Enzyme phổ biến trong Sinh học phân tử

Xúc tác phản ứng hình thành polymer bằng cách tập hợp các dNTP Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide ngay từ đầu de novo Xúc tác gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn Hầu hết

ENZYME PHỔ BIẾN TRONG

SINH HỌC PHÂN TỬ

NONG LAM UNIVERSITY IN HO CHI MINH CITY

FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES

N H Ó M 2

Ho Chi Minh, 19-03-2023

DNA

POLYMERASE

4

Các enzyme DNA polymerase tạo ra các phân tử DNA bằng cách lắp ráp

các nucleotide, đơn phân của DNA Các enzyme này rất cần thiết để tái

bản DNA và thường làm việc theo 2 nhóm cùng lúc để tạo ra hai phân tử

DNA “con” giống hệt nhau từ 1 phân tử DNA “mẹ” ban đầu

==> Một bản sao của phân

tử DNA ban đầu có thể được

thông qua với mỗi tế bào

con Bằng cách này, thông

tin di truyền

DNA POLYMERASE

được truyền từ thế hệ này

Xúc tác phản ứng hình thành polymer bằng

cách tập hợp các dNTP

Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide

ngay từ đầu (de novo)

Xúc tác gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của

primer

có sẵn

Hầu hết các polymerase dùng trong SHPT có

nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc từ các virus kí sinh

chúng

DNA POLYMERASE

6

Ở vi khuẩn có 3 loại DNA polymerase: Pol I, Pol II và Pol III.

Cả 3 loại đều có hoạt tính xúc tác kéo dài 5’-3’ với tốc độ khác nhau và

hoạt tính 3’-5’ exonuclease

Pol III là phức hợp enzyme chính điều khiển quá trình tái bản DNA

polymerase sử dụng hoạt tính 3’-5’ exonuclease để cắt các nucleotide tổng hợp trong quá trình sao chép)

DNA Pol I còn có hoạt tính 5’-3’ exonuclease E coli gồm 2 phần phân đoạn

lớn là đoạn Klenow có hoạt tính 5’-3’ polymerase và 3’-5’ exonuclease,

phân đoạn nhỏ có hoạt tính 5’-3’ exonuclease

7

DNA POLYMERASE ở

prokaryote

8

T4 DNA polymerase ở thực khuẩn thể cần khuôn

DNA sợi đôi

DNA polymerase của thực khuẩn thể T7 là công

cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA Dạng

chỉnh sửa của enzyme này có tốc độ polymer

hoá trên 300 nucleotide/giây

DNA POLYMERASE ở

prokaryote

9

DNA POLYMERASE ở

prokaryote

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu 3’-OH của DNA và không cần khuôn mẫu

TdT được sử dụng trong dán nhãn DNA với các nucleotide đã biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer hoặc giải trình tự DNA

TdT cần DNA primer sợi đơn khi có Mg2+, nhưng có

thể chấp nhận DNA sợi đôi như primer khi có Co2+

1 0

1 1

DNA POLYMERASE Ở PROKARYOTE

Polymerase bền nhiệt

Bst polymerase

- Bst polymerase là DNA Pol I bền nhiệt được phân lập

từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothermophilus

(Bst).

- Bst polymerase có chức năng tối ưu ở 60-65°C,

nhưngbiếntính trên 70°C

- Có hoạt tính 5’-3’ exonuclease và hoạt tính đạt mức cao

nhất khi có nồng độ cao Mg2+, nó không có khả năng đọc

sửa vì thiếu hoạt tính exonuclease 3′-5′.

.

1 2

DNA POLYMERASE Ở PROKARYOTE

Polymerase bền nhiệt

Taq polymerase

- Taq polymerase được tinh sạch lần đầu tiên vào

năm 1976 từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus

- Với một nhiệt độ hoạt động tối ưu là 75-80°C,

Taq polymerase có thể được tái sử dụng qua

một vài chu kỳ PCR mà không bị biến tính bởi

nhiệt

- Taq polymerase thiếu hoạt tính 3’- 5’ exonuclease

(hoạt tính sửa sai, proofreading), là enzyme có độ

chính xác thấp

1 3

DNA POLYMERASE Ở PROKARYOTE

Tth polymerase

- Tth polymerase được phân lập từ

Thermus thermophilus, có khối lượng

94kDa

- Thiếu hoạt tính đọc sửa exonuclease 3′-5′

- Tth DNA polymerase biểu hiện hoạt tính phiên

mã ngược hiệu quả trong sự có mặt của ion

Mn2+, cho phép nó tổng hợp cDNA từ RNA

1 4

DNA POLYMERASE Ở PROKARYOTE

DNA polymerase bền nhiệt có hoạt tính sửa sai

- Nhiều DNA polymerase phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt có hoạt

tính 3’- 5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai) giúp tăng độ chính

xác

+ Pfu từ Pyrococcus furiosus có tỉ lệ sai sót là 1,6x10-6

+ Pow polymerase (từ Pyrococcus woesei) có chu kì bán phân huỷ

trên 2 giờ ở 100°C và tỉ lệ sai sót rất thấp 7,4 x 10-7; chỉ hiệu quả

đối với khuôn mẫu có kích thước dưới 3,5 kb

+ Hỗn hợp của Taq và Pow cho phép khuếch đại DNA có kích thước lớn

(20 – 35 kb)

15

REVERSE TRANSCRIPTASE

Rous Sarcoma Virus (RSV) và Rauscher Leukaemia virus (RLV)

thuộc nhóm retroviridae (retrovirus)

Chu kì sống gồm quá trình phiên mã bộ gen RNA và hình thành DNA

sợi đơn bổ sung để cài nhập vào bộ gen tế bào chủ

16

Retrotransposon: các yếu tố di truyền giống như retrovirus

nhảy từ vị trí này sang vị trí

khác trong bộ gen thông qua dịch mã thành RNA, phiên mã ngược thành DNA và chèn vào

vị trí mới

Telomere là những đoạn DNA

không mã hóa gene có trình tự

lặp lại (thường là TTAGGG) nằm ở phần cuối của DNA cùng với một đoạn mạch đơn nhô ra ở đầu 3’

giàu guanine (G) và có chứa một

số protein liên quan

Tác dụng:

+ Duy trì sự ổn định của hệ gene+ Bảo vệ nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào

+ Giữ cho các nhiễm sắc thể

không

dính vào nhau

Cấu trúc

Telomerase

Telomerase là 1 phức hợp

ribonucleoprotein đóng vai trò thêm những trình tự lặp lại

telomere vào đầu 3’ của NST

(hTR or TERC): dùng làm

mạch khuôn RNA cho hTERT

tổng hợp mạch cDNA H/ACA

box : phức hợp các protein có vai trò hoạt hóa telomerase

và ổn định các liên kết

RNA

POLYMERASE

RNA POLYMERASE

RNA polymerase là một enzyme đa đơn vị tổng hợp các phân tử RNA

từ một mẫu DNA thông qua một quá trình gọi là phiên mã

Gồm có nhân tố xích ma(nhận biết promoter) Enzym lõi (kéo

dài chuỗi ribonucleotid) enzym lõi có hai chuỗi anpha, 1 chuỗi

beta, 1 chuỗi beta

sử dụng trong tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn.

SP6 RNA POLYMERASE

SP6 RNA Polymerase là RNA polymerase phụ thuộc DNA được sử dụng để sao chép in vitro Dùng để tổng hợp các chuỗi RNA từ các mẫu DNA ngắn có chứa vùng khởi động 18 cặp bazơ

RNA polymerase: sử dụng trong tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn.

2 RNA polymerase được sử dụng phổ biến nhất

trong sinh học phân tử là:SP6 RNA polymerase, T7 RNA polymerase

RNA POLYMERASE

ĐẶCĐIỂM CHUNG

Cần Mg 2+ và một khuôn DNA sợi đôi

Rất đặc hiệu về promoter và sẽ phiên mã trình tự DNA được tạo dòng dưới

sự kiểm soát của promoter tương ứng ( SP6 hoặc T7)

Quá trình phiên mã diễn ra hết phần đuôi poly(A) vì thế ở khuôn mẫu

dạng tròn, quá trình này có thể lặp đi lặp lại nhiều lần trước khi RNA poly tách ra.

Làm thẳng mạch khuôn trước khi dịch mã đảm bảo sự kết thúc hiệu quả

trình phiên mã

DNA LIGASE

0

3

DNA ligase là một enzyme xúc tác cho quá trình sửa chữa các đứt gãy của sợi đơn bằng cách hình thành liên kết phosphodiester cộng hóa trị giữa 3'-hydroxyl và 5'- phosphoryl liền kề trong DNA sợi kép

Phản ứng phụ thuộc ATP

Cần lưu ý : DNA ligase không thể nối liền

hai phân tử của chuỗi đơn DNA mà chuỗi DNA được nối liền bởi DNA ligase phải là một phần của phân tử xoắn kép DNA

Trong SHPT, DNA ligase được sử dụng để nối các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu dính, thêm linker/adaptor hay sửa các

vị trí hở (nick)

ĐẦU BẰNG

ĐẦU DÍNH

DNA ligase không bền nhiệt gồm DNA ligase

từ Chlorella virus và thực khuẩn thể T7 (34

kDa, 41 kDa), thực khuẩn thể T4 (68 kDa).

DNA ligase bền nhiệt được phân lập từ nguồn

vi khuẩn chịu nhiệt, hoạt động ở nhiệt độ từ

45 – 80oC

T4 DNA ligase là một đơn phân

có khối lượng 68 kDa cần Mg2+

và ATP để hoạt động.

Nó có thể gắn các đoạn ADN có đầu dính hoặc đầu bằng

T4 DNA ligase đã trở nên được sử dụng rộng rãi hơn trong xử lý DNA

T4 DNA LIGASE

RNA LIGASE

RNA ligase xúc tác hình thành nối

phosphodiester giữa đầu 5’ phosphate

và 3’- OH của RNA sợi đơn hay phân

tử DNA

RNA ligase khác với DNA ligase ở chỗ RNA ligase sử dụng các phân tử

ssRNA để sắp xếp và nối, trong khi

DNA ligase yêu cầu cấu trúc song

song

Hơn nữa, RNA ligase ưu tiên RNA làm

cơ chất, trong khi DNA ligase ưu tiên DNA làm cơ chất.

PHOSPHATASE

VÀ KINASE

0 4

ALKALINE PHOSPHATASE

Alkaline phosphatase được tinh sạch từ E.coli

hoặc các sinh vật bậc cao

Vì DNA thường sở hữu các nhóm phosphate ở

đầu 5' Việc loại bỏ các phosphat này ngăn

không cho DNA nối lại (đầu 5' gắn với đầu 3' ),

do đó giữ cho các phân tử

DNA thẳng hàng cho đến bước tiếp theo của quy trình mà chúng đang được chuẩn bị hoặc ngăn chặn sự đóng vòng của DNA vector trong các thí nghiệm tạo dòng.

AP bị bất họa bởi các tác nhân tạo phức

(chelating agents) như EGTA, nồng độ thấp của

phosphate vô cơ.

T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE

T4 polynucleotide kinase là viết tắt của T4 PNK Nó được thể hiện bởi E coli.

T4 PNK đánh dấu đầu cuối 5' hoặc phosphoryl hóa các oligonucleotide, DNA hoặc RNA; Phosphoryl hóa 5' của mononucleotide xúc tác cho quá trình photphoryl hóa 3' và loại

bỏ 3' nhóm photphat tận cùng.

0

5

Nuclease là loại enzym có khả năng cắt liên kết phôtphođieste của axit nuclêic, làm axit nuclêic bị phân giải thành các đơn vị nhỏ hơn.

Các nuclease, thuộc nhóm enzyme được gọi là hydrolase, thường hoạt động đặc hiệu, các ribonuclease chỉ tác động lên axit ribonucleic (RNA) và deoxyribonuclease chỉ tác động lên axit deoxyribonucleic (DNA)

+ Tạo các đoạn DNA ngẫu nhiên bằng cách cắt sợi đôi DNA

+ Tinh sạch RNA từ tế bào hay hỗn hợp phiên mã

Nick

translation

Exonuclease III (exodeoxyribonuclease III) là một enzyme đơn

phân tử 28 kDa với nhiều hoạt tính:3’-exonuclease, xúc tác

loại bỏ từng nucleotide khỏi đầu 3’-OH của sợi đôi DNA.

nhóm 3’-phosphate.

khỏi khung đường phosphate của DNA.

Rnase T1 là một protein 11 kDa được tinh sạch từ Aspergillus oryzae, có hoạt tính endonuclease phân cắt đặc hiệu RNA

sợi đơn ở base G

Rnase T2 cũng được tinh sạch từ Aspergillus oryzae,

có KLPT 36000 và cắt tất cả các liên kết phosphodiester

trong RNA

S1 nuclease là công cụ hữu hiệu để xác định các dạng

lai của nucleic acid, đánh dấu vùng DNA sợi đôi, loại vùng sợi đơn của DNA dạng so le S1 nuclease là một metalloprotein

32 kDa, phân cắt RNA hoặc DNA sợi đơn thành các 5’

mononucleotide

Ribonuclease tuỵ (RNAse A) là một endonuclease cắt

sợi đơn RNA ở nucleoside 3’-phosphate và 3’-phospho-

oligonucleotide kết thúc với Cp/Up; được sử dụng trong:

+ Giảm nhiễm RNA trong ly trích plasmid DNA

+ Lập bản đồ đột biến trong DNA/RNA bằng cách phân cắt ở

những vị trí không tương đồng

RNAse A hoạt động ở những điều kiện rất khác nhau và khó bất hoạt Tuy nhiên có thể sử dụng diethyl pyrocarbonate (DEPC), muối guanidinium, β- mercaptoethanol, kim loại nặng hay phức hợp vanadyl- ribonucleoside để ức chế hiệu quả RNAse A

Ribonuclease H (RNAse H) phân giải đặc hiệu RNA trong phức hợp lai

RNA/DNA; phân giải RNA probe của các phản ứng lai trước, loại bỏ đuôi

poly-A ở đầu 3’của mRNpoly-A

RNAse H có hoạt tính tối đa ở điều kiện pH 7,5 – 9,1 với sự có mặt của các tác nhân khử, ion Mg2+/Mn2+

Enzyme bị ức chế bởi N ethylmaleimide và ở mức

thấp hơn bởi nồng độ ion cao

Các loại ribonuclease khác (RNAse Phy I, RNAse CL3, RNAse Phy M) được sử

dụng

nhiều trong giải trình tự RNA với tính đặc hiệu và yêu cầu phân cắt đặc hiệu khác nhau

THANK YOU!