Báo cáo thực tập sinh học phân tử K20 (NLU)

Báo cáo thực tập sinh học phân tử k20. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.Báo cáo thực tập sinh học phân tử k20. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.Báo cáo thực tập sinh học phân tử k20. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Môn học : Thực hành Sinh học Phân tử

Giáo viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết

Sinh viên thực hiện : Ca 3 thứ 3

Nguyễn Xuân Hồng 20126251

Võ Sông Hương 20126254 Nguyễn Thị Trúc Mai 20126302

Lý Thị Hằng 20126239

Tháng 07 năm 2022

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1 Giới thiệu

Vào ngày 25 tháng 4 năm 1953, James Watson và Francis Crick đã mô tả đặc tính DNA với một bài báo trên tạp chí Nature Khám phá của họ đã đánh dấu một bước phát triển đỉnh cao của cả một thập kỷ nghiên cứu căng thẳng sau sự chứng minh của Oswald T Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty rằng DNA là phân tử di truyền, không phải protein như người ta vẫn nghĩ trước đây

DNA mang thông tin di truyền, bảo quản, bảo tồn thông tin di truyền và biến đổi tạo nền tảng cho sự tiến hóa DNA được phiên mã thành mRNA và sau đó dịch mã thành một chuỗi các axit amin quyết định cấu trúc ba chiều của protein, từ đó quyết định chức năng sinh học của bản thân DNA Do đó, DNA cung cấp các chỉ dẫn để duy trì chức năng sinh học và được coi là bản thiết kế của sự sống Với những chức năng quan trọng đó, nhà khoa học đã phát minh phương pháp ly trích DNA nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiến bộ trong kiến thức về bộ gen người và đóng một vai trò quan trọng trong sự ra đời của nhiều lĩnh vực khác nhau trong khoa học như chỉnh sửa gen và y học cá nhân hóa

Ly trích acid nucleic là điểm khởi đầu trong bất kỳ nghiên cứu sinh học phân tử do đó được coi là một quá trình quan trọng Việc tách chiết DNA thô đầu tiên đã được thực hiện bởi bác sĩ người Thụy Sĩ Friedrich Miescher vào năm 1869 Ông đã vô tình tinh chế DNA

từ nhân trong khi điều tra protein từ bạch cầu và nhận thấy rằng tính chất của chất này về

cơ bản khác với protein, từ đó ông đặt ra thuật ngữ “ nuclein ” DNA có thể được chiết xuất

từ các nguồn đa dạng như các mẫu lâm sàng như kim nhỏ hút dịch cơ thể và mẫu sinh thiết; các mẫu pháp y như vết máu khô, gạc và dấu vân tay; đến đất, mô thực vật và động vật, côn trùng, động vật nguyên sinh, vi khuẩn và nấm men

DNA được phân lập từ các mẫu sinh học khác nhau được sử dụng để xác định trình

tự DNA, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), PCR định lượng (qPCR), thấm phương nam, khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (RAPD), chuẩn bị cho thư viện bộ gen cũng như đa hình độ dài đoạn khuếch đại (AFLP), đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP), đa hình lặp lại song song ngắn (STRP), đa hình nucleotide đơn (SNP) và số lượng biến ứng dụng lặp lại song song (VNTR)

Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng trên dùng làm cơ sở để chẩn đoán các bệnh di truyền hoặc xác định tình trạng người mang gen, liệu pháp gen, dược lý học để dự đoán hiệu quả của thuốc hoặc phản ứng có hại của thuốc bằng cách sử dụng công nghệ DNA tái

tổ hợp để tạo ra các sản phẩm dược phẩm như hormone và vaccine cũng như xét nghiệm di truyền dự đoán để đánh giá nguy cơ và sử dụng các chiến lược sàng lọc và phòng ngừa sớm Ví dụ, phát hiện sớm các đột biến trong gen sinh ung thư RET và can thiệp trước triệu chứng được sử dụng để ngăn ngừa sự phát triển của đa dạng tân sinh nội tiết loại 2 Trong

vi sinh vật học, phân tích axit nucleic có thể được sử dụng để nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh loài và giúp xác định các đột biến làm phát sinh kháng kháng sinh

2 Mục tiêu

Cung cấp kỹ năng sử dụng và vận hành một số thiết bị thông dụng dùng trong ly trích DNA, chuẩn bị các dung dịch hoá chất Ly trích, tách chiết được DNA tổng số và DNA plasmid, định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) và điện di trên gel agarose nhằm phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong sinh học phân tử

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI KIỆU

1 Giới thiệu về trang thiết bị trong phòng thí nghiệm

1.1 Máy lắc ổn nhiệt (incubator shaker)

Được sử dụng cho các phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng enzyme, tăng sinh vi sinh vật) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc nhằm

vi khuẩn có thể tương tác với Oxy

1.2 Tủ hút khí độc (fume hood)

Dùng chuẩn bị hay thực hiện thí nghiệm sử dụng các hóa chất bay hơi độc, có mùi khó chịu như phenol, chloroform, β-mercaptoethanol…

1.3 Tủ cấy vô trùng (laminar flow hood)

Sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vô trùng như tách chiết, pha hóa chất…Tủ phải luôn giữ sạch, bề mặt thí nghiệm được khử trùng bằng cồn Trước và sau khi sử dụng phải thanh trùng bên trong tủ bằng cách bật đèn UV trong ít nhất 15 phút

1.4 Máy vortex

Tạo rung để giúp làm đồng nhất hóa mẫu hoặc dung dịch một cách nhanh chóng

1.5 Tủ lạnh

Tủ mát (4°C) hoặc tủ lạnh sâu (-20°C), Tủ âm sâu (-80°C) dùng để giữ các sinh phẩm, hóa chất và mẫu thí nghiệm cần giữ ở nhiệt độ thấp Đối với mẫu, hóa chất bảo quản ở tủ lạnh sâu cần xử lí đúng cách và chọn vật chứa phù hợp trước khi bảo quản

1.6 Nồi hấp tự động (autoclave)

Dùng để hấp khử trùng các dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Lưu ý khi sử dụng:

- Khi hấp phải bỏ nước

- Khi hấp phải liên tục canh nhiệt độ và áp suất để tránh sự cố áp suất quá mức gây cháy nổ

- Nồi hấp rất nóng và nguy hiểm, nên có phòng riêng để đặt nồi hấp

1.7 Máy ly tâm

Dùng để phân tách và thu nhận các phần tử trong một dung dịch dựa vào kích thước, hình dạng và tỷ trọng, độ nhớt của dung dịch và tốc độ rotor

Chú ý:

- Khi ly tâm phải để các tube đối xứng nhau và cần bằng về momen trên rotor đối với số tube là số chẵn, nếu số tube lẻ phải thêm một tube cùng loại và thêm vào thể tích nước bằng với thể tích của các tube kia rồi thực hiện ly tâm

- Cần lưu ý ba thông số: thời gian ly tâm, tốc độ ly tâm và nhiệt độ khi ly tâm

1.8 Bồn ủ nhiệt (waterbath)

Bồn ủ nhiệt hay còn gọi là bể điều hòa nhiệt, bể ổn định nhiệt độ Chúng được coi là loại thiết bị chuyên dụng dùng trong các phòng thí nghiệm

1.9 Máy khuấy từ (magnetic stirrer)

Máy khuấy từ là một loại thiết bị trong phòng thí nghiệm, sử dụng lực từ trường để khuấy các dung dịch

1.10 Cân kỹ thuật (bechtop/balance)

Là loại cân rất quan trọng và cần thiết, có công dụng giúp người thực hiện nhanh chóng đo đạc được trọng lượng của những vật có kích thước nhỏ

Nguyên tắc cân: Kiểm tra giọt nước trước khi cân Nếu lỡ cân bị dư thì phải bỏ phần

đó đi và cân lại từ đâu Phải để ý giá trị max của cân, nếu cân vật quá mức max sẽ làm hư cân

1.11 Máy luân nhiệt (Thermocycler)

Là thiết bị giúp thay đổi nhiệt độ của hỗn hợp dung dịch phản ứng PCR một cách tự động theo chương trình cài đặt trước của người sử dụng

Hiệu chỉnh thiết bị kỹ thuật (Calibration): Là quá trình xác định độ chính xác của thiết

bị thường bao gồm so sánh kết quả nhận được từ thiết bị đạt chuẩn và điều chỉnh thiê bị nhằm tăng độ chính xác và chuẩn mực của kết quả

1.12 Dụng cụ dùng trong thí nghiệm

Các dụng cụ thủy tinh thông thường như becher, ống nghiệm, pipette, đĩa petri, ống đong, erlen

Tube: bằng nhựa polyethylen hay polypropylen chịu được nhiệt độ khử trùng (1 atm, 121°C, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20°C) và một số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2 ml; 0,5ml; 2ml

Micropipette (pipetman): dùng hút dung dịch thể tích nhỏ, độ chính xác cao Lưu ý khi sử dụng:

− Không để pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hóa chất

− Không để gần nguồn điện (đèn cồn, )

− Tuyết đối không điều chỉnh dưới ngưỡng thể tích tối thiểu và trên ngưỡng thể tích tối đa

− Khi sử dụng xong phải điều chỉnh pipette thể tích về tối đa

Các đầu tip (cone): Các micropipette luôn sử dụng các đầu tip Các đầu tip này thường

sử dụng một lần và có nhiều loại tương ứng với nhiều loại micropipette khác nhau Các đầu tip này được hấp khử trùng ở điều kiện thông thường

2 DNA tổng số của thực vật Ageratum conyzoides

DNA có cấu trúc dạng sợi đôi với xương sống sugar-phosphate, đường deoxyribose

và base nitrit và liên kết với protein histon DNA tổng số là phân tử có kích thước lớn, do

đó trong quá trình thao tác cần tránh những tác nhân cơ học hay hoá học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này

Quá trình tách chiết DNA gồm các bước cơ bản như sau:

− Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA

− Loại bỏ các thành phần không mong muốn

− Thu hồi DNA

3 DNA plasmid vi khuẩn E.coli

Plasmid là những phân tử DNA mạch kép dạng vòng nằm ngoài thể nhiễm sắc, có kích thước rất nhỏ, có khả năng tự nhân lên độc lập với tế bào và được phân sang các tế bào con khi nhân lên cùng với tế bào Hình thái giữa DNA plasmid – các phân tử DNA có kích thước nhỏ, ở trạng thái siêu xoắn, và DNA nhiễm sắc thể có sự khác biệt Sự khác biệt này giúp phân biệt giữa kết tủa DNA nhiễm sắc thể, protein tế bào với plasmid và các phân tử RNA Từ đó người ta nghiên cứu được phương pháp ly trích DNA plasmid từ huyền phù tế bào vi khuẩn và ly trích kiềm tính phát triển bởi Birnboim và Doly (1979)

CHƯƠNG 3 LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT

1 Vật liệu nghiên cứu

1.1 Đối tượng nghiên cứu

DNA tổng số của thực vật Ageratum conyzoides

1.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Tube 1,5 mL; bình tam giác; Micropipette

Thiết bị:Máy ly tâm, máy votex, bồn ủ, thiết bị điện di

1.3 Hóa chất

1.3.1 Dung dịch đồng nhất mẫu (Homogenization Buffer) gồm:

- Tris 200 mM (pH 8,0): là chất đệm pH giúp ổn định pH = 8

- EDTA 25 mM:có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNA polymerase, bảo vệ DNA

- NaCl 250 mM: Cân bằng ion muối trong và ngoài môi trường

- SDS 0,5%:là chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ màng tế bào, quá trình ly trích diễn ra dễ dàng hơn

1.3.2 Hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, v:v:v) 25:24:1

- Phenol: làm biến tính protein

- Chloroform:không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế bào sẽ làm cho dịch này phân thành 2 lớp Hỗn hợp ly tâm để phân tách lớp, protein

bị kết tủa sẽ nằm ở pha giữa Hoạt động yếu hơn Phenol

- Isoamyl alcohol: là 1 ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( NA+, K+,

NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA

1.3.3 Ethanol 99° hoặc isopropanol: có tác dụng loại bỏ một số muối lẫn tạp trong

dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA và 10% phenol còn sót lại trong hỗn hợp

DNA

2 Phương pháp thực hiện

Phương pháp ly trích DNA bằng dịch trích SDS Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng trong các ống Ependorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA

3 Quy trình ly trích DNA tổng số bằng SDS

Bước 1: Phá vỡ tế bào

+ Thêm 600 μL dung dịch đồng nhất mẫu vào 0,05g mẫu

+ Nghiền nát mẫu

+ Ly tâm 10.000 rpm – 5 phút khi đó DNA tan nên lơ lửng trong dung dịch

+ Lấy 1 tube, hút 400 μL qua tube

Bước 2: Làm sạch DNA

+ Bổ sung vào tube 400 μL PCI và lắc nhẹ 1 phút, ly tâm với vận tốc 12.000 rpm – 2 phút

+ Hút dịch nổi cho vào ống tube mới, bổ sung 300 μL CI vào, lắc nhẹ, ly tâm 12.000 rpm – 2 phút, hút dịch nổi chuyển qua tube mới

Bước 3: Kết tủa và thu hồi DNA

+ Thêm 120 μL isopropanol, ủ ở (-20°C) – 15 phút Ly tâm 12.000 rpm – 10 phút + Thêm 500 μL ethanol 70°, ly tâm 12.000 rpm – 3 phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Lặp lại 2 lần

+ Phơi tube ở nhiệt độ phòng

Bước 4: Bảo quản DNA vừa tách chiết

Thêm vào kết tủa DNA 50 μL nước khử ion hấp khử trùng (không chứa DNase) hoặc

50 μL TE 0,5X, vortex nhẹ và bảo quản ở 4°C hoặc -20°C

4 Kết quả và thảo luận

Đem mẫu vừa ly trích đi điện di thu được kết quả ở giếng như hình 4.1

Hình 4.1 Điện di ly trích DNA tổng số của thực vật bằng dịch trích SDS

Ở giếng trong hình, ly trích DNA tổng số thành công, có thể chấp nhận được, mẫu có DNA, băng vạch gọn nhỏ, có DNA bị đứt gãy, lượng DNA thu được nhiều nên vạch sáng

rõ, DNA tương đối tinh sạch

CHƯƠNG 4 LY TRÍCH DNA PLASMID VI KHUẨN

1 Vật liệu nghiên cứu

1.1 Đối tượng nghiên cứu

DNA plasmid của vi khuẩn E.coli

1.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Tube 1,5 mL, bình tam giác

Thiết bị: Máy ly tâm, máy vortex, bồn ủ và thiết bị điện di

1.3 Hoá chất

1.3.1 Dung dịch I

- Glucose (lọc khử trùng) 50 mM: Cân bằng áp suất thẩm thấu

- Tris-HCl (pH 8.0) 25 mM: Giúp pH không bị thay đổi đột ngột gây hư mẫu

- EDTA (pH 8.0) 10 mM: Hấp thị ion để bảo vệ DNA plasmid

1.3.2 Dung dịch II

- NaOH 0,2 N: Tạo môi trường kiềm

- SDS 1%: làm biến tính protein, sau đó SDS liên kết với protein chìm xuống đáy tube Đồng thời SDS cũng phá vỡ tế bào

1.3.3 Dung dịch III

- Potassium acetate (Kali acetate) 5M: khi cho vào SDS thay bằng K chuyển thành PDS Tác dụng trung hoà dung dịch kiềm, plasmid hồi tính, PDS và protein chìm xuống đáy

- Glacial acetic acid: tồn tại dưới dạng tinh thể băng

1.3.4 Isopropanol: có tác dụng loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch mà

chúng kết tủa theo DNA và 10% phenol còn sót lại trong hỗn hợp DNA

2 Phương pháp thực hiện

Phương pháp ly trích kiềm tính phát triển bởi Birnboim và Doly (1979) Ở điều kiện kiềm, các tế bào được phân giải, cả nucleic acid và protein đều bị biến tính Khi dung dịch được trung hòa bởi Kali Acetate (CH3COOK), DNA nhiễm sắc thể và protein kết tủa vì các phân tử này không thể phục hồi lại cấu trúc ban đầu (do kích thước lớn) Các plasmid hồi tính ổn định và tồn tại trong dung dịch, tách hẳn ra khỏi DNA nhiễm sắc thể và protein

Vi khuẩn E.coli mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1% ) ở 37 C, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau

16 giờ nuôi cấy (nuôi qua đêm) được sử dụng để ly trích plasmid

3 Quy trình ly trích DNA plasmid vi khuẩn

Bước 1: Lấy 1 mL dịch khuẩn cho vào tube 1,5 mL Ly tâm dịch khuẩn ở tốc độ 5.000 rpm

– 2 phút Loại bỏ dịch nổi Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa Lặp lại lần nữa để tặng lượng vi sinh

Bước 2: Thêm 100 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ

Bước 3: Thêm 200 μL dung dịch II Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Không vortex ở bước

này Giữ tube trên đá

Bước 4: Thêm 150 μL dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Giữ

tube trên đá khoảng 1 phút

Bước 5: Ly tâm ở 12.000 rpm – 10 phút Chuyển dịch nổi sang tube mới (1V)

Bước 6: Thêm 0,6V isopropanol, vortex nhẹ; để yên trong 20 phút ở -20°C

Bước 7: Ly tâm 12.000 rpm – 10 phút để thu kết tủa DNA Loại dịch nổi phía trên Thêm

500 μL ethanol 70%, ly tâm 12.000 rpm – 3 phút Loại bỏ dịch nổi và phơi ống cho đến khi không còn dung dịch nào bên trong ống

Bước 8: Thêm 50 μL nước khử ion (không chứa Dnase) hoặc TE Vortex nhẹ và bảo quản

ở -20°C

4 Kết quả và thảo luận

Đem mẫu vừa ly trích đi điện di thu được kết quả ở giếng như hình 4.2

Hình 4.2 Điện di ly trích DNA plasmid vi khuẩn E.coli

Ở giếng này, , ly trích DNA plasmid không thành công, mẫu có DNA, DNA bị đứt gãy nhiều và nhiễm RNA, có các tạp chất dính tại miệng giếng, DNA có kích thước trong khoảng 6000-8000 bp

5 Kiến nghị

Đối với DNA plasmid bị tạp nhiễm ở trên, nguyên nhân là do trong quá trình thực hiện thao tác thí nghiệm không đúng, tay nghề còn kém Nên muốn DNA được tinh sạch thì cần lưu ý: trong quá trình thực hiện thao tác cần chú ý cẩn thận tránh làm vỡ mẫu, không

để mẫu bị nhiễm bẩn, chú ý hóa chất được sử dụng, nâng cao trình độ tay nghề