Tài liệu thực hành thực hành sinh học phân tử 2019

GIỚI THIỆU MÔN HỌC VÀ YÊU CẦU CỦA MÔN HỌC Giới thiệu Phần thực hành môn Sinh học phân tử giúp sinh viên vận dụng kiến thức lí thuyết của môn học vào quá trình thực hiện thí nghiệm sử d

Năm 2019

TÀI LIỆU THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ

Người biên soạn ThS Tôn Bảo Linh

KS Nguyễn Phan Thành

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIỚI THIỆU MÔN HỌC VÀ YÊU CẦU CỦA MÔN HỌC

Giới thiệu

Phần thực hành môn Sinh học phân tử giúp sinh viên vận dụng kiến thức lí thuyết của môn học vào quá trình thực hiện thí nghiệm sử dụng các kỹ thuật phân tử Môn học cung cấp cho sinh viên kiến thức và kỹ năng cơ bản trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, gồm kỹ năng sử dụng

và vận hành một số thiết bị thông dụng, chuẩn bị các dung dịch hóa chất, tách chiết nucleic acid, định lượng nucleic acid, điện di trên gel agarose và kỹ thuật PCR cơ bản Bên cạnh đó, môn học sẽ trang bị cho sinh viên kỹ năng viết báo cáo và trình bày kết quả thực hành, kiến thức và kỹ năng đảm bảo an toàn trong phòng thí thiệm

Sau khi kết thúc môn học, sinh viên cần phải đạt các yêu cầu về kiến thức và kỹ năng như sau:

- Có khả năng đọc, hiểu và vận dụng các tài liệu kỹ thuật liên quan; có khả năng vận hành

an toàn các thiết bị cơ bản trong phòng thí nghiệm sinh học

- Biết cách tính nồng độ và pha các dung dịch hóa chất liên quan đến kỹ thuật phân tử

- Có thể giải thích, mô tả các bước chính và thực hiện quy trình tách chiết DNA tổng số và DNA plasmid, định lượng và tinh sạch nucleic acid

- Có thể giải thích nguyên tắc, mô tả các bước chính, cách chuẩn bị vật liệu và thực hiện kỹ thuật điện di DNA

- Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm sử dụng phương pháp PCR

- Có khả năng viết báo cáo kết quả thí nghiệm

Yêu cầu môn học

- Sinh viên có mặt đầy đủ các buổi thực hành

- Thực hiện đầy đủ các bài tập cá nhân và bài tập nhóm

Bài 1 GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ, THAO TÁC CƠ BẢN

PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ PHẦN I GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ

1 Máy lắc ổn nhiệt (incubator shaker)

Được sử dụng cho các phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng enzyme, tăng sinh vi sinh vật) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc

2 Tủ hút khí độc (fume hood)

Dùng chuẩn bị hay thực hiện thí nghiệm sử dụng các hóa chất bay hơi độc, có mùi khó chịu như phenol, chloroform, β-mercaptoethanol…

3 Tủ cấy vô trùng (laminar flow hood):

Sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vô trùng như tách chiết, pha hóa chất… Tủ phải luôn giữ sạch, bề mặt thí nghiệm được khử trùng bằng cồn Trước và sau khi sử dụng phải thanh trùng bên trong tủ bằng cách bật đèn UV trong ít nhất 15 phút

4 Máy vortex: giúp làm đồng nhất hóa mẫu hoặc dung dịch một cách nhanh chóng

6 Nồi hấp tự động (autoclave)

Dùng để hấp khử trùng các dụng cụ và hoá chất thí nghiệm

http://www.amerexinst.com/autoclaves.html

7 Máy ly tâm (centrifuge)

Dùng để phân tách và thu nhận các phần tử trong một dung dịch dựa vào kích thước, hình dạng và tỉ trọng, độ nhớt của dung dịch và tốc độ rotor (Xem phụ lục)

(www.thermofisher.com/)

Chú ý: khi ly tâm phải để các tube đối xứng nhau trên roto đối với số tube là số chẳn, nếu số tube lẻ phải thêm một tube cùng loại và thêm vào thể tích nước bằng với thể tích của các tube kia rồi thực hiện ly tâm

8 Bồn ủ nhiệt (waterbath)

9 Máy khuấy từ (magnetic stirrer)

Bồn ủ nhiệt Memmert và các phụ kiện

10 Cân kỹ thuật (bechtop scale/balance)

11 Máy luân nhiệt (Thermocycler): là thiết bị giúp thay đổi nhiệt độ của hỗn hợp dung dịch phản ứng PCR một cách tự động theo chương trình cài đặt trước của người sử dụng

Máy luân nhiệt Eppendorf

Hiệu chỉnh thiết bị kỹ thuật (Calibration)

Hiệu chỉnh thiết bị là quá trình xác định độ chính xác của thiết bị thường bao gồm so sánh kết quả nhận được từ thiết bị đang sử dụng với kết quả từ thiết bị đạt chuẩn và điều chỉnh thiết bị nhằm tăng độ chính xác và chuẩn mực của kết quả

Bảng 1 Các thiết bị thường sử dụng ở phòng thí nghiệm sinh học phân tử cần

hiệu chỉnh

12 Dụng cụ dùng trong thí nghiệm

- Các dụng cụ thủy tinh thông dụng như becher, ống nghiệm, pipette, đĩa petri, ống đong, erlen

- Tube: bằng nhựa polyethylen hay polypropylen chịu được nhiệt độ khử trùng (1atm,

121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) và một số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0,2 mL; 0,5 mL; 1,5 mL; 2mL

- Micropipette (pipetman): dùng hút dung dịch thể tích nhỏ, độ chính xác cao

Lưu ý khi sử dụng:

 Không để pipette tiếp xúc trực tiếp với dung môi hữu cơ, hoá chất

 Không để gần nguồn nhiệt (đèn cồn, …)

 Tuyệt đối không điều chỉnh dưới ngưỡng thể tích tối thiểu và trên ngưỡng thể tích tối đa

 Khi sử dụng xong phải điều chỉnh pipette về thể tích tối đa

Cửa sổ hiển thị giá trị thể tích

Giá trị ngưỡng

Piston

Cán để tay

Đầu gắn tip

Cần gạt đầu tip Điều chỉnh thể tích

Ống hút

- Các đầu tip (cone): Các micropipette luôn sử dụng các đầu tip Các đầu tip này thường chỉ được sử dụng một lần và có nhiều loại tương ứng với nhiều loại micropipette khác nhau Các đầu tip này được hấp khử trùng ở điều kiện thông thường

Các loại tip thông dụng

Phần II CHUẨN BỊ HÓA CHẤT

II.1 Một số nguyên tắc pha hóa chất

 Kiểm tra dung môi hòa tan hóa chất Hóa chất thường được pha với nước cất hai lần và khử trùng ở điều kiện thông thường

 Đối với một số hóa chất không thể hấp khử trùng, sử dụng đầu lọc có đường kính lỗ lọc là 0,2 µm hoặc 0,45 µm để thanh trùng

 Khi đong, cân hóa chất tuyệt đối không đổ hoá chất thừa trở lại bình chứa ban đầu

II.2 Tính toán các hóa chất

a Nồng độ Mol: nồng độ phân tử gram theo thể tích hay số mol chất tan trong một lít dung dịch Được dùng để biểu thị nồng độ mol của một dung dịch

Ví dụ: để pha chế 100 mL dung dịch 5M NaCl (58,456 g/mol) cần

5 mol/lít x 58,456 g/mol x 0,1 lít = 29,29 g NaCl trong 100 ml dung dịch

b Phần trăm

- Phần trăm (w/v): số gram trong 100 ml dung dịch

- Phần trăm (v/v): thể tích (ml) trong 100 ml dung dịch

VD: để chuẩn bị dung dịch 0,7% agarose trong TBE buffer, cân 0,7 gram agarose và thêm dung dịch TBE đến 100 mL

c Dung dịch đậm đặc: vài dung dịch đệm của enzyme được chuẩn bị dưới dạng dung dịch đậm đặc như 5X hoặc 10X (đậm đặc gấp 5 đến 10 lần dung dịch sử dụng), sau

II.3 Chuẩn bị dung dịch làm việc (working solutions) từ dung dịch gốc (concentrated stock solutions)

Một vài dung dịch đệm được sử dụng trong các thí nghiệm với cùng thành phần có trong dung dịch đó nhưng với những nồng độ khác nhau, cần phải chuẩn bị những dung dịch đậm đặc (stock solutions) ban đầu để có thể pha loãng khi cần

Để chuẩn bị 100 mL buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM) bao gồm 1 mL Tris 1M và 0,2

mL EDTA 0,5M và 98,8 mL nước cất

Công thức tính toán như sau: C1 x V1 = C2 x V2

C1 : nồng độ ban đầu ( hoặc nồng độ của dung dịch gốc) V1 : thể tích cần lấy từ dung dịch nồng độ C1

C2 : nồng độ cần chuẩn bị V2 : thể tích dung dịch nồng độ C2 cần chuẩn bị

3.3.4 Một số phương pháp cơ bản bảo quản hóa chất

 Các dung dịch thường được pha và bảo quản dưới dạng đậm đặc (dung dịch mẹ) Dung dịch stock được pha loãng với nước cất hai lần đã khử trùng để đạt nồng độ cần cho mỗi lần sử dụng

 Dung dịch đã sử dụng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, ở nhiệt độ 4 oC hoặc nhiệt độ lạnh sâu -20 oC theo khuyến cáo cho từng loại hóa chất Dung dịch bảo quản ở -20 oC thường được phân thành những phần nhỏ, mỗi lần sử dụng chỉ cần giải đông một phần

4 Thực hành

- Sinh viên quan sát các thiết bị, dụng cụ, cách vận hành, thực tập với micropipette

- Chú ý đến các đơn vị đo lường: thể tích, nồng độ và cách pha một số dung dịch gốc như EDTA 0,5M; NaCl 3M; TE 5X; TBE 10X, dung dịch li trích DNA, tính lượng hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR

5 Kết quả đạt được

- Sinh viên biết vận hành các thiết bị và sử dụng micropipette thuần thục

- Sinh viên biết cách tính toán và pha các hóa chất, dung dịch thông dụng

Bài 2 LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ THỰC VẬT

1 Mục đích: Giúp sinh viên hiểu phương pháp tách chiết DNA thực vật

2 Yêu cầu: Sinh viên nắm vững và thực hiện được các bước tách chiết DNA theo phương pháp dùng dịch trích SDS

3 Nội dung

3.1 Giới thiệu

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh những tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này Quá trình tách chiết DNA gồm các bước cơ bản như sau:

 Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA

 Loại bỏ các thành phần không mong muốn

 Thu hồi DNA

- Bước 1: Nghiền mẫu trong tube 1,5 mL có chứa 400 µL dịch đồng nhất mẫu

- Bước 2: Bổ sung vào tube 500 µL PCI và lắc nhẹ 1 phút, li tâm với vận tốc 10.000 rpm trong 5 phút, sau đó hút dịch nổi cho vào ống tube mới

- Bước 3: Bổ sung 400 µL chloroform vào, lắc nhẹ 3 phút, li tâm 10.000 rpm/5 phút, hút dịch nổi chuyển qua tube mới

- Bước 4: Thêm 600 µL ethanol 99o, lắc nhẹ 2 phút Ủ ở -20 oC trong 30 phút Sau đó

li tâm 12.000 rpm/5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Phơi tube ở nhiệt độ phòng

- Bước 5: Thêm vào kết tủa DNA 30 µL nước khử ion hấp khử trùng (không chứa DNase) hoặc 30 µL TE 0,5X, vortex nhẹ và bảo quản ở 4 oC hoặc -20 oC

3.4 Ly trích DNA plasmid vi khuẩn

Giới thiệu

Qui trình ly trích plasmid này được dùng để ly trích DNA plasmid từ huyền phù tế bào

vi khuẩn và dựa trên qui trích ly trích kiềm tính phát triển bởi Birnboim và Doly (1979) Qui trình ly trích dựa trên sự khác biệt về hình thái giữa DNA plasmid – các phân tử DNA

có kích thước nhỏ, ở trạng thái siêu xoắn, và DNA nhiễm sắc thể Sự khác biệt này giúp phân biệt giữa kết tủa DNA nhiễm sắc thể, protein tế bào với plasmid và các phân tử RNA

Ở điều kiện kiềm, các tế bào được phân giải, cả nucleic acid và protein đều bị biến tính

protein kết tủa vì các phân tử này không thể phục hồi lại cấu trúc ban đầu (do kích thước lớn) Các plasmid hồi tính ổn định và tồn tại trong dung dịch, tách hẳn ra khỏi DNA nhiễm sắc thể và protein

Vật liệu – Thiết bị - Hóa Chất

Nước (khử ion, tiệt trùng)

 Dung dịch I (bảo quản 4 oC)

 Dung dịch III (bảo quản ở 4 oC)

5M potassium acetate (Kali acetate)

Glacial acetic acid

Qui trình ly trích DNA plasmid (Birnboim và Doly, 1979)

Vi khuẩn E.coli mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1%) ở 37 oC, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau

16 giờ nuôi cấy (nuôi qua đêm) được sử dụng để ly trích plasmid theo qui trình gồm các bước như sau:

1 Lấy 1 mL dịch khuẩn cho vào tube 1,5 mL

2 Ly tâm dịch khuẩn ở tốc độ 5.000 rpm trong 2 phút

3 Loại bỏ dịch nổi Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa

4 Lặp lại bước 1, 2, 3

5 Thêm 100 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ

6 Thêm 200 μL dung dịch II Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Không vortex ở bước này Giữ tube trên đá

7 Thêm 150 μL dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Giữ tube trên đá khoảng 1 phút

8 Ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút Chuyển dịch nổi sang tube mới (1V)

9 Thêm 2V isopropanol, vortex nhẹ; để yên trong 20 phút ở -20 oC

10 Ly tâm 10.000 rpm/ 5 phút để thu kết tủa DNA Loại dịch nổi phía trên Thêm 500 μL ethanol 70%, ly tâm 10.000 rpm/5 phút Loại bỏ dịch nổi và phơi ống cho đến khi không còn dung dịch nào bên trong ống

11 Thêm 30 μL nước khử ion (không chứa Dnase) hoặc TE Vortex nhẹ và bảo quản ở

-20oC

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG

1 Mục đích: Giúp sinh viên hiểu cách định lượng nucleic acid bằng phương pháp đo mật

độ quang (optical density, OD)

2 Yêu cầu: Sinh viên xác định giá trị OD và tính nồng độ của mẫu DNA

3 Nội dung

3.1 Nguyên tắc

Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng của các phân tử vật chất trong môi trường lỏng người ta có thể tính được nồng độ của chúng Mỗi phân tử có một đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng

Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các proton với các electron của vòng purin và pyrimidin Đỉnh hấp thụ của nucleic acid là 260 nm trong vùng tử ngoại Sự hấp thụ được tính bằng giá trị OD (Optical Density) Một đơn vị OD ở bước sóng 260 nm tương ứng với:

- 50 µg/mL DNA sợi đôi

- 40 µg/mL DNA sợi đơn hay RNA

- 20 µg/mL oligonucleotide sợi đơn

Công thức tính hàm lượng DNA:

Hàm lượng DNA sợi đôi (µg/mL) = OD 260 * Độ pha loãng * 50 µg/mL

Tổng lượng DNA (µg) = Hàm lượng DNA* thể tích dung dịch DNA

Từ giá trị OD đo được, ta suy ra được nồng độ acid nucleic trong dung dịch Dung dịch acid nucleic được xem là sạch khi tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8-2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ này sẽ thấp hơn; sự hiện diện của guanidine sẽ làm tăng giá trị OD260 Đối với cả hai trường hợp tạp nhiễm nêu trên, giá trị OD320 nm được sử dụng trong công thức tính hàm lượng nucleic acid (xem Phụ lục 6)

3.2.Phương pháp

- Đo OD260 của dung dịch DNA mẫu

- Đo OD280 của dung dịch DNA mẫu

- Tính tỉ lệ OD260/OD280.

- Đun cách thủy trong 20 phút dung dịch DNA mẫu, làm lạnh đột ngột trong nước

đá trong 10 phút Đo OD260 của dung dịch biến tính Quan sát giải thích kết quả

và kết luận

4 Kết quả đạt được

Hàm lượng và tổng lượng DNA của dịch chiết ban đầu và sau khi biến tính

BÀI 4 KỸ THUẬT ĐIỆN DI

3 Điện di acid nucleic

Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường được dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di có thể được sử dụng trong phân tích hay phối hợp với các kỹ thuật khác, có thể định tính và định lượng Những đoạn DNA lớn như là nhiễm sắc thể có thể được phân tách bằng kỹ thuật điện di cải biến pulsed field gel electrophoresis (PFGE), sử dụng sự thay đổi chiều di chuyển của DNA Kỹ thuật điện di đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là kỹ thuật điện di theo phương ngang

Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này Ethidium bromide (EtBr) đã từng là chất nhuộm DNA phổ biến Phân tử EtBr chèn vào giữa các cặp base đối diện nhau trên phân tử DNA và tạo huỳnh quang cam/đỏ khi được chiếu tia UV (~ 300 nm) Các chất nhuộm thay thế khác với độ nhạy tương đương và ít nguy nguy hiểm hơn, đó là SYBRGreen, GelRed hay Gelstar

Gel agarose có thể được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100 bp Agarose là một dạng polymer có thể được đun hòa tan, đổ khuôn và tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác nhau (thường là minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) được định hình bằng lược gel (comb) sau khi đổ gel vào khuôn Miếng gel được đặt ngập chìm trong dung dịch điện di và DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện

di, theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyển về phía cực dương Agarose gel là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễ dàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Với yêu cầu độ phân giải cao hơn hay việc tách chiết các phân tử DNA ngắn hơn nên sử dụng gel polyacrylamide

Vật liệu

Thiết bị điện di agarose gồm:

 Bộ cung cấp nguồn điện (power source)

 Bồn điện di (gel box)

 Khay gel (casting tray), lược gel (combs)

50x TAE Stock (1 L) Hòa tan trong 600 mL nước đã hấp khử trùng:

242 g Tris base (MW 121,14 g/mole);

57,1 mL glacial acetic acid;

100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0), thêm nước vào đến thể tích cuối cùng 1L

1x Tris-Boric Acid-EDTA (TBE) (được pha loãng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn) gồm Tris 89 mM (pH 7,6), boric acid 89 mM, EDTA 2 mM

10x Stock (1 liter)— Hòa tan trong 600 mL nước đã hấp khử trùng:

108 g Tris base (121,14 g/mole);

55 g boric acid (61,8 g/mole)

40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0) thêm nước vào đến thể tích cuối cùng 1 L

Hình 4.1 Ethidium bromide (a) ethidium bromide; (b) quá trình chèn vào phân tử DNA

của ethidum bromide