Y sinh học phân tử thực hành bai 1 ứng dụng tin sinh học trong thiết kế mồi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGChuẩn đầu ra bài học Sau khi học xong, sinh viên cĩ khả năng : 1.. P olymerase C hain R eaction PCR Nguyên tắc : Khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA

TS Dương Hồng Quân Trung tâm Xét nghiệm, Trường Đại học Y tế công cộng

Y sinh học phân tử

Bài 1: Ứng dụng tin sinh học trong

thiết kế mồi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Chuẩn đầu ra bài học

Sau khi học xong, sinh viên cĩ khả năng :

1 Sử dụng được cơng cụ tìm kiếm NCBI-BLAST

2 Giải thích cách tìm kiếm cơ sở dữ liệu các trình tự nucleotit

3 Thực hiện thiết kê mồi cho phản ứng PCR

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

Nguyên tắc : Khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA quan tâm mà không qua tạo dòng

Ứng dụng : Chẩn đoán xác định tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

Đạt giải Nobel hĩa học ( 1993 )

Karry Mullis

( 1985 )

Khám phá vĩ đại nhất

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

Nguyên lý : Phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch

số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao

(primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

Cặp mồi (forward/reverse primers)

• Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới

• Mồi xuôi và mồi ngược: đặc hiệu cho 2 đầu đoạn gene

• Cần biết nhiệt độ nóng chảy

Phụ thuộc chiều dài mồi, thành phần GC, ….

• Chiều dài: 15-30 nt

• Nồng độ: 0.1- 1.0 uM (pMol/ul)

• Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng “mismatch” Tránh AT thay vào đó là GC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

DNA Polymerase

• Kéo dài mạch DNA

• Taq hoặc tương tự

• Enzyme chịu nhiệt

• Nồng độ: 1 unit/phản ứng

Ion Mg 2+ (Magnesium)

• Co-factor quan trọng của DNA Polymerase, làm

tăng Tm của DNA mạch kép

• Ổn định cấu trúc xoắn kép của DNA

• Nếu quá ít: Enzyme khơng hoạt động

• Nếu quá nhiều: Phản ứng kém đặc hiệu

• Nồng độ: 0.5 to 3.5 mM

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

Nước (Nuclease-free Water)

• Môi trường hoạt động cho các thành phần còn lại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

( yếu tố ảnh hưởng )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

( yếu tố ảnh hưởng )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

( yếu tố ảnh hưởng )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

( yếu tố ảnh hưởng )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

( Lỗi thường gặp )

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

( Lỗi thường gặp )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Design primers

Validate primers

Primer design for PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer design for PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer design for PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer design for PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer design for Multiplex PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer design for PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

( Summary )

Primer-BLAST

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer-BLAST

Human zinc finger protein 773, Genbank accession NM_198542.1 )

Primer-BLAST

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Primer-BLAST

Đột biến đứt đoạn nhỏ trên NST Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Đột biến đứt đoạn nhỏ trên NST Y

Đột biến đứt đoạn nhỏ trên NST Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Đột biến đứt đoạn nhỏ trên NST Y

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

Https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 3412702/

https://www.thno.org/v10p7150.htm

P olymerase C hain R eaction ( PCR )

https://www.youtube.com/watch?v=P2ctzK2ZbHY https://www.youtube.com/watch?v=HXEpBnUbAMo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Xin chân thành cảm ơn!