5 xét nghiệm vi sinh chẩn đoán lao

XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 1 LOẠI BỆNH PHẨM – THỂ TÍCH BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN MẪU 2 13 Sep 181 ○Bệnh phẩm phải được đảm bảo về chất lượng và số lượng; được thu thập, vận chuyể[.]

XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO VÀ LAO

Loại bệnh phẩm Thể tích Đàm 5-10ml (VN: 3-5ml) Dịch não tủy 10ml, càng nhiều càng tốt Dịch

abces 10ml, càng nhiều càng tốt Dịch màng phổi, dịch màng tim, dịch màng bụng

10ml, càng nhiều càng tốt

Dịch dạ dày 5-10ml Hạch lympho 1 phần hay toàn bộ hạch Dịch rửa phế quản ≥ 5ml

Nửớ#c tiểu 50ml, càng nhiều càng tốt Sinh thiết mô 1g Phân ≥1g Máu 10ml Xửớng, tủy

Thwaites, G E., T T Chau, and J J Farrar 2004 Improving the bacteriological diagnosis of tuberculous meningitis J Clin Microbiol 42:378-9

➢ Các bệnh phẩm phải được chuyển đến phòng xét nghiệm ngay lập tức

➢ Nếu không có điều kiện chuyển mẫu ngay (đàm), có thể giữ mẫu ở 40C trong vòng 3-4 ngày

6

13-Sep-183

Advances in Diagnostic Assays for Tuberculosis Cold Spring Harb Perspect Med 2015;5:a017806

SỰ PHÁT TRIỂN CÁC TEST CHẨN ĐOÁN

XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO 11

PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB

➢Được áp dụng để chẩn đoán và phát hiện lao ở các nước có gánh nặng về lao với nguồn lực hạn chế ➢Dễ thực hiện, chi phí thấp ➢Cho kết quả chính xác và nhanh, trong vòng vài giờ

phân biệt vi khuẩn sống hay chết, vi khuẩn nhạy hay kháng thuốc, MTB hay NTM ➢Các phương pháp soi:

➢Soi trực tiếp (áp dụng rộng rãi) ➢Soi thuần nhất (áp dụng hạn chế) 12

13-Sep-186

Rửa Fuchsin 0.3% - 05 phút

ZIEHL Rửa nhẹ dưới vòi nước

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP (1)

➢ 10.000 vi khuẩn/ml đàm ➢ Độ nhạy: 50 – 80%, Độ đặc hiệu: 98 – 99% ➢ Thu

thập 2 mẫu đàm trong 1 ngày, cách nhau 2

giờ

13

13-Sep-187

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP NHUỘM ZN (2)

Cách đọc và ghi kết quả 0 AFB/100 qt Âm tính 1 – 9 AFB/100pt Ghi số cụ thể 10

– 99 AFB/100qt 1+ 1 – 10 AFB/qt 2+ >10 AFB/qt 3+

➢ Tỉ lệ phát hiện:

▪ Đàm 1: 80 – 83%

▪ Đàm 2: Thêm khoảng 10%

15

▪ Đàm 3: Thêm khoảng 5%

Rửa nhẹ dưới vòi nước Auramine 0.1% - 20 phút

KMnORửa nhẹ dưới vòi nước

HUỲNH QUANG LED

➢ Sử ánh dụng sáng đèn thường LED thành cực sáng ánh sáng như 1 huỳnh nguồn quang sáng phản chiếu, chuyển ➢ Không thay bóng đèn ➢ Không tạo nhiệt trong quá trình sử dụng ➢ Giảm năng lượng tiêu thu ➢ Có thể sử dụng pin ➢ Giảm giá thành ➢ 10.000 giờ ➢ Có Rhod/KMnO4; thể sử dụng Au/MethBlue)

nhiều loại thuốc nhuộm (Au/KMnO4; Au-

18

13-Sep-189

KHV HQ LED đã được TCYTTG khuyến cáo sử dụng vào năm 2009 để phát hiện lao ở các nước có dịch tể lao cao

Chuẩn vàng Độ nhạy LED-FM Độ đặc hiệu LED-FM

Cấy 93% (85% - 97%) 99% (98% - 99%) Soi trực tiếp (ZN) Tăng 6% (0.1% - 13%) Không thay đổi

13-Sep-1810 Soi huỳnh quang cổ điển

▪ Phương pháp cấy đặc: 3 tuần – 1 tháng

▪ Phương pháp cấy lỏng: 2 – 3 tuần ➢ Các chủng cấy dương có thể dùng để thực hiện :

13-Sep-1810 13-Sep-1810

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)

➢ Được TCYTTG công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đoán lao

➢ Các loại môi trường:

▪ Löwenstein-Jensen (LJ): môi trường trứng chứa Glycerol và Asparagine

▪ Môi trường OGAWA : môi trường trứng chứa Glycerol và sodium glutamate

▪ Bệnh phẩm được xử lý với NALC-NaOH hoặc NaOH 2-4% (ngoại trừ dịch cơ thể vô trùng như dịch não tủy )

▪ Cặn lắng của bệnh phẩm đã xử lý được cấy trên môi trường LJ, ủ ở 35-370C cho đến khi thấy khóm trùng mọc

21

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (2)

➢ Đọc và phân tích kết quả:

▪ Đọc kết quả hàng tuần

▪ Thường có kết quả cấy dương sau 3-4 tuần :

▪ Khóm trùng có màu kem, sần sùi như bông cải súp lơ

▪ Khi hòa tan khóm trùng trong nước muối sinh lý sẽ thấy sự hiện diện của các hạt rất nhỏ

▪ Quan sát dưới KHV: hình ảnh dây thừng với chiều dài khác nhau

▪ Nếu có kết quả cấy dương trong vòng 1 tuần:

▪ Nhóm vi khuẩn mọc nhanh (Mycobacterium Other Than Tuberculosis – MOTT hay Nontuberculosis mycobacteria- NTM)

13-Sep-1811 13-Sep-1811

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (4)

➢ Ưu điểm

▪ Môi trường dễ pha chế

▪ Rẽ tiền

▪ Vi khuẩn lao mọc tốt trên môi trường này

▪ Sau khi pha chế, có thể sử dụng trong vài tuần (giữ 4-80C)

▪ Môi trường có chứa malachite green dùng để ức chế sự phát triển của các tạp khuẩn

13-Sep-1812 thể 20-100 khóm trùng Dương tính: 1+

Mẫu cấy LJ dương

13-Sep-1812 13-Sep-1812

➢ Khuyết điểm

24

▪ Thời gian cho kết quả lâu (4-8 tuần)

Đọc kết quả Giải thích Không mọc Âm tính 1-19 khóm trùng Dương tính: số cụ

13-Sep-1812 13-Sep-1812

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (1)

➢ Hệ thống BACTECTM MGITTM 960 (Becton Dickinson, Sparks,

MD) ➢ Ưu điểm:

 Vi khuẩn lao mọc và phát triển trên môi trường lỏng nhanh

hơn môi trường đặc  Độ nhạy cao hơn phương pháp cấy đặc khoảng 10%  Đọc kết quả bằng máy

 Thời gian cho kết quả nhanh (10-14 ngày) ➢ Khuyết điểm  Đắt tiền  Tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn

(5-10%)

Năm 2007, TCYTTG khuy ế n cáo s ử d ụ ng ph ươ ng pháp c ấ y l ỏ ng đ ể tăng t ỉ l ệ phát hi ệ n

25

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (2)

➢ MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube ➢ Tube MGIT chứa Middlebrook 7H9, OADC và

PANTA ➢ Đáy tube được phủ 1 lớp silicon chứa muối ruthenium

(ruthenium salt) đóng vai trò như 1 chất phát huỳnh quang ➢ Bình thường, oxy hiện diện trong môi

trường cấy sẽ che lấp

sự phát quang của muối ruthenium ➢ Khi vi khuẩn sử dụng oxy để chuyển hóa và tăng sinh trong

môi trường nuôi cấy, lượng oxy trong môi trường sẽ giảm, sự phát quang ở đáy tube sẽ được nhìn

thấy khi xem dưới đèn UV ➢ Cần xác định sự hiện diện của AFB trong mẫu cấy

26

13-Sep-1813

ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO (1)

Định danh vi khuẩn lao chủ yếu dựa vào các tính chất sau:

 Vi khuẩn sinh trưởng chậm  Nhiệt độ sinh trưởng 35 – 370C  Không sinh sắc tố Niacin dương tính  Phản ứng Nitrate dương tính  Phản ứng catalase dương tính ở 68

 Không mọc trên môi trường LJ có chứa 500mg/L p- nitrobenzoic acid  Mọc trên môi trường có chứa thiophen-2-carboxylic

13-Sep-1814

acid hydrazide (2μg/ml TCH)

27

Phát hiện protein MPT 64 (kháng nguyên) do M.tb complex tiết ra trong môi trường cấy lỏng

28 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec 2011, p 4343–4346

13-Sep-1814 13-Sep-1814

XÉT NGHIỆM VI SINH

29 CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC

➢ Phương pháp kháng sinh đồ cổ điển: phương pháp tỉ lệ kháng

(proportional DST method)

▪ Là phương pháp kháng sinh đồ gián tiếp

▪ Được công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đoán lao kháng thuốc

▪ Tính chất kháng thuốc được xác định dựa trên tỉ lệ % của số khóm trùng đếm được ở ống môi trường có thuốctrên ống môi trường không thuốc

▪ Được khuyến cáo thực hiện ở những bệnh nhân lao/nghi lao kháng thuốc: BN bỏ trị, thất bại điều trị, tái trị, HIV

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)

Thuốc kháng lao hàng 1 Thuốc kháng lao hàng 2 INH Ofloxacin Streptomycin Amikacin Rifampicin Ethionamide Ethambutol Kanamycin

PAS Capreomycin

PZA: Phương pháp Wayne: positive: nhạy (có pyrazinamidase)

pyrazinamidase/MTB (pncA gene)

PZA (prodrug) Pyrazinoic acid (POA)

13-Sep-1816

dạng hoạt động của PZA, diệt MTB

31

Jonmalung et al BMC Microbiology 2010, 10:223

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (3)

➢ Giải thích kết quả: vd: với tỉ lệ kháng 1%

▪ Nếu tỉ lệ này <1%: chủng nhạy

▪ Nếu tỉ lệ này≥1%: chủng kháng

32

13-Sep-1816 13-Sep-1816

BACTECTM MGITTM 960 SIRE/PZA

○Kháng sinh đồ gián tiếp

○Cơ chế hoạt động của máy tương tự MGIT 960

○Một bệnh phẩm: Ống control

Ống INH 0.1μg/ml Ống RIF 1μg/ml Ống STR 1μg/ml Ống EMB 1μg/ml

○Máy tự so sánh độ phát quang đo được ở ống thuốc so với ống không thuốc để xác định sự nhạy/kháng thuốc

○Máy tự động phân tích và báo kết quả 33

LINE PROBE SSAY – LPA GENOTYPE MTBDR-PLUS (1)

○Xét nghiệm sinh học phân tử

○Phát hiện M.tb complex trực tiếp từ mẫu đàm hoặc từ mẫu cấy dương

○Phát hiện chủng kháng INH (đột biến gen katG và inhA)

○Phát hiện chủng kháng RIF (đột biến trên gen ropB) trực tiếp từ mẫu đàm

○Thời gian cho kết quả trong vòng 24 giờ

34

13-Sep-1817

Genotype®MTBDRplus – Version 1 (2)

Mẫu đàm soi dương:

Nhạy – RIF : 98.9% Đặc hiệu – 99.4%

Nhạy– INH: 94.2% Đặc hiệu – INH: 99.7%

Mẫu đàm soi âm

Không giải thích được kết quả:

RIF: 20% (n=4/20) INH: 26% (n=5/19)

Barnard, Am J Respir Crit Care Med, 2008

35

GENOTYPE®MTBDRPLUS (3)

Năm 2008, TCYTTG khuyến cáo:

➢ Áp dụng test SHPT này trong chẩn đoán sớm lao đa kháng ➢ Chỉ áp dụng cho mẫu đàm soi dương hoặc mẫu cấy

dương ➢ Không thể thay thế hoàn toàn các phương pháp cấy

và kháng sinh đồ cổ điển

36

13-Sep-1818 13-Sep-1818 13-Sep-1818

XPERT MTB/RIF (1)

○Hệ thống khép kính

○Xét nghiệm trực tiếp từ mẫu đàm

○Phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF

○Có kết quả trong 90 phút

○Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30% so với phương pháp soi

○Sử dụng tại tuyến cơ sở

Năm 2010 - 2011, TCYTTG khuyến cáo:

Ưu tiên áp dụng Xpert MTB/RIF trong chẩn đoán sớm lao và lao đa kháng, ở các đối tượng:

➢

▪ Có nguy cơ mắc lao đa kháng

▪ Bệnh nhân HIV(+) có triệu chứng nghi ngờ mắc lao hoặc lao đa kháng

Có thể áp dụng để chẩn đoán lao ở những bệnh nhân có

nhóm ưu tiên

40

13-Sep-1820

TRIỂN KHAI ÁP DỤNG KỸ THUẬT

sáng và KHV huỳnh quang cổ điển

➢ Kỹ thuật SHPT (LPA): Chuẩn vàng, không thể

loại bỏ pp cấy và kháng sinh đồ cổ điển

➢ Xpert MTB/RIF: Thay thế cho phương pháp soi

Xpert MTB/RIF không thể loại bỏ hoàn toàn sự cần thiết của các pp soi, cấy và LPA trong tương lai gần 41

13-Sep-1821

○ Xét nghiệm dựa trên sự phát hiện kháng nguyên mycobacterial lipoarabinomannan (LAM) antigen trong nước tiểu

○ Xét nghiệm thực hiện trên mẫu nước tiểu nên có ưu điểm hơn so với xét nghiệm thực hiện trên mẫu đàm vì mẫu nước tiểu dễ thu thập và lưu trữ, và không có các nguy cơ kiểm soát nhiễm khuẩn liên quan đến thu thập mẫu đàm

○ Kháng nguyên LAM là một lipopolysaccharide hiện diện trong thành phần màng tế bào của mycobacterial, được giảiphóng trong quá trình chuyển hóa hoặc phân hủy tế bào vi khuẩn

○ LAM được tìm thấy nổi bật ở những người đang mắc lao; và có phản ứng chéo thấp với nhiễm mycobacteria không lao

○ Sự hiện diện của LAM trong nước tiểu có liên quan gián tiếp đến đáp ứng miễn dịch của người; và quá trình phát hiện nó có đóng góp vào việc phá triển các test POC có chi phí không đắt

○ Có độ nhạy chưa đạt yêu cầu, test LAM nước tiểu hiện tại không thích hợp để sàng lọc lao Tuy nhiên, không

giống các phương pháp chẩn đoán lao khác, nó có độ nhạy được cải thiện ở nhóm HIV/Lao và cải thiện hơn nữa

nếu CD4 thấp

44

13-Sep-1822

1 Ngoại trừ những trường hợp đặc biệt được nêu dưới đây đối

với người nhiễm HIV có CD4 thấp hoặc những người bệnh rất nặng, LF-LAM không được dùng để chẩn đoán lao

(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp)

2 LF-LAM có thể được dùng để hỗ trợ chẩn đoán lao ở bệnh nhân người lớn ngoại trú nhiễm HIV có các triệu chứng của lao (lao phổi/lao ngoài phổi) và có CD4 ≤ 100 cells/μL, hoặc người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể CD4 là bao nhiêu/không biết số lượng CD4 (khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có chất lượng thấp)

Lưu ý:

▪ Khuyến cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV ngoại trú có triệu chử#ng mắc lao (LP/LNP) có CD4 ≤100 cells/μL, hoặc

ngửớEi nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể CD4 là bao nhiêu/không biết tình trạng CD4, dửLa trên khái quát kết quả của BN nội trú

▪ Khuyến cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV trẻ em có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) , dựa trên khái quát kết quả của BN người

lớn

13-Sep-1823

3 LF-LAM không được dùng làm test sàng lọc lao

(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp )

46

13-Sep-1823 13-Sep-1823 13-Sep-1823

WHO 2015, FL-LAM Policy Guidance

13-Sep-1824

(02 mẫu cấy âm trên 2 mẫu đàm khác nhau)

(02 mẫu cấy âm trên cùng mẫu đàm hoặc khác mẫu đàm)

Có ít nhất 01 mẫu cấy âm

13-Sep-1825

1 TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 xét nghiệm thay thế cho XN soi đàm để chẩn đoán lao phổi ở người lớn

có triệu chứng nghi lao (Khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có chất lượng thấp) 2 TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 XN hỗ trợ thêm XN soi đàm đối với những BN người lớn có triệu chứng nghi lao phổi, đặc biệt khi cần làm thêm XN ở BN soi đàm âm tính (Khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có chất lượng thấp)

• Các khuyến cáo này được áp dụng ở những nơi có thực hiện

XN soi đàm trực tiếp

• TB-LAMP không được sử dụng để thay thế các XN sinh học

phân tử nhanh để phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF, đặc biệt là ở nhóm BN có nguy cơ mắc lao đa kháng thuốc

• Chưa có bằng chứng để kết luận liệu TB-LAMP có giá trị chẩn

đoán hỗ trợ đối với XN soi đàm ở BN đồng nhiễm HIV có triệu chứng và dấu hiệu mắc lao

• Các khuyến cáo này chỉ áp dụng đối với XN TB-LAMP trên mẫu đàm ở BN có triệu chứng và dấu hiệu mắc lao

• Các khuyến cáo này cũng được áp dụng ở trẻ em, dựa trên bằng chứng ở người lớn, vì viết rằng rất khó thu thập mẫu đam ở trẻ em

13-Sep-1826

The TB diagnostics pipeline - FIND

54

13-Sep-1827

Xpert MTB/RIF Ultra for detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance: a prospective multicentre diagnostic accuracy study Lancet Infect Dis 2018; 18: 76–84

Sử dụng catridge Xpert MTB/RIF Ultra để thay thế cho cartridge Xpert MTB/RIF

Next-generation Xpert® MTB/RIF Ultra assay recommended by WHO

http://www.who.int/tb/features_archive/Xpert-Ultra/en/