Các enzyme phát triển trong sinh học phân tử

Ligase:- Khái niệm: Enzyme Ligaza tiếng Anh: Ligase, hay còn gọi là DNA ligase là một chất xúc tác hai loại phân tử lớn trong một enzyme mới liên kết hóa học với nhau, thường liên quan đ

BÀI 4:CÁC ENZYME PHỔ BIẾN TRONG SHPT

I DNA polymerase:

- Các DNA polymerase là một enzyme chịu trách nhiệm xúc tác cho quá trình trùng hợp của chuỗi DNA mới trong quá trình sao chép phân tử này

- Chức năng chính của nó là kết hợp các triphosphate deoxyribonucleotide với các chuỗi của mẫu Nó cũng tham gia sửa chữa DNA Enzyme này cho phép kết hợp chính xác giữa các cơ

sở DNA của chuỗi khuôn và chuỗi mới, theo sơ đồ của A, nó kết hợp với T và G với C

+ Tổng hợp chuỗi polymer từ các dNTP

+ Gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn

+ Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide ngay từ đầu (de novo)

+ Xúc tác gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn

- Hầu hết các polymerase dùng trong SHPT có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc từ các virus kí sinh chúng

1) DNA polymerase ở prokaryote:

- Ở Prokaryote (sinh vật không có nhân thực sự, được phân định bởi màng) có ba loại DNA Polymerase: Pol I, Pol II, Pol III

Cả 3 loại đều có hoạt tính xúc tác kéo dài 5’3’ với tốc độ khác nhau và hoạt tính 3’5’ exonuclease

+ Pol I: còn có hoạt tính 5’3’ exonuclease Được coi là vai trò của enzyme này sao chép là chủ yếu

+ Pol II: tham gia sửa chữa DNA và hoạt động exonuclease của nó theo hướng 3’5’

+ Pol III: là phức hợp enzyme chính điều khiển quá trình tái bản

- DNA Pol I ở E coli gồm 2 phần:

+ Phân đoạn lớn là đoạn Klenow có hoạt tính 5’3’ polymerase và 3’5’ exonuclease;

+ Phân đoạn nhỏ có hoạt tính 5’3’ exonuclease

- T4 DNA polymerase ở thực khuẩn thể cần khuôn và primer để hoạt động:

+ 5’3’ polymerase khi có dNTPs

+ 3’5’ exonuclease khi không có dNTPs

+ Không có hoạt tính 5’3’ exonuclease

Có thể sử dụng T4 DNA polymerase trong kỹ thuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’ của DNA sợi đôi

- DNA polymerase T7 của thực khuẩn thể là công cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA Dạng chỉnh sửa của enzyme này có tốc độ polymer hóa trên 300 nucleotide/giây

- Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu

3’-OH của DNA và không cần khuôn mẫu

TdT được sử dụng trong dán nhãn DNA với các nucleotide đã biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer hoặc giải trình tự DNA

TdT cần DNA primer sợi đơn khi có Mg2+, nhưng có thể chấp nhận DNA sợi đôi như primer khi có CO2+

2) Polymerase bền nhiệt:

a, Bst polymerase là DNA Pol I bền nhiệt được phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothermophilus (Bst)

- Bst Pol I hoạt động tốt nhất ở 65oC, bị bất hoạt ở 75oC trên 15 phút

- Hoạt tính 5’3’ exonuclease đạt mức cao nhất khi có nồng độ Mg2+ cao

- Bst Pol I gồm 2 phân đoạn protein Phân đoạn lớn bền nhiệt và rất hữu dụng trong các phản ứng giải trình tự ở 65oC

b, Taq polymerase: được tinh sạch lần đầu tiên vào năm 1976 từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus (vi khuẩn sống ở nhiệt độ 70oC - 80oC)

Có hoạt tính tối đa đạt được ở 80 độ và cần Mg2+

Thiếu hoạt tính 3’5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai, proofreading), là enzyme có độ chính xác thấp

c, Tth polymerase: được phân lập từ Thermus thermophilus, có khối lượng 94 kDa, thiếu hoạt tính 3’5’ exonuclease

Xúc tác sao chép DNA:

+ Từ khuôn DNA với Mg2+

+ Từ khuôn RNA (phiên mã ngược) với Mn2+

3) DNA polymerase ở eukaryote:

- Eukaryote (sinh vật có nhân thực sự, được phân định bởi màng) có năm polymerase DNA Được ký hiệu bằng các chữ cái trong bảng chữ cái Hy Lạp: α, β, γ, δ, ε

- Chức năng:

Polymerase γ nằm trong ty thể và chịu trách nhiệm sao chép vật chất di truyền trong bào quan của tế bào này Ngược lại, bốn chất còn lại được tìm thấy trong nhân tế bào và tham gia vào quá trình sao chép DNA nhân

II RNA polymerase:

- RNA polymerase phụ thuộc DNA xúc tác phản ứng tổng hợp RNA từ khuôn DNA theo chiều 5’->3’

- 2 RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất trong SHPT là SP6 và T7 RNA polymerase + SP6 RNA polymerase là một chuỗi polypeptide 96 kDa tinh sạch từ Salmonella typhimurium LT2 bị xâm nhiễm bởi thực khuẩn thể SP6

+ T7 RNA pol là một chuỗi polypeptide 98 kDa sản xuất bởi thực khuẩn thể T7

- RNA polymerase được sử dụng trong tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn

- SP6 và T7 RNA polymerase đều cần Mg2+ và một khuôn DNA sợi đôi

- SP6 và T7 RNA polymerase rất đặc hiệu về promoter và sẽ phiên mã trình tự DNA được tạo dòng dưới sự kiểm soát của promoter tương ứng (SP6 và T7)

- Quá trình phiên mã của SP6 hay T7 RNA polymerase diễn ra đến hết phần đuôi poly(A) vì thế ở khuôn mẫu dạng tròn, quá trình này có thể lặp lại nhiều lần trước khi RNA polymerase tách ra

- Làm thẳng mạch khuôn trước khi dịch mã đảm bảo sự kết thúc hiệu quả quá trình phiên mã

III Ligase:

- Khái niệm: Enzyme Ligaza (tiếng Anh: Ligase, hay còn gọi là DNA ligase) là một chất xúc

tác hai loại phân tử lớn trong một enzyme mới liên kết hóa học với nhau, thường liên quan đến nhóm thủy phân của một phân tử

- DNA ligase là một enzyme quan trọng trong cơ thể sinh vật, và phản ứng do nó xúc tác đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sao chép và sửa chữa DNA

- DNA ligase được chia thành hai loại: Một là sự hình thành phụ thuộc của liên kết phosphodiester giữa hai sợi nucleotide sử dụng năng lượng của ATP xúc tác ATP là DNA ligase, và loại khác là sử dụng nicotinamide adenine dinucleotide Năng lượng của acid (NAD+) xúc tác sự hình thành của một liên kết phosphodiester giữa hai chuỗi nucleotide, là một DNA ligase phụ thuộc NAD

- DNA Ligase, còn được gọi là enzyme liên kết DNA, đóng một vai trò đặc biệt và quan trọng trong sinh học phân tử, đó là kết nối đầu 3'-OH của một bazơ trong chuỗi DNA với đầu 5'- của bazơ liền kề của nó tại P -terminus, cả hai tạo ra một liên kết phosphodiester, do đó kết nối hai bazơ liền kề Sự xúc tác của ligase đòi hỏi sự tiêu thụ ATP

- Giới thiệu:

DNA ligase, còn được gọi là enzyme liên kết DNA, đóng một vai trò đặc biệt và quan trọng trong sinh học phân tử, đó là liên kết hai đoạn DNA thành một Bất kể DNA sợi kép hay sợi đơn được liên kết, các enzyme liên kết DNA có thể kết nối đầu 3' của DNA với đầu 5 ' của DNA bằng cách hình thành một liên kết phosphate Mặc dù có các protein khác trong tế bào,

ví dụ, DNA polymerase sử dụng một sợi DNA làm khuôn mẫu để bẻ gãy một sợi DNA ở phía bên kia để tạo thành liên kết phosphodiester thông qua quá trình trùng hợp để liên kết DNA (DNA ligase nối các đoạn DNA lại với nhau để khôi phục liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide bị cắt bởi enzyme giới hạn) Tuy nhiên, quá trình kết dính của DNA polymerase chỉ

là một chức năng ngẫu nhiên của phản ứng trùng hợp, công việc thực sự của phản ứng kết dính DNA trong tế bào vẫn do enzyme kết dính DNA chi phối

- Chức năng:

Enzyme liên kết ADN là liên kết các ADN bị đứt gãy, và chỉ có phản ứng tái bản ADN và sửa chữa ADN trong tế bào mới liên quan đến việc tổng hợp các đoạn ADN đứt gãy, do đó, enzyme liên kết ADN đóng vai trò quan trọng trong hai cơ chế trên Ngoài phản ứng kết dính trong tế bào, với sự phát triển của sinh học phân tử, hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử sẽ sử dụng enzyme liên kết DNA để thực hiện thí nghiệm DNA tái tổ hợp, có lẽ đây cũng có thể được xếp vào một chức năng quan trọng khác

- Lịch sử tìm thấy:

DNA ligase lần đầu tiên được phát hiện bởi ba phòng thí nghiệm vào năm 1967 Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng DNA ligase đã được tìm thấy trong virus, vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn, cơ chế hoạt động của các loại DNA ligase khác nhau Trong những trường hợp bình thường, ligase DNA có thể được chia thành adenosine triphosphate (ATP) loại phụ thuộc và nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) loại phụ thuộc theo nguồn năng lượng cần thiết cho phản ứng xúc tác bởi DNA ligase Ligase DNA phụ thuộc có mặt rộng rãi ở eukaryote, vi khuẩn cổ, vi khuẩn và vi rút, trong khi nicotinamide

adenine dinucleotide DNA ligase phụ thuộc được phân bố trong vi khuẩn cổ, vi khuẩn và virus

- Sử dụng:

DNA ligase chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền để lắp ráp lại các đầu dính bị "cắt ra" bởi các endonucleases giới hạn, vì vậy nó còn được gọi là "khâu di truyền"

+ E coli DNA ligase được đề cập trong PEP Sinh học Trung học Tự chọn 3 có nguồn gốc từ Escherichia coli và có thể được sử dụng để kết nối các đầu dính ; ligase T4DNA, có nguồn gốc

từ thực khuẩn thể T4, có thể được sử dụng để kết nối các đầu dính và phẳng, nhưng hiệu quả thắt thấp

- Phân loại: Ligase được phân loại là EC6 trong số EC, và được chia nhỏ thành 6 loại phụ:

(1) bao gồm một ligase tạo liên kết CO

(2) bao gồm một ligase tạo thành liên kết CS

(3) bao gồm một ligase tạo thành liên kết CN

(4) bao gồm một ligase tạo thành liên kết CC

(5) bao gồm một ligase tạo liên kết phosphoester

(6) bao gồm một ligase tạo thành liên kết kim loại N

IV Phosphatase:

Alkaline phosphatase (AP) là có nhiều trong gan, thận, mật, nhau thai, xương AP được tinh sạch từ E coli hoặc các sinh vật bậc cao, được sử dụng để loại bỏ nhóm 5’-phosphate khỏi nucleic acid để ngăn chặn sự đóng vòng của DNA vector trong các thí nghiệm tạo dòng AP bị bất hoạt bởi các tác nhân tạo phức (chelating agents) như EGTA, nồng độ thấp của phosphate

vô cơ

T4 polynucleoide kinase xúc tác phản ứng chuyển một nhóm phosphate từ phân tử ATP đến đầu 5’-OH của một nucleic acid, sự trao đổi nhóm 5’-phosphate, hay phosphoryl hoá đầu 3’ của các mononucleotide

V Kinase

T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E Coli

Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E coli)

Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tới đầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate) Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA đã được phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32P] ATP.γ-32P] ATP

- Ứng dụng chính:

+ Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và Gilbert (1977), dùng làm mẫu dò trong các kỹ thuật lai phân tử

+ Phosphoryl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn DNA không có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng

Phage Viết tắt của bacteriophage (thực khuẩn thể), là loại virus xâm nhiễm và sinh sản bên trong vi khuẩn Phage thường có vỏ bọc protein, phức hợp bao gồm phần đầu có hình đa diện chứa nucleic acid và đuôi mà qua đó nucleic acid xâm nhập vào vi khuẩn chủ Sau quá trình nhân lên của nucleic acid của phage, tế bào vi khuẩn chủ thường bị tan biến Loại phage luôn luôn làm tan tế bào vi khuẩn khi chúng xâm nhiễm vi khuẩn gọi là phage độc Ví dụ: phage T4 Ngược lại, còn có phage ôn hòa, khi xâm nhiễm vi khuẩn nó gây nên phản ứng tiềm tan, nghĩa là hệ gen của phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn và được sao chép cùng với nhiễm sắc thể đó Hệ gen của phage ở trạng thái gắn như vậy với nhiễm sắc thể vi khuẩn gọi là prophage.

VI Nuclease:

1 Định nghĩa

Nuclease là thuật ngữ được sử dụng cho một loại enzyme tách nucleic acid

Chúng còn được gọi là nucleodepolymerase hoặc polynucleotide Nuclease thuộc về lớp enzyme hydrolase và thực hiện một vai trò cụ thể Các ribonuclease hoạt động trên ribonucleic acid (RNA) và deoxyribonuclease hoạt động trên axit deoxyribonucleic (DNA)

Một số enzyme có vai trò chung như phosphodiesterase, thủy phân este của axit phosphoric, cũng có thể được gọi là nuclease vì nucleic acid bị ảnh hưởng bởi hoạt động của chúng Hạt nhân có trong thực vật cũng như động vật

2 Chức năng của hạt nhân

Nuclease có vai trò cắt các liên kết phosphodiester giữa các nucleotide của axit nucleic và gây

ra sự đứt gãy sợi đơn và sợi đôi trong các phân tử mục tiêu của chúng Chúng rất cần thiết trong các sinh vật sống vì một số khía cạnh sửa chữa DNA của chúng Nếu có những khiếm khuyết trong một số nuclease nhất định, nó có thể gây suy giảm miễn dịch hoặc mất ổn định di truyền Các hạt nhân cũng đóng một vai trò quan trọng trong nhân bản phân tử

3 Các loại hạt nhân

Nuclease có thể được phân thành hai loại lớn dựa trên địa điểm hoạt động: Exonuclease và Endonuclease

Exonuclease tiêu hóa axit nucleic từ các đầu

Endonuclease hoạt động trên các vùng ở trung tâm của các phân tử mục tiêu

Các loại này có thể được phân loại thành các deoxyribonuclease và ribonuclease Các deoxyribonuclease (DNA nuclease) hoạt động trên DNA, trong khi các ribonuclease hoạt động trên RNA

3.1 Exonuclease:

Eukaryote ( sinh vật nhân thực)

Exoribonuclease là một ribonuclease exonuclease, là các enzyme thủy phân RNA bằng cách loại bỏ các nucleotide đầu cuối từ đầu 5 ‘hoặc đầu 3’ của phân tử RNA

5’-3’ Exoribonuclease (XRN-1) thủy phân RNA theo chiều 5’-3’

XRN-2 phân giải RNA dư thừa theo chiều 5’-3’

Sau khi RNA bị cắt

Prokaryote ( sinh vật nhân sơ)

Exonuclease I tách DNA sợi đơn theo chiều 3’-5’ và giải phóng deoxyribonucleoside monophosphate

Exo-III hoạt động trên DNA sợi đôi và cắt theo chiều 3’-5’

Exo-V hoặc là Rec BCD

Và 1 vài

Endonuclease

Phân cắt vùng bên trong củ phân tử :>

3.2 Micrococcal Nuclease

Nuclease vi khuẩn là một loại endonuclease chủ yếu tiêu hóa DNA hoặc RNA sợi đơn, đặc biệt ở các vùng giàu AU hoặc AT Enzyme này cũng tiêu hóa DNA hoặc RNA sợi đôi và là thành phần quan trọng của xét nghiệm ức chế miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP) Nuclease của

Micrococcal có thể tiêu hóa các liên kết 5’-phosphodiester của RNA và DNA, đồng thời tạo ra các mononucleotide và oligonucleotide 3’-phosphate Nó cần Ca 2+ làm đồng sáng lập để thực hiện chức năng của nó và bị bất hoạt hoàn toàn bởi EGTA hoặc EDTA

3.3 Mung Bean Nuclease

Mung bean nuclease là một endonuclease sợi đơn (ssDNA hoặc RNA) giúp loại bỏ phần mở rộng sợi đơn trong DNA sợi đôi Nó có thể được sử dụng để loại bỏ cả phần nhô ra của sợi đơn 3’ và 5’ khỏi DNA sợi kép để tạo ra các đầu cùn Nó tách RNA và DNA sợi đơn, tách vùng sợi đơn trong kẹp tóc DNA và giúp lập bản đồ các bản phiên mã RNA

3.4 Deoxyribonuclease ( viết tắt là DNase )

Dùng để chỉ một nhóm glycoprotein endonuclease là các enzym xúc tác quá trình phân cắt thủy phân của các liên kết phosphodiester trong xương sống DNA , do đó làm thoái hóa DNA Vai trò của enzyme DNase trong các tế bào bao gồm phá vỡ DNA ngoại bào (ecDNA) được bài tiết bởi quá trình chết theo chương trình , hoại tử và bẫy ngoại bào bạch cầu trung tính (NET) của các tế bào để giúp giảm các phản ứng viêm mà nếu không sẽ gây ra Nhiều loại deoxyribonuclease đã được biết đến và thuộc một trong hai họ( DNase Ihoặc DNase II), khác nhau về đặc tính cơ chất , cơ chế hóa học và chức năng sinh học của chúng Các ứng dụng trong phòng thí nghiệm của DNase bao gồm các protein tinh khiết khi được chiết xuất từ các sinh vật nhân sơ

Dnase I (Deoxyribonuclease I)

Là một glycoprotein 31 kDa

thường ở dạng hỗn hợp gồm 4 isoenzyme (A, B, C, D)

Bị bất hoạt ở 75oC trong 5’ với EGTA 5 mM Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt ở vị trí 3’ của pyrimidine

Là một endonuclease thuộc họ DNase được mã hóa bởi gen người DNASE1 DNase I là một nuclease tách DNA tốt hơn ở các liên kết phosphodiester liền kề với một nucleotide pyrimidine, tạo ra các polynucleotide kết thúc 5'-phosphate với một nhóm hydroxyl tự do ở vị trí 3', trung bình tạo ra các tetranucleotide Nó hoạt động trên DNA sợi đơn, DNA sợi kép và chất nhiễm sắc Ngoài vai trò là một endonuclease quản lý chất thải , nó còn được đề xuất là một trong những deoxyribonucleasechịu trách nhiệm cho sự phân mảnh DNA trong quá trình chết rụng tế bào DNase I liên kết với actin protein tế bào Nó liên kết các monome actin có

ái lực rất cao (dưới nanomol) và các polyme actin có ái lực thấp hơn Chức năng của sự tương tác này là không rõ ràng Tuy nhiên, do DNase I gắn với actin không hoạt động về mặt enzyme, nên phức hợp DNase-actin có thể là một dạng lưu trữ của DNase I để ngăn chặn sự phá hủy thông tin di truyền Protein này được lưu trữ trong các hạt zymogen của vỏ hạt nhân

và hoạt động bằng cách tách DNA theo cách phân giải nội nhân

Dnase II (Deoxyribonuclease II)

Là một endonuclease thủy phân các liên kết phosphodiester của deoxyribonucleotide trong DNA tự nhiên và DNA biến tính, tạo ra các sản phẩm có 3 '-photphat và đầu 5'-hydroxyl, xảy

ra do cơ chế phân cắt sợi đơn Đúng như tên gọi, nó hoạt động tối ưu ở pH axit vì nó thường được tìm thấy trong môi trường pH thấp của lysosome