Thực hành sinh học phân tử 20

- Biết cách pha một số dung dịch hóa chất thông dụng dùng trong thí nghiệm..  Máy ly tâm: dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong một dung dịch.. Nguyên tắc: sự phân t

Bài 1 GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ, THAO TÁC CƠ BẢN TRONG

PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

1 Mục đích

Giúp sinh viên biết cách sử dụng các trang thiết bị thông dụng và các thao tác kỹ thuật

cơ bản trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử

2 Yêu cầu

- Sinh viên biết cách sử dụng micropipette, cách vận hành máy li tâm, cân điện tử

- Biết cách pha một số dung dịch hóa chất thông dụng dùng trong thí nghiệm

3 Nội dung

3.1 Một số thiết bị thông dụng

 Máy lắc ổn nhiệt: được sử dụng cho các phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng

enzyme, lai,…) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc

 Tủ hút khí độc: sử dụng trong các thí nghiệm với hóa chất bay hơi độc hay có mùi khó

chịu như phenol, chloroform, β-mercaptoethanol…

 Nồi hấp tự động (autoclave): dùng để hấp khử trùng các dụng cụ và hoá chất thí

nghiệm

 Tủ cấy vô trùng (laminar flow): được sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vô

trùng như tách chiết, pha hóa chất… Tủ phải luôn giữ sạch, bề mặt thí nghiệm được khử trùng bằng cồn Trước và sau khi sử dụng phải thanh trùng bên trong tủ bằng cách bật đèn UV trong ít nhất 15 phút

 Tủ lạnh: là tủ mát (4oC) hoặc tủ lạnh sâu (-20oC, -80oC ) dùng để giữ các sinh phẩm, hóa chất và mẫu thí nghiệm cần giữ ở nhiệt độ lạnh Đối với mẫu, hoá chất bảo quản ở

tủ lạnh sâu cần xử lí đúng cách và chọn vật chứa phù hợp trước khi bảo quản

 Máy ly tâm: dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong một dung dịch.

Nguyên tắc: sự phân tách các phần tử khác nhau trong một dung dịch được thực hiện

dựa trên vận tốc lắng khác nhau của chúng dưới tác dụng của một lực ly tâm Tùy thuộc vào đặc điểm dùng để phân tách (khối lượng hay tỉ trọng của các phần tử vật chất) mà người ta chia làm 2 loại: ly tâm phân đoạn (ly tâm vùng) và ly tâm đẳng tỉ trọng

* Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách các phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối lượng của chúng Vận tốc lắng của các phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng và lực ma sát của các phần tử với dung dịch ly tâm Để phân tách thành công các phần tử có trong một dung dịch cần phải có lực ly tâm và thời gian thích hợp

* Ly tâm đẳng tỷ trọng: phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng của chúng Phương pháp này rất hiệu quả, cho các phân đoạn phân tách thuần khiết Ống ly tâm chứa một cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ trên xuống đáy ống tạo nên gradient tỷ trọng Các phần tử sẽ lắng trong quá trình ly tâm và nằm ở vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với nó Saccharose và glycerol được dùng khi phân tách các bào quan, cesium chloride (CsCl) được dùng để phân tách các protein và nucleic acid

1

Hình 1.4 Máy ly tâm

 Máy vortex: giúp làm đồng nhất hóa mẫu hoặc dung dịch một cách nhanh chóng.

 Máy luân nhiệt (Thermocycler): là thiết bị giúp thay đổi nhiệt độ của hỗn hợp dung

dịch phản ứng PCR một cách tự động theo chương trình cài đặt trước của người sử dụng

Hình 1.5 Máy luân nhiệt

3.1 Dụng cụ dùng trong thí nghiệm

- Các dụng cụ thủy tinh thông dụng như becher, ống nghiệm, pipette, đĩa petri, ống đong, erlen

- Ống tube: bằng nhựa polyethylen hay polypropylen chịu được nhiệt độ khử trùng

(1atm, 121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) và một số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml

Hình 1.1 Các loại ống tube thông dụng

- Micropipette (pipetman): dùng hút dung dịch thể tích nhỏ, độ chính xác cao.

Lưu ý khi sử dụng:

3

Cửa sổ hiển thị giá trị thể tích

Giá trị ngưỡng

Piston

Cán để tay

Đầu gắn tip

Cần gạt đầu tip Điều chỉnh thể tích

Ống hút

Hình 1.2 Micropipette

 Không để pipette tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất.

 Không để gần nguồn nhiệt (đèn cồn, …).

 Tuyệt đối không điều chỉnh dưới ngưỡng thể tích tối thiểu và trên ngưỡng thể tích tối

đa

 Khi sử dụng xong phải điều chỉnh pipette về thể tích tối đa

- Các đầu tip (cone): Các micropipette luôn sử dụng các đầu tip Các đầu tip này thường

chỉ được sử dụng một lần và có nhiều loại tương ứng với nhiều loại micropipette khác nhau Các đầu tip này được hấp khử trùng ở điều kiện thông thường

Hình 1.3 Các loại tip thông dụng

Chú ý: khi ly tâm phải để các tube đối xứng nhau trên roto đối với số tube là số chẳn, nếu

số tube lẻ phải thêm một tube cùng loại và thêm vào thể tích nước bằng với thể tích của các tube kia rồi thực hiện ly tâm

3.3 Chuẩn bị hóa chất

3.3.1 Một số nguyên tắc pha hóa chất

 Hóa chất được pha với nước cất hai lần và khử trùng ở điều kiện thông thường Đối

với một số hóa chất không thể hấp khử trùng, việc thanh trùng được tiến hành với đầu lọc có đường kính lỗ lọc là 0,2µm hoặc 0,45µm

 Khi đong, cân hóa chất tuyệt đối không đổ hoá chất thừa trở lại bình chứa ban đầu

3.3.2 Tính toán các hóa chất

a Nồng độ Mol : nồng độ phân tử gram theo thể tích hay số mol chất tan trong một lít dung dịch Được dùng để biểu thị nồng độ mol của một dung dịch

Ví dụ: để pha chế 100ml dung dịch 5M NaCl (58,456 g/mol) cần

5 mol/lít x 58,456 g/mol x 0,1 lít = 29,29 g NaCl trong 100 ml dung dịch

b Phần trăm

- Phần trăm (w/v): số gram trong 100 ml dung dịch

- Phần trăm (v/v): thể tích (ml) trong 100 ml dung dịch

VD: để tạo dung dịch 0,7% agarose trong TBE buffer, cân 0,7 gram agarose và thêm dung dịch TBE đến 100 ml

c Dung dịch đậm đặc : vài dung dịch đệm của enzyme được chuẩn bị dưới dạng dung dịch đậm đặc như 5X hoặc 10X (đậm đặc gấp 5 đến 10 lần dung dịch sử dụng), sau đó được pha loãng đến nồng độ cuối (thường là 1X hoặc 0,5X)

3.3.3 Chuẩn bị dung dịch làm việc (working solutions) từ dung dịch mẹ (concentrated stock

solutions)

Một vài dung dịch đệm được sử dụng trong các thí nghiệm với cùng thành phần có trong dung dịch đó nhưng với những nồng độ khác nhau, cần phải chuẩn bị những dung dịch đậm đặc (stock solutions) ban đầu để có thể pha loãng khi cần

Để chuẩn bị 100 ml buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM) bao gồm 1ml Tris 1M và 0,2 ml EDTA 0,5M và 98,8 ml nước cất

Công thức tính toán như sau: C1 x V1 = C2 x V2

C1 : nồng độ ban đầu ( hoặc nồng độ của dung dịch mẹ) V1 : thể tích ban đầu (thể tích của dung dịch)

C2 : nồng độ cuối ( hoặc nồng độ cần) V2 : thể tích cuối (thể tích cần)

3.3.4 Một số phương pháp cơ bản bảo quản hóa chất

 Các dung dịch thường được pha và bảo quản dưới dạng đậm đặc (dung dịch mẹ) Dung dịch mẹ được pha loãng với nước cất hai lần đã khử trùng để đạt nồng độ cần cho mỗi lần sử dụng

 Dung dịch đã sử dụng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, ở nhiệt độ 4 oC hoặc nhiệt độ lạnh sâu -20 oC theo khuyến cáo cho từng loại hóa chất Dung dịch bảo quản ở

-20 oC thường được phân thành những phần nhỏ, mỗi lần sử dụng chỉ cần giải đông một phần

4 Thực hành

- Sinh viên quan sát các thiết bị, dụng cụ, cách vận hành, thực tập với micropipette

- Chú ý đến các đơn vị đo lường: thể tích, nồng độ và cách pha một số dung dịch gốc như EDTA 0,5M; NaCl 3M; TE 5X; TBE 10X, dung dịch li trích DNA, tính lượng hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR

5 Kết quả đạt được

- Sinh viên biết vận hành các thiết bị và sử dụng micropipette thuần thục

- Sinh viên biết cách tính toán và pha các hóa chất, dung dịch thông dụng

5

Bài 2 LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ THỰC VẬT

1 Mục đích: Giúp sinh viên hiểu phương pháp tách chiết DNA thực vật

2 Yêu cầu: Sinh viên nắm vững và thực hiện được các bước tách chiết DNA theo phương

pháp dùng dịch trích SDS

3 Nội dung

3.1 Giới thiệu

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh những tác nhân

cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này Quá trình tách chiết DNA gồm các bước cơ bản như sau:

 Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA.

 Loại bỏ các thành phần không mong muốn.

3.2 Qui trình li trích DNA tổng số bằng SDS

Dung dịch đồng nhất mẫu (Homogenization Buffer) gồm: Tris 200 mM (pH 8,0), EDTA

25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0,5%

- Bước 1: Nghiền mẫu trong tube 1,5ml có chứa 400 µl dịch đồng nhất mẫu

- Bước 2: Bổ sung vào tube 500 µl PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) và lắc nhẹ 1 phút, li tâm với vận tốc 10.000 vòng/5 phút, sau đó hút dịch nổi cho vào ống tube mới

- Bước 3: Bổ sung 400 µl chloroform vào, lắc nhẹ 3 phút, li tâm 10.000 vòng/5 phút, hút dịch nổi chuyển qua tube mới

- Bước 4: Thêm 600 µl ethanol 99o, lắc nhẹ 2 phút Ủ ở -200C trong 30 phút Sau đó li tâm 12.000 vòng/5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Phơi tube ở nhiệt độ phòng

- Bước 5: Thêm vào kết tủa DNA 30 µl nước khử ion hấp khử trùng (không chứa DNase) hoặc 30 µl TE 0,5X, vortex nhẹ và bảo quản ở 40C hoặc -200C

3.4 Ly trích DNA plasmid vi khuẩn

Giới thiệu

Qui trình ly trích plasmid này được dùng để ly trích DNA plasmid từ huyền phù tế bào vi khuẩn và dựa trên qui trích ly trích kiềm tính phát triển bởi Birnboim và Doly (1979) Qui trình

ly trích dựa trên sự khác biệt về hình thái giữa DNA plasmid – các phân tử nhỏ, siêu xoắn, và DNA nhiễm sắc thể - lớn hơn rất nhiều và ít xoắn Sự khác biệt này giúp phân biệt giữa kết tủa DNA nhiễm sắc thể, protein tế bào với plasmid và các phân tử RNA Ở điều kiện kiềm, các tế bào được phân giải, cả nucleic acid và protein đều bị biến tính Khi dung dịch được trung hòa bởi Kali Acetate (CH3COOK), DNA nhiễm sắc thể và protein kết tủa vì các phân tử này không thể phục hồi lại cấu trúc ban đầu (do kích thước lớn) Các plasmid hồi tính ổn định và tồn tại trong dung dịch, tách hẳn ra khỏi DNA nhiễm sắc thể và protein

Vật liệu – Thiết bị - Hóa Chất

ống 1,5 mL

bình tam giác

Máy ly tâm

Máy vortex

Bồn ủ

Dung dịch I (lạnh) Dung dịch II Dung dịch III (lạnh) Isopropanol

Nước (khử ion, tiệt trùng)

 Dung dịch I (bảo quản 4oC)

50mM glucose (lọc khử trùng)

25mM Tris-HCl (pH 8.0)

10mM EDTA (pH 8.0)

 Dung dịch II

0.2 N NaOH

1% SDS

 Dung dịch III (bảo quản ở 4oC)

5M potassium acetate (Kali acetate)

Glacial acetic acid

Qui trình ly trích DNA plasmid (Birnboim và Doly, 1979)

Vi khuẩn E.coli mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast

extract 0.5%, NaCl 1%) ở 37oC, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 giờ nuôi cấy (nuôi qua đêm) được sử dụng để ly trích plasmid theo qui trình gồm các bước như sau:

1 Lấy 1 ml dịch khuẩn cho vào tube 1,5 ml

2 Ly tâm dịch khuẩn ở tốc độ 5.000 rpm trong 2 phút

3 Loại bỏ dịch nổi Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa

4 Lập lại bước 1, 2, 3

5 Thêm 100 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ

6 Thêm 200 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l dung dịch II Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Không vortex ở bước này Giữ

tube trên đá

7 Thêm 150 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Giữ tube trên đá khoảng 1 phút

8 Ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút Chuyển dịch nổi sang tube mới (1V)

9 Thêm 2V isopropanol, vortex nhẹ; để yên trong 20 phút ở -20oC

10 Ly tâm 10.000 rpm/ 5 phút để thu kết tủa DNA Loại dịch nổi phía trên Thêm 500 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l ethanol 70%, ly tâm 10.000 rpm/5 phút Loại bỏ dịch nổi và phơi ống cho đến khi không còn dung dịch nào bên trong ống

11 Thêm 30 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l nước khử ion (không chứa Dnase) hoặc TE Vortex nhẹ và bảo quản ở -20oC

7

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG

1 Mục đích: Giúp sinh viên hiểu cách định lượng nucleic acid bằng phương pháp đo mật độ

quang

2 Yêu cầu: Sinh viên đo lượng mẫu và tính nồng độ nucleic acid

3 Nội dung

3.1 Nguyên tắc

Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng của các phân tử vật chất trong môi trường lỏng người ta

có thể tính được nồng độ của chúng Mỗi phân tử có một đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Sự hấp thụ này

là do sự tương tác giữa các proton với các electron của vòng purin và pyrimidin Đỉnh hấp thụ của nucleotic là 260nm trong vùng tử ngoại Sự hấp thụ được tính bằng giá trị OD (Optical Density) Một đơn vị OD tương ứng với một nồng độ là:

- 50µg/ml DNA sợi đôi

- 40µg/ml DNA sợi đơn hay RNA

- 20µg/ml oligonucleotide sợi đơn

Hay có thể tính bằng công thức

DNA ng/µl = 62,9*OD 260- 36*OD280

Từ giá trị OD đo được, ta suy ra được nồng độ acid nucleic trong dung dịch Dung dịch acid nucleic được xem là sạch khi tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8-2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ này sẽ thấp hơn và phương pháp này không chính xác

3.2

.Phương pháp

- Đo OD260 của dung dịch DNA mẫu

- Đo OD280 của dung dịch DNA mẫu

- Tính tỉ lệ OD260/OD280

- Đun cách thủy trong 20 phút dung dịch DNA mẫu, làm lạnh đột ngột trong nước đá trong 10 phút Đo OD260 của dung dịch biến tính Quan sát giải thích kết quả và kết luận

4 Kết quả đạt được

Kết quả đo OD

BÀI 4 KỸ THUẬT ĐIỆN DI

1 Mục đích

Giúp sinh viên hiểu phương pháp thu nhận mẫu acid nucleic phân tích, định tính và định lượng DNA

2 Yêu cầu

- Thực hiện đổ gel agarose 0,8%, nạp mẫu, thực hiện điện di và quan sát gel dưới tia UV

- Xác định hàm lượng dung dịch acid nucleic bằng phương pháp đo OD

4.1 Điện di acid nucleic

Giới thiệu

Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường được dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di có thể được sử dụng trong phân tích hay phối hợp với các kỹ thuật khác, có thể định tính và định lượng Những đoạn DNA lớn như là nhiễm

sắc thể có thể được phân tách bằng kỹ thuật điện di cải biến pulsed field gel electrophoresis

(PFGE), sử dụng sự thay đổi chiều di chuyển của DNA Kỹ thuật điện di đơn giản nhất và được

sử dụng rộng rãi nhất là kỹ thuật điện di ngang

Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này, thường sử dụng ethidium bromide Chất nhuộm này bám vào DNA bằng cách chèn vào giữa các cặp base đối diện nhau và tạo huỳnh quang cam/đỏ khi được chiếu tia UV Các chất nhuộm thay thế khác với độ nhạy tương đương

và ít nguy nguy hiểm hơn, đó là SYBRGreen hay Gelstar

Gel agarose có thể được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100 bp Agarose là một dạng polymer có thể được đun hòa tan, đổ khuôn và tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác nhau (thường là minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) được định hình bằng lược gel (comb) sau khi đổ gel vào khuôn Miếng gel được đặt ngập chìm trong dung dịch điện

di và DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyển về phía cực dương Agarose gel là một ma trận gồm các

lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễ dàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Với yêu cầu độ phân giải cao hơn hay việc tách chiết các phân tử DNA ngắn hơn nên sử dụng gel polyacrylamide

9

Hình 4.1 Ethidium bromide (a) ethidium bromide; (b) quá trình chèn vào phân tử DNA

của ethidum bromide

Vật liệu

Thiết bị điện di agarose gồm:

 Bộ cung cấp nguồn điện

 Bồn điện di

 Khay, lược gel

 Giá đổ gel (gel caster)

Hóa chất

 Dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

 Agarose

 Loading dye

Cách chuẩn bị dung dịch đệm

1x Tris-Acetate-EDTA (TAE) (được pha loãng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn)

gồm Tris 40 mM (pH 7,6), acetic acid 20 mM, EDTA 1 mM

50x TAE Stock (1 L) Hòa tan trong 600 mL nước đã hấp khử trùng:

242 g Tris base (FW = 121);

57,1 ml glacial acetic acid;

100 ml EDTA 0,5 M (pH 8.0), thêm nước vào đến thể tích cuối cùng 1L

1x Tris-Boric Acid-EDTA (TBE) (được pha loãng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn)

gồm Tris 89 mM (pH 7,6), boric acid 89 mM, EDTA 2 mM

10x Stock (1 liter)— Hòa tan trong 600 mL nước đã hấp khử trùng:

108 g Tris base (FW = 121);

55 g boric acid (FW = 61.8)

40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) thêm nước vào đến thể tích cuối cùng 1L

DNA and RNA sample Loading Dye

Dung dịch đệm chạy mẫu 10X gồm glycerol 50%, bromophenol blue 0,25%, và xylene cyanole 0,25% trong đệm TAE 1X Dung dịch đệm chạy mẫu thường được chuẩn bị với thể tích từ 1–

10 m

Hình 4.2 Hệ thống điện di gel agarose

(a) Nguồn điện; (b) bồn điện di (Mini-Sub Cell GT, Bio-rad)