Số ribonucleotide trong RNA bằngmột nửa nucleotide trong phân tử DNA tổng hợp ra nó

-I Messenger RNA (mRNA):

1) Cấu trúc:

- mARN cấu tạo từ một chuỗi polynucleotide dưới dạng mạch thẳng, có chức năng truyềnđạt thông tin di truyền tử mạch gốc trên DNA đến chuỗi polipepetide Để thực hiện chứcnăng truyền đạt thông tin di truyền từ DNA đến protein thì RNA gồm:

+ Trình tự nucleotide đặc hiệu giúp cho ribosome nhận và liên kết vào ARN

+ Mã mở đầu : tín hiệu khởi đầu phiên mã

+ Các codon mã hóa axit amin:

+ Mã kết thúc , mang thông tin kết thúc quá trình dịch mã

2) Chức năng:

RNA được phiên mã từ các gene mã hoá protein, mang thông tin cho dịch mã

Một số bản sao tương tự mRNA không được dịch mã, ví dụ XIST, H19 do cơ chế in dấu

bộ gene bố mẹ (parental imprinting)

II Heterogenous nuclear RNA (hnRNA):

- mRNA trước khi cắt-nối Chúng là tiền thân của các mRNA trưởng thành sau này

- Đó là các bản sao chưa được sửa đổi của các gene eukaryote; sở dĩ gọi như vậ bởi vìtính đa dạng lớn về kích thước của nó so với tRNA và rRNA

III Transfer RNA (tRNA):

1) Cấu trúc:

- tRNA có cấu trúc với 3 thuỳ, trong đó có một thuỳ mang bộ ba đối mã có trình tự bổsung với 1 bộ ba mã hóa axit amin trên phân tử mRNA, tRNA có chức năng vận chuyểnamino acid tới ribosome để tổng hợp nên chuỗi polipetide

- Trong thành phần nucleotide của các tRNA có khá nhiều base chuẩn bị biến đổi thànhcác base sửa đổi nhờ hoạt động xúc tác của các enzyme sau phiên mã Các base này (còngọi là các base hiếm) tập trung chủ yếu ở các vòng thân (stem loops) như: 5',6'-dihydrouridine (DHU), inosine (I), ribothymidine (T), pseudouridine (Ψ) v.v

- Các phân tử tRNA thường rất giống nhau ở nhiều đoạn và khác nhau chủ yếu ở bộ bađối mã (anticodon) Cần lưu ý rằng, base hiếm Inosine (I) có mặt ở vị trí 5' của anticodontrong một số phân tử tRNA có thể kết cặp linh hoạt với một trong các base ở vị trí 3' (C,

U hoặc A) của các codon đồng nghĩa trong mRNA

Base hiếm Inosine ở vị trí 5' của anticodon trong một số tRNA có thể kết cặp với một trong các base (C, U hoặc A) ở vị trí 3' của các codon đồng nghĩa trong mRNA

Cấu trúc bậc ba (trái) và bậc hai của một phân tử tRNA.

- Chức năng chủ yếu của tRNA là vận tải amino acid đến Ri và cùng với mRNA đặtamino acid vào vị trí thích hợp trên chuỗi polypeptide Mỗi phân tử tRNA chỉ liên kếttạm thời với một amino acid nhất định nhờ AAS cũng đặc hiệu cho từng amino acid Một

loại amino acid có thể được liên kết và vận tải bởi vài loại tRNA khác nhauIV.

Ribosomal RNA (rRNA):

- Ở vi khuẩn có 3 loại rRNA có các hệ số lắng là 23S, 16S và 5S, với số lượng nucleotidetương ứng là 2904, 1542 và 120.

Ở tế bào eukaryote có 4 loại rRNA với các hệ số lắng là 28S, 18S, 5,8S và 5S

Riêng các tế bào thực vật còn có thêm các rRNA được mã hoá trong các chloroplastDNA (cpDNA)

- Bảng: Thành phần cấu tạo của các ribosome (R) ở pro- và eukaryote

- Mỗi ribosome hoàn chỉnh có hai tiếu đơn vị bé và lớn (small and large subunits) Haitiểu đơn vị này chỉ kết hợp với nhau tạo ra một ribosome hoạt động khi quá trình dịch mãtrên mRNA thực sự bắt đầu

Các hợp phần cấu thành các ribosome của pro- và eukaryote

2) Chức năng:

- Các rRNA cùng với các protein đặc thù là những thành phần cấu trúc nên các ribosome-"nhà máy" tổng hợp protein của tế bào

V Các RNA phụ khác:

1) iRNA (initiator RNA):

- Các trình tự RNA ngắn được dùng làm mồi cho sự tổng hợp DNA ở sợi ra chậm

2) snRNA(small nuclear RNA) hay U-RNA (uridine-rich RNA):

- Các phân tử RNA trọng lượng phân tử thấp phát hiện được trong dịch nhân, là thànhphần của các enzyme cắt bỏ các intron và các phản ứng xử lý (processing) khác; chúngchứa nhiều gốc uridine được sửa đổi

3) snoRNA (small nucleolar RNA):

- Các phân tử RNA trọng lượng phân tử thấp phát hiện được trong hạch nhân, có thểtham gia vào quá trình xử lý rRNA (RNA processing)

4) scRNA (small cytoplasmic RNA):

- Các phân tử RNA trọng lượng phân tử thấp phát hiện được trong tế bào chất với cácchức năng khác nhau

- Ví dụ đó là RNA 7S vốn là thành phần của tiểu phần nhận biết tín hiệu và pRNA(prosomal RNA), một RNA bé kết hợp với khoảng 20 protein và được bọc gói vớimRNA trong mRNP hay thể thông tin (informosome) vốn có tác dụng điều hoà sự biểuhiện của gene

5) RNA telomerase:

-Một RNA nhân có chứa khuôn cho các đoạn lặp telomere và là thành phần của enzymetelomerase

6) gRNA (guide RNA):

- Một loại RNA được tổng hợp trong các roi động (kinetoplasts) ở Trypanosoma; nó cungcấp khuôn cho biên tập RNA (editing RNA)

7) antisense RNA:

- RNA ngược nghĩa (antisense RNA) bổ sung với mRNA và có thể tạo thành một sợi đôivới nó để kìm hãm việc tổng hợp protein Loại RNA này thấy có trong nhiều hệ thống,nhưng rất phổ biến ở vi khuẩn; và cũng được gọi là RNA bổ sung gây nhiễu mRNA.8) Các Ribozyme:

- Các phân tử RNA mà có thể xúc tác cho các phản ứng hoá học, các enzyme chứa RNA(RNA enzymes)

Thông thường nó có hoạt tính tự xúc tác (ví dụ các intron tự cắt = self-splicing introns),nhưng một 0ribonuclease P là một chất xúc tác đích thực (ví dụ xử lý tRNA: tRNAprocessing) Các RNA khác hoạt động hài hoà với các protein, ví dụ MRP endonuclease

trong tái bản DNA ty thể.

VI RNA dạng xoắn sợi đôi:

-Ở RNA, cấu trúc xoắn hình thành do các liên kết hydro giữa các cặp base và các tươngtác kị nước diễn ra trên một sợi đơn nucleic acid

-RNA xoắn sợi đôi chủ yếu ở dạng xoắn phải A với 11 bp mỗi vòng

-RNA dạng xoắn A với các cặp base Watson – Crick có chu kì xoắn chính sâu, hẹp khôngthích hợp với các tương tác đặc hiệu

-Vòng xoắn phụ không mang trình tự đặc hiệu nhưng gồm các nhóm 2’-OH là các gốcnhận liên kết hydro; dễ tiếp xúc với các phối tử do xoắn cạn và rộng.

- Mang các cặp base khác ngoài các cặp base Watson và Crick, có hơn 20 loại

- Các cặp base không chuẩn phổ biến: GU, GA, cặp base Hoogsteen đảo ngược và cặp

- rRNA chỉ gấp đúng khi kết hợp với các protein ribosome

VIII So sánh cấu trúc RNA với DNA:

BÀI 3: CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN

I Mã di truyền, sự dịch mã, tính acid-base:

1 Mã di truyền:

- Trình tự DNA được đọc theo bộ ba base sử dụng sợi antisense (không mã hóa) làmmạch khuôn điều kiện tổng hợp RNA. 

- Sợi đối diện là sợi sense có trình tự giống RNA. 

- 1 khung đọc (ORF) ở mRNA đánh dấu bởi codon mở đầu. 

- Mã di truyền có tính thoái hóa phù hợp với “giả thuyết wobble” của Francis Crick. 

- Tính phổ biến của mã di truyền Ở một số sinh vật và bào quan, nghĩa là codon có thểthay đổi. 

2 Sự dịch mã:

3 Tính acid-base của protein:

Amino acid là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và ítnhất một nhóm amin (-NH2)

- Phản ứng với acid và bazơ tạo thành muối:

II Cấu trúc của protein:

(

1 Cấu trúc bậc 1:

Cấu trúc bậc I của protein là thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc amino acid trongmạch polypeptide

- Hầu hết cấu trúc của protein gồm khoảng từ 100 đến 500 gốc amino acid, có khoảng vàiphân tử protein có cấu trúc lớn hơn 500 gốc amino acid.

Protein ở trạng thái nguyên vẹn có rất ít nhóm NH 2 và COOH tự do

- Vd:

- Ý nghĩa của cấu trúc bậc 1 ở protein:

+ Số lượng aa trong chuỗi polypeptide quy định các tính chất của protein, vấn đề về nòigiống, phẩm chất, khả năng kháng bệnh của nó.

+ Trình tự sắp xếp của các aa là lý do tạo cho thế giới sinh vật có số lượng và các kiểuprotein khổng lồ mà chỉ xuất phát từ 20 loại  - aa 

+ Sự thay đổi về trình tự sắp xếp aa có thể dẫn đến những trường hợp bệnh lý VD điểnhình: bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Hb cấu tạo từ 2 chuỗi  và 2 chuỗi  Ở người bệnh,

aa thứ 6 trên chuỗi  là Glu được thay bằng Val

- Chuỗi polypeptide cuộn lại theo hình lò xo  bước xoắn

- Mạch liên kết peptide của chuỗi polypeptide được sắp xếp thẳng đứng xung quanh trụcphân tử, R của các aa đẩy ra vòng ngoài trục xoắn của chuỗi

- Một vòng xoắn có 3,6 gốc aa; khoảng cách giữa hai gốc aa cạch nhau là 1,5 A°; chiềucao một bước xoắn 5,4 A°

- Sự tồn tại bước xoắn là nhờ liên kết hydro; hình thành giữa –CO– của aa này với –NH–của aa đứng trước nó 4 gốc aa

- Đặc trưng cho những protein dạng cầu: protein của cơ, máu; trứng, sữa

b) Gấp nếp  :

- Gấp nếp  có cấu trúc hình dạng tấm, chuỗi polypeptide duỗi thẳng

- Khoảng cách giữa các aa cạnh nhau theo đường trục là 3,5A° (1,5A° trong xoắn α)

- Gấp nếp  được ổn định nhờ liên kết hydro giữa nhóm –NH– và –CO– trong các chuỗipolypeptide khác nhau (hoặc giữa những đoạn khác nhau trong một chuỗi)

- Thường gặp ở protein dạng sợi như protein trong tơ tằm, hoặc xương sống

- Trong cấu hình gấp nếp , các chuỗi polypeptie nằm song song hoặc đối song song

3 Cấu trúc bậc 3:

- Là cấu trúc không gian 3 chiều của chuỗi polypeptide đã gấp lại (nghĩa là sự tương táckhông gian giữa các amino acid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, là dạng cuộn lại trongkhông gian của toàn chuỗi polypeptide Nhiều chuỗi poplypeptide trong cơ thể sống tồntại không phải ở dạng thẳng mà gấp khúc và qua đó tạo nên cấu trúc không gian 3 chiều)

- Khi một chuỗi polypeptide tách ra khỏi ribosome sau khi tổng hợp và được thải ra trong

tế bào chất như là môi trường tạo hình thì nó hình thành nên cấu trúc tự nhiên rất nhanh,đăc biệt đối với cấu trúc hình cầu, mang lại cho protein nhưng đặc tính sinh lý quantrọng Có thể do chuyển động nhiệt của các chuỗi polypeptide mà các nhóm của các gốcamino acid tiếp xúc với nhau, dẫn đến có thể kết hợp với nhau

- Sự phân bố của các amino acid trong không gian được chi phối phần lớn bởi các liên kếtkhông cộng hóa trị

- Liên kết cộng hóa trị: Liên kết disulfide (S-S) giữa các cystein

- Liên kết khác: Các tương tác kị nước và liên kết hydro

- Các amino acid kị nước thường phân bố ở phần giữa chuỗi polypeptide hoặc ở giao diệngiữa các chuỗi polypeptide (Cấu trúc bậc 3 đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của các nhóm

R trong mạch polypeptit Các gốc R phân cực hay ion hóa có khuynh hướng quay rangoài (ưa H2O), các gốc R không phân cực có xu thế vùi vào trong (kỵ nước) Cấu trúcbậc 3 giữ được hằng định, bởi lực hút giữa các gốc phân cực hay ion hóa của nhóm chuỗibên (R))

 Tương tác kị nước đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của protein

- Ba dạng cấu trúc bậc 3 chủ yếu là protein dạng cầu (globular), dạng sợi (fibrous) vàprotein màng (membrane)

- Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc cysteine, sự tạo thành các liên kếtdisulfite giưa các gốc cysteine ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, làm cho chuỗi bị cuộnlại đáng kể Các liên kết khác, như liên kết Val der Waal, liên kết tĩnh điện, phân cực, kynước và hydrogen giữa các mạch bên của các gốc amino acid đều tham gia làm bền cấutrúc bậc 3

- Cấu trúc hình cầu của protein được gọi là cấu trúc bậc 3, là cấu trúc của enzyme

- Ví dụ về cấu trúc bậc 3:

Phân tử insulin là một polypeptid bao gồm 51 acid amin chuỗi A có 21 gốc acid amin và chuỗi B có 30 gốc acid amin Hai chuỗi nối với nhau bởi 2 cầu disulfide: cầu thứ nhất giữa gốc cystein ở vị trí 20 của chuỗi A và vị trí 19 của chuỗi B; cầu thứ hai giữa gốc cystein ở vị trí thứ 7 của cả 2 chuỗi Trong chuỗi A còn có một cầu disulfit giữa 2 gốc cystein ở vị trí thứ 6 và 11 Insulin là hormon tuyến tuy tham gia điều hoà hàm lượng đường trong máu Khi thiếu insulin, hàm lượng đường trong máu tăng cao, dẫn tới hiện tượng bệnh đái đường Insulin có tác dụng hạ đường huyết bằng cách xúc tiến quá trình tổng hợp glycogen dự trữ từ glucose.

Lực hấp dẫn VanderWaals: là lực hút giữa hai chất hoặc hai nhóm hoá học nằm cạnh nhau ở khoảng cách 1 - 2 lần đường kính phân tử.

Lực liên kết của các nhóm kỵ nước, những nhóm không phân cực (- CH2; -CH3) trong vang, leucin, isoleucin, phenylalanin Nước trong tế bào đẩy các gốc này lại với nhau, giữa chúng xảy ra các lực hút tương hỗ và tạo thành các đuôi kỵ nước trong phân tử protein Do có cấu trúc bậc ba mà các protein có được hình thù đặc trưng và phù hợp với chức năng của chúng Ở các protein chức năng như enzym và các kháng thể, protein của hệ thống đông máu thông qua cấu trúc bậc ba mà hình thành được các trung tâm hoạt động là nơi thực hiện các chức năng của protein.

Domain cấu trúc (Structural domain) được nghiên cứu từ 1976, đến nay người ta cho rằng sự hình thành domain rất phổ biến ở các chuỗi peptid tương đối dài Domain cấu trúc có thể được định nghĩa là những bộ phận, những khu vực trong một phân tử protein được cuộn gấp trong không gian giống như một phân tử protein nhỏ hoàn chỉnh và thường là những nơi thực hiện chức năng liên kết, chức năng lắp ráp của phân tử protein trong hoạt động chức năng của nó Trong nhiều protein domain gắn liền với chức năng kết hợp đặc hiệu và ở nhiều enzym được cấu tạo từ các domain thì trung tâm hoạt động lại được bố trí ở biên giới của hai hay nhiều domain Sự thành thành các domain trong phân tử protein tạo ra khả năng tương tác linh hoạt giữa các đại phân tử, khả năng cơ động, dịch chuyển tương ứng giữa những bộ phận trong quá trình thực hiện chức năng sinh học - ở những protein nguồn gốc khác nhau, nhưng có chức năng tương tự thì các domain có cấu trúc tương đối giống nhau.

Cấu trúc bậc hai và bậc ba tạo dạng ổn định nhất cho phân tử protein, các cấu trúc này được hình thành nhờ các loại tương tác không cộng hóa trị (liên kết ion, liên kết hydro

và các tương tác kỵ nước) giữa các chuỗi amino axit khác nhau trong phân tử và với (nước) các phân tử xung quanh nó Các vùng khác nhau của protein, thường có các chức năng riêng biệt, có thể hình thành những miền cấu trúc khác nhau Những miền liên quan về cấu trúc được tìm thấy ở các protein khác nhau thường có những chức năng tương đương.

4 Cấu trúc bậc 4:

- Một protein chức năng có thể gồm một hay nhiều chuỗi polypeptide, tạo nên cấu trúcbậc 4 (Là tương tác không gian giữa các chuỗi của các phân tử protein gồm hai hay nhiều

chuỗi polypeptide hình cầu Mỗi chuỗi polypeptide này đươc gọi là môt “tiểu đơn vị” Sựkết hơp giữa các phân tử này chủ yếu là do liên kết hydrogen và kỵ nước mà không cócầu disulfit hoặc bất kỳ liên kết hóa trị nào giữa các tiểu đơn vị Bằng cách này hai phân

tử xác định có thể kết hợp với nhau tạo thành một dimer Hemoglobin là một điển hìnhcủa protein có cấu trúc bậc 4, được tạo nên từ hai chuỗi α với mỗi chuỗi có 141 gốcamino acid và hai chuỗi β với mỗi chuỗi là 146 gốc amino acid)

- Các tương tác tạo nên cấu trúc gồm:

+ liên kết peptide,

+ tương tác kị nước,

+ tương tác điện tích và liên kết hydro; diễn ra giữa các chuỗi polypeptide

- Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc 4 củaprotein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro

- Khái niệm tiểu đơn vị (subunit) chỉ từng chuỗi polypeptide trong phức hợp

- Domain = vùng chức năng

- Protein rất đa dạng về kích thước và dạng phức hợp, thể hiện qua trọng lượng phân tử

và số lượng tiểu đơn vị

- 1 đơn vị khối lượng phân tử - 1 Da (Dalton)

- Các polypeptide điển hình có khối lượng khoảng 20 – 70 kDa

- Khối lượng phân tử trung bình của 1 aa là 110

- Protein có khối lượng phân tử hơn 20 kDa thường gồm hai hay nhiều vùng chức năng(domain)

- Mỗi vùng chức năng được hình thành bởi một trình tự aa liên tục

- Cấu trúc của một hoặc nhiều chuỗi polypeptide có ý nghĩa quan trọng đối với độ hòa tan

và chức năng của chúng Cấu trúc protein được hiểu là sự săp xếp của những chuỗi riêng

lẻ hoặc nhiều chuỗi Chúng phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi trường Protein và chuỗi

polypeptide hoà tan tốt khi nhưng nhóm ưa nước hướng ra phia ngoài, nhóm ky nướchướng vào bên trong Khi một protein thay đổi cấu trúc thì những nhóm ky nước quay ra

ngoài, protein mất khả năng hòa tan trong nước, Ví dụ trường hợp kết tủa không ở dạng

tinh thể của protein sữa trong môi trường chua Lactic acid đươc sản sinh do vi khuẩn làm giảm pH sữa, làm thay đổi protein sữa Nhiều nhóm kỵ nước được hướng ra bên

ngoài, protein mất khả năng tan trong nước Vì vậy, việc thường xuyên duy trì giá trị pHtrong tế bào chất rất quan trọng, vì chỉ có như vậy chức năng hoạt động của các enzymetrong tế bào chất mới được đảm bảo

- Các yếu tố của môi trường như nhiệt độ cao, độ pH có thể phá huỷ cấu trúc khônggian ba chiều của protein làm cho chúng mất chức năng (biến tính) Protein vừa rất đadạng vừa rất đặc thù, do cấu trúc theo nguyên tắc đa phân nên chỉ với hai mươi loại axitamin khác nhau, đã tạo ra nhiều loại protein khác nhau về số lượng, thành phần, trật tựsắp xếp các axit amin cũng như về cấu trúc không gian

- Ví dụ về cấu trúc bậc 4:

+ Hemoglobin (Huyết sắc tố) gồm 4 tiểu phần protein: hai tiểu phần α và hai tiểu phần

β Nếu 4 tiểu phần tách rời nhau thì mỗi tiểu phần không thể vận chuyển được một phân

tử O2 Khi kết hợp lại thành trạng thái tetramer tạo thành một khối không gian đặc thùgần như hình tứ diện thì mới có khả năng kết hợp và vận chuyển khí oxy Một phân tửhemoglobin vận chuyển được 4 phân tử oxy

+ Enzym glycogen phosphorylase (ở cơ, gan) xúc tác quá trình phân giải glycogenthành glucose

• Ở trạng thái không hoạt động enzyme này ở dạng "β" (dạng hai dimer tách rờinhau)

• Ở trạng thái hoạt động (khi có tín hiệu cần đường) hai dimer tổ hợp lại thànhtetramer (dạng "α") Khi nhu cầu giải phóng glucose giảm, tetramer lại tách thànhhai dimer, enzym trở lại dạng không hoạt động

- Tuỳ theo protein mà số lượng monomer có thể thay đổi từ 2,4,6,8 là phổ biến, cá biệt cóthể lên tới trên 50 monomer

- Sự hình thành cấu trúc bậc bốn tạo điều kiện cho quá trình điều tiết sinh học thêm tinh

vi, chính xác

- Giúp cho cơ thể sinh vật khả năng điều tiết rất linh hoạt Những quá trình hoạt hoá hay

ức chế (khoá enzyme, khoá hormone…) đều thực hiện thông qua việc tác động lên cấutrúc bậc 4

5 Tổng quan về cấu trúc của protein:

Cấu trúc bậc 1 + Là một chuỗi polypeptide

Cấu trúc bậc 2 + Xoắn α: Chuỗi polypeptide cuộn lại theo hình lò xo

+ Gấp nếp  có cấu trúc hình dạng tấm, chuỗi polypeptide duỗi thẳngCấu trúc bậc 3 + Xoắn  lại tự xoắn cuộn gập trong không gian tạo thành dạng hình

cầu hay slípoit-cấu trúc bậc 3

+Hình thành do các liên kết thứ cấp giữa các gốc trong mạch

polypeptide, liên kết S-S, liên kết vaderwalls, liên kết ester,liên kếttĩnh điện,

Cấu trúc bậc 4 +Cấu trúc tổ hợp của 2 hay nhiều tiểu đơn vị (polypeptide) cấu trúc

bậc 3 tạo thành

+Hình thành và ổn định nhờ các lực tương tác các nhóm bên phân bốtrên bề mặt các tiểu đơn vị, liên kết hydro, liên kết kị nước hoặc cácloại liên kết mạnh hơn như liên kết ester, liên kết disulfide,

III Phân loại protein:

1 Phân loại dựa vào hình dạng của protein

2 Phân loại dựa trên thành phân cấu tạo:

- Protein đơn giản chỉ gồm các amino acid:

+ Albumin và globulin, protamin và histon , glutelin và prolamin, glutelin và prolamin,các chất proteinoid (colagen, fibroin, keratin, ….)

- Protein phức tạp gồm amino acid và các nhóm ghép:

IV Chức năng của protein – Điều hòa hoạt tính sau dịch mã:

 Cấu trúc không gian ba chiều của protein quyết định chức năng của protein

1) Tăng trưởng và duy trì các mô

7) Vận chuyển và lưu trữ chất dinh dưỡng:

8) Cung cấp năng lượng:

9) Chất súc tác sinh học:

- Hầu hết các enzyme trong tế bào có dạng hình cầu

- Enzyme giúp giảm năng lượng hoạt hoá phản ứng

- Cơ chất hình thành phức hợp chặt chẽ với enzyme ở vị trí hoạt động; tiếp theo cơ chấtthay đổi hình dạng để bắt đầu sự xúc tác

- Vị trí hoạt động thường mang các aa với nhóm bên tham gia vào việc gắn cơ chất vàxúc tác phản ứng

- Phức hợp enzyme-cơ chất thay đổi hình dạng để tạo điều kiện cho phản ứng xúc tác

- Phức hợp hoạt động của enzyme-cơ chất trải qua một chuỗi các biến đổi hóa học, biến

cơ chất thành sản phẩm; sản phẩm tách khỏi enzyme

10) Điều hòa hoạt tính sau dịch mã:

- Các phức hợp protein hình thành sau dịch mã:

+ Protein – lipid lipoprotein

+ Protein – gốc carbonhydrate glycoprotein

+ Protein – ion kim loại metalloprotein

- Sự biến đổi của aa gồm: sự methyl hóa, acetyl hóa, ubiquitin hóa, phosphoryl hóa(enzyme kinase),

- Các biến đổi sau dịch mã có thể bao gồm chức năng cấu trúc và điều hòa

- Sự phosphoryl hóa có thể làm protein thay đổi hình dạng, hình thành/phân ly các phứchợp

• Điều hoà dị lập thể (allosteric regulation): Sự gắn vào protein của một ligand (thường làmột phân tử có kích thước nhỏ - đường/aa) dẫn đến sự thay đổi cấu hình của protein đó

• Sự hoạt hoá kinase phụ thuộc cyclin (CDKs): là một ví dụ điển hình về điều hoà saudịch mã Hoạt động CDK được điều khiển bởi quá trình phosporyl hoá và điều hoà dị lậpthể thông qua tương tác giữa enzyme và một protein điều hoà gọi là cyclin

V Sự gấp protein:

Gấp protein là quá trình vật lý mà theo đó một chuỗi protein được chuyển thành cấu trúc

ba chiều tự nhiên của nó điển hình là cấu trúc "gấp lại" , qua đó protein có chức năng sinhhọc (prp)

Thông qua một quy trình nhanh chóng và có thể tái sản xuất, một polypeptide gấp lạithành cấu trúc ba chiều đặc trưng của nó từ một cuộn ngẫu nhiên Mỗi protein tồn tại đầutiên dưới dạng một polypeptide mở ra hoặc cuộn ngẫu nhiên sau khi được dịch mã từ mộtchuỗi mRNA thành một chuỗi axit amin tuyến tính Ở giai đoạn này, polypeptide thiếubất kỳ cấu trúc ba chiều ổn định (tức là lâu dài) nào (xem phía bên trái của hình đầu tiên).Khi chuỗi polypeptide đang được tổng hợp bởi một ribosome , chuỗi tuyến tính bắt đầucuộn lại thành cấu trúc ba chiều của nó

Cấu trúc ba chiều chính xác là điều cần thiết để hoạt động, mặc dù một số phần củaprotein chức năng có thể vẫn chưa được mở ra , chỉ ra rằng động lực học của protein làquan trọng

Việc không thể gấp lại thành cấu trúc tự nhiên thường tạo ra các protein không hoạt động,nhưng trong một số trường hợp, các protein không được gấp lại có chức năng biến đổihoặc độc hại Một số bệnh thoái hóa thần kinh và các bệnh khác được cho là kết quả của

sự tích tụ các sợi amyloid được hình thành bởi các protein bị gấp sai, các dạng lây nhiễmcủa chúng được gọi là prion Nhiều chứng dị ứngđược gây ra bởi sự gập sai của một sốprotein vì hệ thống miễn dịch không tạo ra các kháng thể cho một số cấu trúc protein nhấtđịnh

Một protein được coi là bị gấp sai (misfolding protein/ prpsc /prion) nếu nó không thể đạtđược trạng thái tự nhiên bình thường

Điều này có thể là do đột biến trong trình tự axit amin hoặc sự gián đoạn quá trình gấpbình thường bởi những thay đổi trong điều kiệnmôi trường và nhiều yếu tố khác, baogồm lỗi sửa đổi sau dịch mã, tăng tốc độ thoái hóa, lỗi buôn bán, mất đối tác ràng buộc vàtổn thương oxy hóa

Protein bị gấp sai thường chứa các tấm β được tổ chức theo cách sắp xếp siêu phân tửđược gọi là cấu trúc chéo β Các tập hợp giàu tấm β này rất ổn định, rất không hòa tan vàthường chống lại sự phân giải protein

Sự ổn định cấu trúc của các tổ hợp sợi nhỏ này là do sự tương tác rộng rãi giữa các đơnphân protein, được hình thành bởi các liên kết hydro xương sống giữa các sợi β củachúng

Các proteasome sẽ tiêu hủy các protein không cần thiết hoặc bị hư hỏng bởi sự phân giảiprotein

Các amyloid là các cấu trúc dạng sợi có chứa các liên kết hydro liên phân tử rất khó hòatan và được tạo ra từ các tập hợp protein đã chuyển đổi

Do đó, con đường proteasome có thể không đủ hiệu quả để phân hủy các protein bị gấpsai trước khi tổng hợp

Các amyloid gây bệnh hình thành khi các protein khỏe mạnh trước đó mất đi cấu trúc vàchức năng sinh lý bình thường (gập sai) và hình thành các sợi lắng đọng bên trong vàxung quanh tế bào Các quá trình kết hợp và lắng đọng protein này phá vỡ chức nănglành mạnh của các mô và cơ quan.Amyloid là thủ phạm chính đằng sau độc tính gây racác bệnh thoái hóa thần kinh

Việc gấp sai làm phát sinh sự hình thành các chất trung gian không được gấp hoặc mở ramột phần, có dư lượng kỵ nước và tương tác với các chất trung gian bổ sung để tạo thànholigomers và do đó protofibrils và fibrils

Các nghiên cứu ban đầu đã chỉ ra rằng các sợi amyloid là thủ phạm chính đằng sau độctính gây ra các bệnh thoái hóa thần kinh Tuy nhiên, sự chú ý chuyển sang độc tính tếbào của tiền chất sợi amyloid, đáng chú ý là oligomer amyloid, là nguyên nhân chính gâyđộc Cơ chế gây độc được kích hoạt bởi các oligomer amyloid vẫn còn khó nắm bắt

Mức độ gia tăng của các protein tổng hợp trong tế bào dẫn đến sự hình thành các cấu trúcgiống như amyloid có thể gây ra rối loạn thoái hóa và chết tế bào.

Các protein bị gấp sai có thể tương tác với nhau và tạo thành các tập hợp có cấu trúc vàthu được độc tính thông qua các tương tác giữa các phân tử

Các protein tổng hợp có liên quan đến các bệnh liên quan đến prion như bệnhCreutzfeldt–Jakob, bệnh não xốp ở bò (bệnh bò điên), các bệnh liên quan đến amyloidnhư bệnh Alzheimer và bệnh cơ tim hoặc bệnh đa dây thần kinh amyloid gia đình , cũngnhư các bệnh tập hợp nội bào như như bệnh Huntington và Parkinson

Bệnh alzheimer

Creutzfeldt–Jakob

Bệnh Creutzfeldt–Jakob do các prion làm não giốngnhư 1 miếng bọt biển , nghĩa là nó sẽ có nhiều lỗ.Những lỗ này là kết quả của việc nhiều loại tế bàothần kinh đã chết bởi những khối protein gấp sai gây

ra Và kết quả là làm thoái hóa khả năng tâm thần vàchức năng não bộ của cá thể đó

Thông thường thì các proteasome sẽ làm công việccủa mình và đôi lúc sẽ có các prion, những tác nhânlây nhiễm cực kì nguy hiểm

Bệnh Protein gấp sai Đặc điểm và vị trí tổn thương

Alzheimer Almyloid β-protein Mảng ngoại bào và đám rốitrong tế bào chất tế bào thần

kinh

Hungtinton Gia tăng polyglutaminetrong vùng gene

hungtingtin

Nhân và tế bào chất tế bàothần kinh

Tiểu đường tuýp 2 Tiểu đảo polypeptideamuloid (amylin) Ngưng kết ở tuyến tụy

Creuktzfeldt-Jacob Protein prion (PrpSc) Mảng ngoại bào và cácđoạn oligo ở trong và ngoài

+ Tổng hợp chuỗi polymer từ các dNTP

+ Gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn

+ Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide ngay từ đầu (de novo)

+ Xúc tác gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn

- Hầu hết các polymerase dùng trong SHPT có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc từ các virus kísinh chúng

1) DNA polymerase ở prokaryote:

- Ở Prokaryote (sinh vật không có nhân thực sự, được phân định bởi màng) có ba loạiDNA Polymerase: Pol I, Pol II, Pol III

Cả 3 loại đều có hoạt tính xúc tác kéo dài 5’3’ với tốc độ khác nhau và hoạt tính 3’5’exonuclease

+ Pol I: còn có hoạt tính 5’3’ exonuclease Được coi là vai trò của enzyme này saochép là chủ yếu

+ Pol II: tham gia sửa chữa DNA và hoạt động exonuclease của nó theo hướng 3’5’.+ Pol III: là phức hợp enzyme chính điều khiển quá trình tái bản

- DNA Pol I ở E coli gồm 2 phần:

+ Phân đoạn lớn là đoạn Klenow có hoạt tính 5’3’ polymerase và 3’5’ exonuclease;+ Phân đoạn nhỏ có hoạt tính 5’3’ exonuclease

- T4 DNA polymerase ở thực khuẩn thể cần khuôn và primer để hoạt động:

+ 5’3’ polymerase khi có dNTPs

+ 3’5’ exonuclease khi không có dNTPs

+ Không có hoạt tính 5’3’ exonuclease

Có thể sử dụng T4 DNA polymerase trong kỹ thuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’của

DNA sợi đôi.

- DNA polymerase T7 của thực khuẩn thể là công cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA.Dạng chỉnh sửa của enzyme này có tốc độ polymer hóa trên 300 nucleotide/giây

- Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vàođầu 3’-OH của DNA và không cần khuôn mẫu

TdT được sử dụng trong dán nhãn DNA với các nucleotide đã biến đổi (ddNTP, dUTP), kéo dài primer hoặc giải trình tự DNA

DIG-TdT cần DNA primer sợi đơn khi có Mg2+, nhưng có thể chấp nhận DNA sợi đôi nhưprimer khi có CO2+

2) Polymerase bền nhiệt:

a, Bst polymerase là DNA Pol I bền nhiệt được phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillusstearothermophilus (Bst)

- Bst Pol I hoạt động tốt nhất ở 65oC, bị bất hoạt ở 75oC trên 15 phút

- Hoạt tính 5’3’ exonuclease đạt mức cao nhất khi có nồng độ Mg2+ cao

- Bst Pol I gồm 2 phân đoạn protein Phân đoạn lớn bền nhiệt và rất hữu dụng trong cácphản ứng giải trình tự ở 65oC

b, Taq polymerase: được tinh sạch lần đầu tiên vào năm 1976 từ vi khuẩn Thermophilusaquaticus (vi khuẩn sống ở nhiệt độ 70oC - 80oC)

Có hoạt tính tối đa đạt được ở 80 độ và cần Mg2+

Thiếu hoạt tính 3’5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai, proofreading), là enzyme có độchính xác thấp

c, Tth polymerase: được phân lập từ Thermus thermophilus, có khối lượng 94 kDa, thiếuhoạt tính 3’5’ exonuclease

Xúc tác sao chép DNA:

+ Từ khuôn DNA với Mg2+

+ Từ khuôn RNA (phiên mã ngược) với Mn2+

3) DNA polymerase ở eukaryote:

- Eukaryote (sinh vật có nhân thực sự, được phân định bởi màng) có năm polymeraseDNA Được ký hiệu bằng các chữ cái trong bảng chữ cái Hy Lạp: α, β, γ, δ, ε

- Chức năng:

Polymerase γ nằm trong ty thể và chịu trách nhiệm sao chép vật chất di truyền trong bàoquan của tế bào này Ngược lại, bốn chất còn lại được tìm thấy trong nhân tế bào và thamgia vào quá trình sao chép DNA nhân

II RNA polymerase:

- RNA polymerase phụ thuộc DNA xúc tác phản ứng tổng hợp RNA từ khuôn DNA theochiều 5’->3’

- 2 RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất trong SHPT là SP6 và T7 RNApolymerase

+ SP6 RNA polymerase là một chuỗi polypeptide 96 kDa tinh sạch từ Salmonellatyphimurium LT2 bị xâm nhiễm bởi thực khuẩn thể SP6.

+ T7 RNA pol là một chuỗi polypeptide 98 kDa sản xuất bởi thực khuẩn thể T7

- RNA polymerase được sử dụng trong tổng hợpantisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn

- SP6 và T7 RNA polymerase đều cần Mg2+ và mộtkhuôn DNA sợi đôi

- SP6 và T7 RNA polymerase rất đặc hiệu về promoter

và sẽ phiên mã trình tự DNA được tạo dòng dưới sựkiểm soát của promoter tương ứng (SP6 và T7)

- Quá trình phiên mã của SP6 hay T7 RNA polymerase diễn ra đến hết phần đuôi poly(A)

vì thế ở khuôn mẫu dạng tròn, quá trình này có thể lặp lại nhiều lần trước khi RNApolymerase tách ra

- Làm thẳng mạch khuôn trước khi dịch mã đảm bảo sự kết thúc hiệu quả quá trình phiênmã

III Ligase:

- Khái niệm: Enzyme Ligaza (tiếng Anh: Ligase, hay còn gọi là DNA ligase) là một chất

xúc tác hai loại phân tử lớn trong một enzyme mới liên kết hóa học với nhau, thường liênquan đến nhóm thủy phân của một phân tử

- DNA ligase là một enzyme quan trọng trong cơ thể sinh vật, và phản ứng do nó xúc tácđóng một vai trò quan trọng trong quá trình sao chép và sửa chữa DNA

- DNA ligase được chia thành hai loại: Một là sự hình thành phụ thuộc của liên kếtphosphodiester giữa hai sợi nucleotide sử dụng năng lượng của ATP xúc tác ATP làDNA ligase, và loại khác là sử dụng nicotinamide adenine dinucleotide Năng lượng củaacid (NAD+) xúc tác sự hình thành của một liên kết phosphodiester giữa hai chuỗinucleotide, là một DNA ligase phụ thuộc NAD

- DNA Ligase, còn được gọi là enzyme liên kết DNA, đóng một vai trò đặc biệt và quantrọng trong sinh học phân tử, đó là kết nối đầu 3'-OH của một bazơ trong chuỗi DNA vớiđầu 5'- của bazơ liền kề của nó tại P -terminus, cả hai tạo ra một liên kết phosphodiester,

do đó kết nối hai bazơ liền kề Sự xúc tác của ligase đòi hỏi sự tiêu thụ ATP

- Giới thiệu:

DNA ligase, còn được gọi là enzyme liên kết DNA, đóng một vai trò đặc biệt và quantrọng trong sinh học phân tử, đó là liên kết hai đoạn DNA thành một Bất kể DNA sợikép hay sợi đơn được liên kết, các enzyme liên kết DNA có thể kết nối đầu 3' của DNAvới đầu 5 ' của DNA bằng cách hình thành một liên kết phosphate Mặc dù có các proteinkhác trong tế bào, ví dụ, DNA polymerase sử dụng một sợi DNA làm khuôn mẫu để bẻgãy một sợi DNA ở phía bên kia để tạo thành liên kết phosphodiester thông qua quá trìnhtrùng hợp để liên kết DNA (DNA ligase nối các đoạn DNA lại với nhau để khôi phục liên

kết phosphodiester giữa hai nucleotide bị cắt bởi enzyme giới hạn) Tuy nhiên, quá trìnhkết dính của DNA polymerase chỉ là một chức năng ngẫu nhiên của phản ứng trùng hợp,công việc thực sự của phản ứng kết dính DNA trong tế bào vẫn do enzyme kết dính DNAchi phối.

- Chức năng:

Enzyme liên kết ADN là liên kết các ADN bị đứt gãy, và chỉ có phản ứng tái bản ADN

và sửa chữa ADN trong tế bào mới liên quan đến việc tổng hợp các đoạn ADN đứt gãy,

do đó, enzyme liên kết ADN đóng vai trò quan trọng trong hai cơ chế trên Ngoài phảnứng kết dính trong tế bào, với sự phát triển của sinh học phân tử, hầu hết các phòng thínghiệm sinh học phân tử sẽ sử dụng enzyme liên kết DNA để thực hiện thí nghiệm DNAtái tổ hợp, có lẽ đây cũng có thể được xếp vào một chức năng quan trọng khác

- Lịch sử tìm thấy:

DNA ligase lần đầu tiên được phát hiện bởi ba phòng thí nghiệm vào năm 1967 Saunhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng DNA ligase đã được tìmthấy trong virus, vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn, cơ chế hoạt động của các loại DNAligase khác nhau Trong những trường hợp bình thường, ligase DNA có thể được chiathành adenosine triphosphate (ATP) loại phụ thuộc và nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) loại phụ thuộc theo nguồn năng lượng cần thiết cho phản ứng xúc tác bởi DNAligase Ligase DNA phụ thuộc có mặt rộng rãi ở eukaryote, vi khuẩn cổ, vi khuẩn và virút, trong khi nicotinamide adenine dinucleotide DNA ligase phụ thuộc được phân bốtrong vi khuẩn cổ, vi khuẩn và virus

- Sử dụng:

DNA ligase chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền để lắp ráp lại các đầu dính bị

"cắt ra" bởi các endonucleases giới hạn, vì vậy nó còn được gọi là "khâu di truyền"

+ E coli DNA ligase được đề cập trong PEP Sinh học Trung học Tự chọn 3 có nguồngốc từ Escherichia coli và có thể được sử dụng để kết nối các đầu dính ; ligase T4DNA,

có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T4, có thể được sử dụng để kết nối các đầu dính vàphẳng, nhưng hiệu quả thắt thấp

- Phân loại: Ligase được phân loại là EC6 trong số EC, và được chia nhỏ thành 6 loại

phụ:

(1) bao gồm một ligase tạo liên kết CO

(2) bao gồm một ligase tạo thành liên kết CS

(3) bao gồm một ligase tạo thành liên kết CN

(4) bao gồm một ligase tạo thành liên kết CC

(5) bao gồm một ligase tạo liên kết phosphoester

(6) bao gồm một ligase tạo thành liên kết kim loại N

IV Phosphatase:

Alkaline phosphatase (AP) là có nhiều trong gan, thận, mật, nhau thai, xương AP đượctinh sạch từ E coli hoặc các sinh vật bậc cao, được sử dụng để loại bỏ nhóm 5’-

phosphate khỏi nucleic acid để ngăn chặn sự đóng vòng của DNA vector trong các thínghiệm tạo dòng AP bị bất hoạt bởi các tác nhân tạo phức (chelating agents) như EGTA,nồng độ thấp của phosphate vô cơ

T4 polynucleoide kinase xúc tác phản ứng chuyển một nhóm phosphate từ phân tử ATPđến đầu 5’-OH của một nucleic acid, sự trao đổi nhóm 5’-phosphate, hay phosphoryl hoáđầu 3’ của các mononucleotide

V Kinase

T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E Coli

Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E coli)

Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate củaATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứngthuận và phản ứng trao đổi Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tớiđầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate) Trong phản ứngtrao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA đã đượcphosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận mộtnhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32P] ATP

- Ứng dụng chính:

+ Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam vàGilbert (1977), dùng làm mẫu dò trong các kỹ thuật lai phân tử

+ Phosphoryl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn DNA không có nhóm 5’ phosphate

để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng

Phage Viết tắt của bacteriophage (thực khuẩn thể), là loại virus xâm nhiễm và sinh sản bên trong vi khuẩn Phage thường có vỏ bọc protein, phức hợp bao gồm phần đầu có hình đa diện chứa nucleic acid và đuôi mà qua đó nucleic acid xâm nhập vào vi khuẩn chủ Sau quá trình nhân lên của nucleic acid của phage, tế bào vi khuẩn chủ thường bị

tan biến Loại phage luôn luôn làm tan tế bào vi khuẩn khi chúng xâm nhiễm vi khuẩn gọi là phage độc Ví dụ: phage T4 Ngược lại, còn có phage ôn hòa, khi xâm nhiễm vi khuẩn nó gây nên phản ứng tiềm tan, nghĩa là hệ gen của phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn và được sao chép cùng với nhiễm sắc thể đó Hệ gen của phage ở trạng thái gắn như vậy với nhiễm sắc thể vi khuẩn gọi là prophage.

VI Nuclease:

1 Định nghĩa

Nuclease là thuật ngữ được sử dụng cho một loại enzyme tách nucleic acid

Chúng còn được gọi là nucleodepolymerase hoặc polynucleotide Nuclease thuộc về lớpenzyme hydrolase và thực hiện một vai trò cụ thể Các ribonuclease hoạt động trênribonucleic acid (RNA) và deoxyribonuclease hoạt động trên axit deoxyribonucleic(DNA)

Một số enzyme có vai trò chung như phosphodiesterase, thủy phân este của axitphosphoric, cũng có thể được gọi là nuclease vì nucleic acid bị ảnh hưởng bởi hoạt độngcủa chúng Hạt nhân có trong thực vật cũng như động vật

2 Chức năng của hạt nhân

Nuclease có vai trò cắt các liên kết phosphodiester giữa các nucleotide của axit nucleic vàgây ra sự đứt gãy sợi đơn và sợi đôi trong các phân tử mục tiêu của chúng Chúng rất cầnthiết trong các sinh vật sống vì một số khía cạnh sửa chữa DNA của chúng Nếu cónhững khiếm khuyết trong một số nuclease nhất định, nó có thể gây suy giảm miễn dịchhoặc mất ổn định di truyền Các hạt nhân cũng đóng một vai trò quan trọng trong nhânbản phân tử

3 Các loại hạt nhân

Nuclease có thể được phân thành hai loại lớn dựa trên địa điểm hoạt động: Exonuclease

và Endonuclease

Exonuclease tiêu hóa axit nucleic từ các đầu

Endonuclease hoạt động trên các vùng ở trung tâm của các phân tử mục tiêu

Các loại này có thể được phân loại thành các deoxyribonuclease và ribonuclease Cácdeoxyribonuclease (DNA nuclease) hoạt động trên DNA, trong khi các ribonuclease hoạtđộng trên RNA

3.1 Exonuclease:

Eukaryote ( sinh vật nhân thực)

Exoribonuclease là một ribonuclease exonuclease, là các enzyme thủy phân RNA bằngcách loại bỏ các nucleotide đầu cuối từ đầu 5 ‘hoặc đầu 3’ của phân tử RNA

5’-3’ Exoribonuclease (XRN-1) thủy phân RNA theo chiều 5’-3’

XRN-2 phân giải RNA dư thừa theo chiều 5’-3’

Sau khi RNA bị cắt

Prokaryote ( sinh vật nhân sơ)

Exonuclease I tách DNA sợi đơn theo chiều 3’-5’ và giải phóngdeoxyribonucleoside monophosphate

Exo-III hoạt động trên DNA sợi đôi và cắt theo chiều 3’-5’

Exo-V hoặc là Rec BCD

3.3 Mung Bean Nuclease

Mung bean nuclease là một endonuclease sợi đơn (ssDNA hoặc RNA) giúp loại bỏ phần

mở rộng sợi đơn trong DNA sợi đôi Nó có thể được sử dụng để loại bỏ cả phần nhô racủa sợi đơn 3’ và 5’ khỏi DNA sợi kép để tạo ra các đầu cùn Nó tách RNA và DNA sợiđơn, tách vùng sợi đơn trong kẹp tóc DNA và giúp lập bản đồ các bản phiên mã RNA

3.4 Deoxyribonuclease ( viết tắt là DNase )

Dùng để chỉ một nhóm glycoprotein endonuclease là các enzym xúc tác quá trình phâncắt thủy phân của các liên kết phosphodiester trong xương sống DNA , do đó làm thoái

hóa DNA Vai trò của enzyme DNase trong các tế bào bao gồm phá vỡ DNA ngoại bào(ecDNA) được bài tiết bởi quá trình chết theo chương trình , hoại tử và bẫy ngoại bàobạch cầu trung tính (NET) của các tế bào để giúp giảm các phản ứng viêm mà nếu không

sẽ gây ra Nhiều loại deoxyribonuclease đã được biết đến và thuộc một trong haihọ( DNase Ihoặc DNase II), khác nhau về đặc tính cơ chất , cơ chế hóa học và chức năngsinh học của chúng Các ứng dụng trong phòng thí nghiệm của DNase bao gồm cácprotein tinh khiết khi được chiết xuất từ các sinh vật nhân sơ

Dnase I (Deoxyribonuclease I)

Là một glycoprotein 31 kDa

thường ở dạng hỗn hợp gồm 4 isoenzyme (A, B, C, D)

Bị bất hoạt ở 75oC trong 5’ với EGTA 5 mM Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt ở vị trí 3’của pyrimidine

Là một endonuclease thuộc họ DNase được mã hóa bởi gen người DNASE1 DNase I làmột nuclease tách DNA tốt hơn ở các liên kết phosphodiester liền kề với một nucleotidepyrimidine, tạo ra các polynucleotide kết thúc 5'-phosphate với một nhóm hydroxyl tự do

ở vị trí 3', trung bình tạo ra các tetranucleotide Nó hoạt động trên DNA sợi đơn, DNAsợi kép và chất nhiễm sắc Ngoài vai trò là một endonuclease quản lý chất thải , nó cònđược đề xuất là một trong những deoxyribonucleasechịu trách nhiệm cho sự phân mảnhDNA trong quá trình chết rụng tế bào DNase I liên kết với actin protein tế bào Nó liênkết các monome actin có ái lực rất cao (dưới nanomol) và các polyme actin có ái lực thấphơn Chức năng của sự tương tác này là không rõ ràng Tuy nhiên, do DNase I gắn vớiactin không hoạt động về mặt enzyme, nên phức hợp DNase-actin có thể là một dạng lưutrữ của DNase I để ngăn chặn sự phá hủy thông tin di truyền Protein này được lưu trữtrong các hạt zymogen của vỏ hạt nhân và hoạt động bằng cách tách DNA theo cách phângiải nội nhân

Dnase II (Deoxyribonuclease II)

Là một endonuclease thủy phân các liên kết phosphodiester của deoxyribonucleotidetrong DNA tự nhiên và DNA biến tính, tạo ra các sản phẩm có 3 '-photphat và đầu 5'-hydroxyl, xảy ra do cơ chế phân cắt sợi đơn Đúng như tên gọi, nó hoạt động tối ưu ở pHaxit vì nó thường được tìm thấy trong môi trường pH thấp của lysosome

Hoạt động của DNase diễn ra theo ba giai đoạn Giai đoạn ban đầu giới thiệu nhiều mũinhọn trong xương sống phosphodiester Giai đoạn thứ hai tạo ra các nucleotide hòa tantrong axit Giai đoạn thứ ba, là giai đoạn cuối, bao gồm sự dịch chuyển siêu sắc do giảmoligonucleotide

Có một số DNase II đã biết, bao gồm:

DNase II alpha (thường được gọi là DNase II), được cho là biểu hiện phổ biến trong môngười Người ta đã chứng minh rằng một đột biến trong enzyme này của chuột dẫn đến

sự suy thoái DNA do quá trình chết theo chương trình

DNase II beta (còn được gọi là DLAD, hoặc DNase II-Like Acid DNase), chủ yếu biểuhiện ở thủy tinh thể mắt và tuyến nước bọt Một trong những chức năng của nó là xóa

DNA khỏi thủy tinh thể của mắt Mức độ thấp cũng đã được phát hiện trong phổi, tuyếntiền liệt và các hạch bạch huyết Sự thiếu hụt enzym này ở chuột dẫn đến sự phát triểncủa bệnh đục thủy tinh thể.

Nhận biết vùng

Trước khi có thể tách phân tử, một nuclease phải liên kết với một axit nucleic Nó đòi hỏimột mức độ nhận dạng nhất định và các hạt nhân sử dụng cả các liên kết cụ thể và khôngđặc hiệu trong các phương tiện liên kết và nhận biết của chúng Cả hai chế độ hoặcphương tiện đều đóng một vai trò quan trọng trong các sinh vật sống, đặc biệt là tronglĩnh vực sửa chữa DNA

Các endonuclease không đặc hiệu có liên quan đến DNA có thể quét DNA để tìm hưhỏng hoặc trình tự mục tiêu Loại nuclease này khuếch tán cùng với DNA cho đến khi nógặp mục tiêu Sau đó, phần còn lại của vị trí hoạt động của nó trộn lẫn với các nhóm hóahọc DNA Đối với các endonuclease như BamHI, EcoRV và PvuII, các tương tác tĩnhđiện giữa DNA và diện tích bề mặt tối thiểu của protein liên quan đến liên kết không đặchiệu Hình dạng tổng thể của DNA không bị biến dạng do sự liên kết yếu này, do đó vẫn

ở dạng Beta

Ngược lại, các vùng cụ thể của nuclease có thể hình thành các liên kết mạnh hơn nhiều.Chúng có thể hút DNA vào rãnh sâu của miền liên kết DNA của chúng Nó gây ra sựbiến dạng đáng kể của cấu trúc bậc ba DNA và được thực hiện với các bề mặt giàu dưlượng cơ bản hoặc tích điện dương Các hạt nhân như vậy tham gia vào tương tác tĩnhđiện với DNA một cách rộng rãi

Một số hạt nhân liên quan đến sửa chữa DNA là một phần trình tự cụ thể Tuy nhiên,phần lớn các hạt nhân không đặc hiệu và nhận ra những bất thường về cấu trúc được tạo

ra trong xương sống DNA bằng cách sử dụng các cặp cơ sở không khớp

Ứng dụng

Là một kỹ thuật quan trọng được sử dụng để chuẩn bị các đầu dò có nhãn hiệu cho các kỹthuật sinh học phân tử khác nhau như blotting, lai tạo tại chỗ 999, lai tạo huỳnh quang

999 tại chỗ 999 Nó là in vitro phương pháp ghi nhãn DNA Đầu dò DNA được sử dụng

để xác định trình tự ADN hoặc RNA cụ thể Với sự trợ giúp của một đầu dò ghi nhãn, cácmảnh cụ thể có thể được đánh dấu hoặc hình dung từ một hỗn hợp axit nucleic Do đó,các đầu dò nhãn được chuẩn bị bằng cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau để sử dụng chocác kỹ thuật khác nhau Nick translation là một trong những phương pháp đó tạo ra cácmáy dò nhãn với sự trợ giúp của các enzyme DNase 1 và DNA polymerase 1

- Khi nào DNA được tái bản trong chu kỳ tế bào?

+ DNA được sao chép trong giai đoạn interphase, giai đoạn của chu kỳ tế bào trướcbốn giai đoạn nguyên phân: anaphase, prophase, prometaphase và telophase TheoCyberBridge, một trang web về khoa học sự sống do Đại học Harvard duy trì, sự saochép DNA xảy ra trong giai đoạn S của interphase

1

Tế bào dành 90% thời gian của chúng trong khoảng thời gian giữa các pha, trong đó tếbào phát triển, sản xuất protein, sao chép DNA và chuẩn bị cho quá trình nguyênphân Cũng như phần còn lại của chu kỳ tế bào, các quá trình này xảy ra theo từnggiai đoạn, không phải tất cả cùng một lúc Interphase được chia thành ba giai đoạnchính: G1, S và G2 Trong giai đoạn S của interphase, theo sau G1, tất cả các nhiễmsắc thể đều được sao chép Sau khi sao chép, mỗi tế bào bây giờ bao gồm haicromatide chị em

+ Mặc dù số lượng DNA thực tế tăng gấp đôi, nhưng thể đơn bội, số lượng nhiễm sắcthể, vẫn không đổi Tế bào của con người vẫn lưỡng bội sau khi nhân đôi, có nghĩa làchúng duy trì số lượng 46 nhiễm sắc thể Nói cách khác, số lượng cromatide tăng gấpđôi trong quá trình sao chép Tuy nhiên, số lượng nhiễm sắc thể và tâm động vẫnkhông thay đổi

+ Sau khi sao chép, interphase tiếp tục vào giai đoạn G2 của nó, giai đoạn này tổnghợp protein Sau đó, tế bào vào phần còn lại của chu kỳ tế bào hoặc vào G0 Theo

CyberBridge, G0 là một giai đoạn giữa các pha đối với các tế bào không tái tạo, trong

đó các tế bào sẽ không hoạt động cho đến khi cần có các tế bào mới

- Tại sao tế bào tạo bản sao DNA của nó trước khi nguyên phân xảy ra?

+ Một tế bào tạo ra một bản sao DNA của nó trước khi nguyên phân xảy ra, do đó, cómột bộ DNA cho tế bào con sau khi quá trình nguyên phân đã xảy ra Vì mỗi tế bàocần một bộ DNA riêng nên phải có hai bộ DNA hiện diện trong một tế bào trước khi

nó phân chia thành hai

+ Nguyên phân là quá trình phân chia tế bào để tạo ra một tế bào mới giống hệt tế bàoban đầu Các tế bào xôma, chẳng hạn như cơ, tóc và da, trải qua quá trình nguyênphân thường xuyên ở người và các sinh vật khác Đây là kiểu phân chia tế bào quantrọng cần thiết để tạo điều kiện sửa chữa các tế bào bị tổn thương, tăng trưởng và thaythế các tế bào cũ bằng các tế bào mới

+ Khi một tế bào mới được tạo ra, tế bào đó phải có cùng một thư viện thông tin ditruyền mà tất cả các tế bào khác trong cơ thể có quyền truy cập Bởi vì tất cả các vậtchất trong tế bào mới phải đến từ tế bào đầu tiên, tế bào ban đầu phải tạo một bản saoDNA của nó trước khi hoàn thành quá trình nguyên phân Hai bộ DNA này chỉ tồn tạitrong khoảng thời gian tế bào phải trải qua quá trình nguyên phân, có thể từ 30 đến 90

phút trong một số tế bào nhất định của con người Khi quá trình phân chia tế bào hoàn

tất, cả hai tế bào đều có một bản sao ADN giống hệt nhau.II Các mô hình tái bản

Dựa trên mô hình DNA của Watson và Crick, các giả thuyết về mô hình tái bản DNAgồm:

1 Cơ chế tái bản bán bảo toàn:

a) Cơ chế tái bản ở prokaryote:

- Đặc điểm cơ bản của sự tái bản đó là tái bản theo phương thức bán bảo toàn(semiconservative replication) Tái bản bán bảo toàn nghĩa là trong hai chuỗi của tất cảcác phân tử DNA bao giờ cũng có:

+ Một chuỗi của DNA cũ (từ một trong hai chuỗi của DNA mẹ)

+ Một chuỗi của DNA mới (mới được tổng hợp)

- Mỗi một lần tái bản đều có sự tách rời của hai chuỗi của DNA mẹ, đồng thời mỗi chuỗi

mẹ tiến hành sao chép để cho một chuỗi con, chuỗi này sau đó lại kết hợp với chuỗi mẹ

- Vị trí mở xoắn kép và tổng hợp DNA mới cùng một lúc trên DNA gọi là chạc ba tái bản(replication fork) do cấu trúc của vùng tái bản có hình chữ Y Sự tổng hợp DNA mới gắnliền với việc mở xoắn DNA cũ

b) Cơ chế tái bản ở eukaryote:

- Sự tái bản ở tế bào eukaryote phức tạp hơn so với ở tế bào prokaryote nhưng cơ chế của

sự tái bản ở eukaryote cũng tương tự như ở prokaryote và tiến hành theo các nguyên tắc:+ Hai hướng

+ Bổ sung, đối song song, theo chiều 5’ 3’

+ Không liên tục ở một trong hai chuỗi

+ Cần những RNA primer

- Tuy nhiên, có một số điểm khác như sau:

+ Trong khi ở prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu, thì sự tái bản ở eukaryote bắt đầucùng một lúc ở nhiều điểm khởi đầu Điều này là cần thiết do DNA của eukaryote cóchiều dài rất lớn

+ Vận tốc phát triển của chạc ba tái bản ở eukaryote (khoảng 50 nucleotide/s) chỉ bằng1/10 so với ở E coli

2 Cơ chế tái bản bảo toàn (conservative):

Chỉ 1 phân tử tạo thành mang sợi khuôn kết hợp với nhau, các phân tử còn lại mang DNAhoàn toàn mới

3 Cơ chế tái bản phân tán (dispersive):

Các phân tử tạo thành mang 1 phần khuôn DNA và 1 phần DNA mới tổng hợp

~•~

Cơ chế phân tử của sự sao chép DNA:

Sao chép DNA phụ thuộc vào nhiều enzyme, để được thực hiện một cách hiệu quả DNA

có bản chất là sợi kép và để được sao chép, cấu trúc này phải được giải nén Vị trí tháo gỡban đầu được gọi là điểm khởi đầu của quá trình sao chép Sau đó, các enzyme khácthêm các đoạn ADN mới vào sợi đã giải nén để tổng hợp hai phân tử ADN mới Điều này

được gọi là sao chép bán bảo tồn và là cách sao chép DNA được chấp nhận nhiều nhất.Các cơ chế sao chép DNA được đề xuất khác bao gồm sao chép DNA bảo thủ và saochép DNA phân tán, nhưng những cơ chế này đã bị bác bỏ Cấu trúc hình chữ Y được tạo

ra bởi quá trình tháo xoắn và sao chép DNA được gọi là ngã bar sao chép

Hình 1: Phân tử DNA sợi kép ban đầu được tách thành hai sợi đơn, sau đó chúng đóng

vai trò là khuôn mẫu để tổng hợp hai sợi mới Những sợi mới này được gọi là sợi bổ sungbởi vì các cặp base nucleotide của chúng là “bổ sung” cho chuỗi mẫu ban đầu Do đó,adenine và cytosine trên một sợi sẽ luôn được ghép nối với thymine và guanine tươngứng trên sợi kia Kết quả của quá trình sao chép bán bảo toàn là hai phân tử DNA con cótrình tự nucleotide giống hệt trình tự của phân tử mẹ và mỗi phân tử này có một mạch từphân tử mẹ và một mạch mới được tổng hợp Thực tế là một mạch được bảo toàn từ phân

tử mẹ chứ không phải cả hai, đó là lý do tại sao mô hình sao chép DNA này được gọi là

Khi quá trình tự nhân đôi kết thúc, 2 phân tử ADN con được tạo thành rồi đóng xoắn vàsau này chúng được phân chia cho 2 tế bào con thông qua quá trình phân bào

Kết quả: Từ 1 phân tử DNA mẹ ban đầu hình thành nên 2 DNA con giống nhau và giốnghệt DNA mẹ

(Phương thức sao chép này liên quan đến việc phân tách các chuỗi gốc, nghĩa là hai phân

tử con sẽ có một chuỗi từ phân tử DNA mẹ Phương thức sao chép này đã được chứngminh là đúng bởi các nghiên cứu liên quan đến ly tâm và DNA huỳnh quang.)

Hình 3: Phương thức sao chép này liên quan đến việc phân phối DNA của cha mẹ vào

DNA mới được tổng hợp Các phân tử DNA con sẽ có khảm DNA mới và DNA mẹ

III Thí nghiệm Meselson-Stahl:

- Kiểu tái bản DNA được xác định bởi M Meselson và F W Stahl vào năm 1958

- Thí nghiệm phân biệt phân tử DNA ban đầu và DNA mới được tổng hợp dựa vào sựphát triển của E coli trong môi trường chứa 1 đồng vị nặng của ni-tơ N15 trước khichuyển sang môi trường chứa N14 Mật độ DNA qua các thế hệ được phân tích bằngphương pháp ly tâm gradient tỷ trọng sử dụng CsCl

- Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý thuyết tái bản DNA

theo kiểu bán báo toàn (Hình 4.1) Các tác giả trên đã nuôi cấy E coli trong nhiều thế hệ

trong một môi trường chứa 15NH4Cl làm nguồn cung cấp nitrogen duy nhất Bằng cáchnày, DNA được tổng hợp có 15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng xạthông thường 14N) Ở một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyểnnuôi cấy vào một môi trường chứa 14NH4Cl Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họphân tích DNA chiết xuất từ vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo gradient CsCl

+ Hình 4.1 Minh họa sự tái bản bán bảo toàn Sơ đồ trình bày sự hợp thành các sợi đôiDNA sau: 0, 1, và 2 vòng sao chép H: chuỗi nặng (15N), L: chuỗi nhẹ (14N)

- Kết quả thực nghiệm cho thấy:

+ Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N

+ Sau một thế hệ trong môi trường chứa 14N: những phân tử DNA gồm một chuỗinặng 15N (chuỗi mẹ) và một chuỗi nhẹ 14N (mới được tổng hợp)

+ Sau hai thế hệ trong môi trường chứa 14N: có hai phân tử lai (gồm một chuỗi nặng

và một chuỗi nhẹ) và hai phân tử đều gồm những chuỗi nhẹ không có chuỗi nặng IV.

Quy trình tái bản DNA:

- Xảy ra ở giai đoạn interphase

- Thành phần tham gia:

+ Protein nhận biết và bám vào điểm khời đầu tái bản (ori) đễ hình thành phức hợp mở(ở E.coli là dnaA)

+ DNA gyrase: mở cuộn DNA siêu xoắn phía trước mỗi chạc tái bản

+ Helicase: tháo xoán các sợi DNA mạch kép, hình thành các vùng sợi đơn (ở E.coli làdnaB)

+ Primase: Tổng hợp các đoạn mồi RNA (ở E.coli là protein dnaG)

+ Protein SSB (single strand binding protein): bám vào vùng DNA sợi đơn do Helicasetách ra, giữ tạm thời không cho DNA xoắn lại

+ DNA polymerase IlI: là enzyme chính tham gia quá trình tổng hợp DNA, có hoạttính polymerase 5'-3' và hoạt tính exonuclease 3'-5'

+ Topoisomerase : là enzyme giúp DNA không còn siêu xoắn

- Quy trình:

+ Chuỗi xoắn kép DNA bao gồm 2 mạch bắt cặp bổ sung

+ Mỗi mạch có thể làm nền để tổng hợp nên mạch mới

+ Cách thức tái bản như vậy được gọi là mô hình bảo thủ một nửa (semiconservative).+ Một mạch được tổng hợp liên tục, một mạch được tổng hợp không liên tục (các đoạnngắn sau đó được nối lại) được gọi là sao chép bán liên tục.

+ Cần mồi RNA primer

- Sự sao chép DNA:

+ Enzyme helicase sẽ tháo xoắn DNA

+ Các SSB protein bám vào DNA để gúp chúng tách ra:

- Enzyme Primase sẽ tạo ra RNA Primer ở 2 mạch để giúp DNA Polymerase bắt đầu.

- Một mạch được sao chép liên tục (leading trand) hướng vào ngã ba sao chép(replicating fork)

- Một mạch được sao chép không liên tục(lagging strand) tạo ra các đoạn 1-2kb Okazakitheo hướng ngược lại (hướng ra khỏi ngã ba sao chép)

- Điều này đảm bảo cả hai mạch được sao chép theo đúng chiều 5’-3’:

- Enzyme Exonuclease sẽ loại bỏ các RNA Primer này ở cả 2 đầu:

- 1 Enzyme polymerase khác sẽ tổng hợp các đoạn còn thiếu này

- Enzyme DNA Ligase sẽ nối các đoạn okazaki lại

- Kết quả là tao ra 2 sợi DNA giống hệt nhau

- Tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semi-conservative): Môt sợi cũ làm khuôn, tổnghợp thêm 1 sợi mới