Y sinh học phân tử thực hành bài 2 ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán một số bệnh di truyền DHQ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG ài 2: Ứng dụng kỹ thuật PCR trong “thân đoán một sô bệnh di truyên GAN KET — PHAT TRIEN — HOI NHAP... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Bệnh di truyền +

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Y sinh hoc phan tw

TS Duong Hong Quan Trung tam Xét nghiém, Truong Dai hoc Y té cong cong

GAN KET — PHAT TRIEN — HOI NHAP

Trang 2

ài 2: Ứng dụng kỹ thuật PCR trong

“thân đoán một sô bệnh di truyên

Trang 3

TRUGNG DAI HOC Y TE CONG CONG

Sau khi hoc xong, sinh vién co kha nang:

1 Tóm tắt nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật SHPT ứng

dung trong chan đoán một số bệnh di truyền

2 Thực hiện được kỹ thuật tách DNA, biến thể của PCR, điện di

3 Phân tích đúng kết quả

Trang 4

Bệnh di truyền

+ Chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể

+ Chân đoán bất thường øen

Trang 5

Chân đoán bất thường nhiễm sắc thể

Trang 6

Trang 7

ộ nhiễm sắc thể người (karyotype)

Trang 8

trước hôn nhân "~ _ sàng lọc sơ sinh

Trang 9

John Langdon Down

(1828 - 1896)

Trang 11

Sàng lọc, chân đoán trước sinh

Tiền sử bệnh bẩm sinh, di truyền

Tudi me

Siéu am SLTS 11 - 13 tuần 6 ngày

SÀNG LỌC CHAN DOAN TRƯỚC SINH

Trang 12

TRƯỜNG DAI HOC Y TE CONG CONG

Combined test

Thai 11 tuan-—13tuan6ngay (CDDM: 45 — 84mm)

DOUBLE TEST NT COMBINED

PAPP-A +free bhCG Nuchal Translucency TEST

(Dương tinh gia: 5%)

Trang 13

Thai 14 tuần — 20 tuần 6 ngày (ĐKLĐ: 26 — 49mm)

uE3 + AFP + free beta hCG

Trang 14

Họ tên: NGUYEN THI LE Ngày sinh: 26/05/1988

Địa chỉ: TIÊN GIANG Tuôi lúc sinh: 31.46

BS chỉ định: Só HS nơi gửi:

Hút thuốc lá: không Tiêu đường: Khôn Chủng tóc: Châu Á Số thai: 1 Tuôi thai: 11 tuần 4 ngày [can nặng 40 kg | Ngày lắy mẫu: 24!04i2019 CRL: 52mm (24/04/2019)

KÉT QUÁ Xét nghiệm Nồng độ MoM hiệu chính

free BhCG 120 ng/mL 1.55

NT (Nuchal Translucency) 1.5 mm 1.10 - -

PAPP-A 1005 mU/L 0.26 | PAPP-A giảm rât thâp

PHƯƠNG PHÁP Miễn dịch huỳnh quang kéo dài AuftoDEL FIA và LifeCycle (Perkin Elmer)

ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ TRISOMY

Hội chừng Down (Irisomy 21)

Kết quả: NGUY CƠ CAO

Nguy cơ theo tuổi thai phụ 1/802 Cưoff 1/250†— — — — ăn

Nguy cơ theo xét nghiệm 1/226 Nguy cơ Hội chứng Down 1/226 có nghĩa là trong 226 thai phụ = tuổi T24

có thể có 1 thai phụ sinh con có hội chứng Down 1802 1/226

ĐÊ NGHỊ CHỌC ÓI HOẠC XÉT NGHIEM NIPT KIEM TRA

Trang 15

Ho tén: VO TH! THUY Ngày sinh: 08/03/1991

Dia chi QUÂN 1 Tuổi lúc sinh: 28.64

BS chỉ định: Sá HS nơi gửi:

Hút thuốc lá: không Tiếu đường: Không Chùng tộc: Châu À Số thai: 1

| Tuổi thai: 13 tuần 4 ngày | Cân nặng 45 kg Ngảy láy mẫu: 24/04/2019 CRL: 80mm (24/04/2019)

KÉT QUÁ

Xét nghiệm Nẵng độ MoM hiệu chính

free BhCG 120 ng/mL | 2.55 | Fb HCG tang cao

NT (Nucha! Translucency) 1.5 mm 0.86 PAPP-A 1005 mU/L 0.14

PHUONG PHAP Mién dich huynh quang kéo dai AutoDELFIA va LifeCycle (PerkinElmer)

ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ TRISOMY

Hội chứng Down (Trisomy 21)

Kết quả: NGUY CƠ CAO Nguy cơ theo tuếi thai phụ 1/1107

Nguy cơ theo xét nghiệm 1/87 Cưof 1250 — — — — — =

Nguy cơ Hội chứng Down 1/87 có nghĩa la trong 87 thai phụ Th eotudi 121

có thé cé 1 thai phụ sinh con có hội chứng Down 1/1107 1/87

ĐÈ NGHỊ CHOC ÓI HOẠC XÉT NGHIỆM NIPT KIEM TRA

Trang 16

Bo me binh thường, con Trisomy:

95% HC Down do đột biên NST ngẫu nhiên

90% trong quá trình tạo trứng, 10% tạo tinh trùng

Trang 17

Robertsionan Translocation —- Chuyển đoạn hòa nhập tâm

Trang 18

HH 1 2 3 MN HH 4 5

Trang 19

Trang 20

Ultrasound probe ‘Syringe

Thai 16 — 20 tuần, Dễ thực hiện

Nguy cơ say thai do thủ thuật: thâp < 0,5%

Nhược điêm: thai lón

Trang 21

Mâu dịch ôi

Trang 22

FISH Prenatal

| | BoBs

Số lượng NST -

Hoặc 1 Xóa vi đoạn Chân

Thực hiện riêng biệt đoán

trước sinh Karyotype Ỉ Array CGH

Cấu trúc đại thê +

sô lượng NST Khảo sát toàn bộ NST

ở mức độ gen

0 ses) a= ln) vẽ tếr®earayrwwr—m

Trang 23

Karyotype

1 NUOI CAY TE BAO

Cáy ối 14 ngày Theo dõi tế bào phát triển Thay môi trường nuôi cấy

Thất bại: nắm, không mọc

Tủ cấy CO2, 37oC, 5% CO2, vô trùng Bình & môi trường cấy TB

Trang 24

Trang 25

Karyotype

Sees 2 THU HOACH, LAM TIEU BAN

———— Ihu hoạch, Giữ tế bào ở ky giữa

' thích hợp (NST co lại vừa phải)

Nhỏ tiêu bản, sao cho NST duõi

Trang 26

Karyotype

; A | lự

3 Lập bộ nhiễm sắc thê

Chụp hình cụm kỳ giữa trên kinh hiền vi (~ 50 mitose)

Phân tích trên máy tính, xếp bộ > In và trả kết quả

0 ses) a= ln) vẽ tếr®earayrwwr—m

Trang 28

Trang 29

Trang 30

Trang 31

Trisomy 18, hoi chung Edwards

Trang 32

Trang 33

Trang 34

Trang 35

` Là 3 Gonadal! streak

\ fe, (underdeveloped

if gonadal eii* | \ structures)

Brown spots (nevi) —

" No menstruation

Trang 36

Trang 37

47, XXY, hội chứng Klinefelter

Small testes

Trang 38

Trang 39

Trang 40

Trang 41

+ Loại bỏ tê bào ngoại nhiêm

Trang 42

+ Tôn công sức

+ Không phát hiện được bất thường < 4Mb

+ Không kết luận được vì hình ảnh không rõ

+ Nguy cơ cay té bao that bai

Trang 43

Trang 44

+ Khảo sát nhanh số lượng NST hoặc 1 đoạn NST

+ Năng suât kém, không loại trừ được ngoại nhiễm máu mẹ

Trang 45

Trang 46

Kỹ thuật FISH

Trang 47

OS eee ee CL = trisomy

Khuéch dai cac locus Tín hiệu NST trên biểu đồ điện di

kích thước khác nhau Xác định sô lượng NST

GAN KET — PHÁT TRIẾN — HỘI NHẬP

Trang 48

+ Dich 6i 2mL, tach DNA bang cét loc (Qiagen)

+ Multiplex PCR: 2 PCR mix = 28 marker > PCR thu 3 néu khéng du

thong tin dé két luan (Devyser Complete va Resolution)

+ Phan tach doan DNA bang dién di mao quan: ABI 3500

+ Phân tích kết qua bang GeneMarker (SoftGenetics) + Đối chiếu kết quả voi karyotype

Trang 50

KY thuat QF PCR

Trang 53

Trang 55

+ fy >

K-PCR u diem

+ Phát hiện được ngoại nhiễm máu mẹ

+ Nhanh, chính xác, năng suất cao

- Độ đặc hiệu: 100%, không dương tính giả

- liên đoán dương: 100?

- Liên đoán âm: 99,8%

- Ty lệ phát hiện lệch bội (13, 18, 21, X, Y): 99,5%

Trang 56

+ Không xác định được bất thường câu trúc

- Mất đoạn, thêm đoạn

Trang 57

Xét nghiệm Prenatal BoBs

Phat hién 5 lech boi va

9 microdeletion co tan suat cao nhất (1/1.350 — 1/1.800)

* Trisomy 21 * DiGeorge (del 22q11.2; del 10p14)

* Trisomy 18 * Williams-Beuren (del 7q11.2)

* Trisomy 13 ° Prader-Willi (del 15q11-q12)

Aneuploidy X ° Angelman (del 15q11-q12) : Aneuploidy Y ° Smith-Magenis (del 17p11.2)

Trang 58

Xét nghiệm Prenatal BoBs

Bactenum BAC PCR of BAC clone AmplifiedDNA xMAP

= BAC (probe NST nhan tao) đặc hiệu được gan lên Bead (hat nano)

= NST 13, 18, 21,X, Y : mỗi loại có loại Bead đặc hiệu

=_ 9 hội chứng xóa vi đoạn : mỗi loại có 4 - 8 loại Bead đặc hiệu

“ Tổng cộng 85 loại Bead được mã hóa bằng phố màu khác nhau,

mỗi loại Bead có > 1 triệu cái

Trang 59

DNA Nghiém pham va Mau tham chiéu nam, Mau tham chiéu nir

được đánh dấu huỳnh quang và lai gắn với các probe trên các Bead

Sản phẩm lai được đưa vào

Luminex 200 đê đọc tín hiệu

(96 mau trong 1 lan XN)

Phân tích tín hiệu bang BoBsoft

Trang 60

Prenatal BoBs: XY binh thuong

Normalized Ratios

Threshold: 0,93-1,07 Threshold Y: 0,90-1,10

Expand AR aa Sample/F Sample/M 0.0 0.5 1.0 1,5 2.0

(5) 13C 0,96 0,98 (+) (5) 18C 1,01 1,03 a (5) 21C 0,99 1,01

(6) AUTO 1,00 1,00 (+) (8) CDC 0,98 0,99 (5) DGS 0,98 1,03

(4) DIG 0,97 0,98

(7) LGS 1,01 1,02 (7) MDS 0,99 1,02 (7) PWS 0,99 1,01

(4) SMS 0,98 0,99

(5) WBS 1,01 1,06 (5) WHS 0,98 1,01

Trang 61

Prenatal BoBs: Trisomy 21, XX

(5) 21C 1,31 1,37 mm (6) AUTO 1,01 1,01 T

(+) (8) CDC 0,98 0,99 s

(5) DGS 0,99 1,02 :

(4) DiG 0,98 1,01 -

(7) LGS 0,99 1,00 : (4) (7) mos hà 0,99 1,05 j

(7) PWS 0,97 0,99 (4) SMS 1,02 1,05 (5) WBS 1,06 1,09

(5) WHS 0,99 1,02 x (+) (5) XC 1,03 1,63 |

KET — PHÁT TRIẾN — HỘI NHÂP

Trang 62

(+) (5) YC 1,07 0,21 tị , A

Trang 63

Trang 64

Trang 65

Trang 66

Trang 68

Array-CGH: Del 7p22.1-15.2, XY TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Genome View (Amp/Del) /°256755910866 2 4' analyzed with ‘Single Cell Smal! Aberration

Analysis Method’

vse Dteede test

Amp/Gain/Loss/Del Intervals Table (256755910866_2_4)

Chr Start-Stop(bp) Cytoband Sizetkb) #Probes ¬ yo peo Pei

chr] 5) 70846-26221/83 p22.1 - p15.2 20,450 938 362 -0.843 NA RNF216, ¿NF819P,

00M, C21, RSPH10B2

Amp=Amplitication Del=Ueletion

Total Amp/Gain/Loss/Del Intervals: 1

Hoi ching Cri-du-Chat GAN KET — PHAT TRIEN — HOI NHAP

Trang 69

=Prenatal BoBs và Array-CGH (UU điềm

Trang 70

4 Chong chỉ định khi có tam bội

+ Không phát hiện được khảm

+ Không phát hiện được trao đối đoạn cân băng

+ Không phát hiện được ngoại nhiễm máu mẹ

Trang 71

Hoặc 1 Xóa vi đoạn Chân

Thực hiện riêng biệt doan

Trang 72

( \ Wheeber’s blood with \ \, Macher s Divod with | i \ Wiceber’s Diood with Cah Wocber’s blood wiih

—~ KG le email & tostat OMA Pr » \rotemal B tostat ONA cờ _* (roterna! & tostat ONL 7 `ŠẲẮ BS \rotema! & tasted TU regen oma Cr VS ⁄“ \ fortsiona CC ` wt \ WostalDNBA NS “ \ fOxtslONA Ý ¬\S v⁄ \

| MÀ, wen —~.v⁄ ˆ ' ; ` \ ie — v7 - 9 i : ` | —-v ˆ eee || — eee

, 2 ^ | ` (NTR ” Lh we (ee

ai PL - "` ee NI

‘ mỹ | , ‘ woh, | ` et | ' cae «ih |

Raby ond gloves Í baby Veerade Bary Focal Raby ond ploveste ;

howe toctal OWA ; howe foetal OWA howe Sootal OMA hewe tootal CNA |

Xót nghiệm sang lọc trước sinh không xám lãm

Trang 73

Thủ thuật xâm lẫn gây sây thai

Phương pháp tâm soát mới

° Tỉ lệ phát hiện cao hơn

- _ Tỉ lệ dương tính sai thấp hơn

* Chi dinh choc 6i, STGN it hon

Sang loc trước sinh không xâm lấn (NIPS)

Trang 74

Trang 75

NIPS: Non Invasive Prenatal Screening

DNA tu do cua thai

+ Nguồn gốc từ nhau thai

+ Tỉ lệ 3% - 19% cí-DNA c + Kích thước : ~170bp j x, \\ Mothers bod with

s 10.0 Baby and placenta

2 5.0 - have foetal ONA 0.0

50 Edlow AG, Bianchi DW Biochem Biophys week of pregnancy Acta 2012;1822-1970-80

Trang 76

ÑIPS: Non Invasive Prenatal Screening

1 Lay mau 2 Tách chiết cfDNA

Trang 77

°_ Bất thường số lượng nhiễm sắc thê

- Lệch bội 21, 18, 13, X, Y

- _ Có thê khảo sát 24 loại nhiễm sắc thé (1-22, X, Y)

‹ Xóa vi đoạn nhiễm sắc thê

- 22q11 deletion (DiGeorge)

- 15q11 deletion (Angelman/ Prader-Willi)

- 5p- (Cri-du-chat)

- Cac loai khac

Trang 78

NIPS: Non Invasive Prenatal Screening

Nghiên cứu trên 146.958 thai kỳ

TLTK: Zhang H, et al (2015) Non-invasive prenatal testing for trisomies 21, 18 and 13:

clinical experience from 146,958 pregnancies Ultrasound Obstetrics and Gynecology; 45(5):530-8

Trang 79

ANIPS: Non Invasive Prenatal Screening

CHONG CHỈ ĐỊNH

= Thai phụ (hoặc chông) khảm nhiễm sắc thể

= Song thai tiêu biến (Vanishing-twin)

= 3 thai

“ Bệnh ác tính

= Dang điều trị truyền máu

CÂN TRỌNG

= Điêu trị ghép: tủy, gan, thận, tế bào gốc

= Điêu trị chống đông Heparin

= Béo phi

GẮN KẾT — PHÁT TRIẾN — HỘI NHẬP

Định dạng
Số trang	84
Dung lượng	3,19 MB