ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Bệnh nhân sốt kéo dài trên 7 ngày, nhiệt độ ≥ 37.8 0 C.
Kết quả ký sinh trùng sốt rét âm tính hoặc test nhanh chẩn đoán sốt rét âm tính.
Test nhanh NS1 và IgM âm tính.
Không tìm thấy ổ nhiễm trùng trên lâm sàng.
Mẫu huyết thanh không có chất chống đông, không bị tiêu huyết, không đục màu.
Mẫu huyết thanh được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp ở -20 0 C cho đến khi thực hiện xét nghiệm.
Mẫu máu lấy đủ thể tích đối với người lớn: 10ml, trẻ em: 5ml cho vào chai cấy máu Mẫu máu của một bệnh nhân phải được lấy ở hai vị trí khác nhau trong cùng một thời điểm.
Mẫu được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm sau khi lấy.
Mẫu huyết thanh bị tán huyết hoặc lưu trữ bảo quản không đúng tiêu chuẩn.
Mẫu máu không đủ thể tích, không đủ hai chai cấy máu cho cùng một bệnh nhân.
Kiểm soát sai lệch lựa chọn
Tuân thủ đúng tiêu chuẩn chọn vào và loại ra.
Bệnh nhân có đầy đủ thông tin.
Cỡ mẫu
Tất cả các bệnh nhân thỏa phương pháp chọn mẫu đã nêu trên đến khám và điều trị tại bệnh viện bệnh Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian nghiên cứu.
Phương pháp xử lý và phân tích số liệu
Số liệu được xử lý bằng các thuật toán thống kê y học, sử dụng phần mềm thống kê Stata phiên bản 13.0.
Các biểu đồ được vẽ tự động bằng phần mềm Stata phiên bản 13.0 và phần mềm Microsoft Excel 2010.
Biến số định tính được mô tả bằng tỉ lệ phần trăm và tần số.
Biến số định lượng được mô tả bằng giá trị trung bình và độ lệch có phân phối chuẩn.
Thống kê phân tích: Sự khác biệt giữa các nhóm được kiểm định bằng phép thử χ2 hoặc Fisher Giá trị p < 0.05 được xem là có ý nghĩa thống kê.
Định nghĩa các biến số
2.7.1 Các bi n số về đặc tính mẫu
Tuổi: là biến định lượng, được tính bằng năm nghiên cứu trừ đi năm sinh của bệnh nhân (tính theo dương lịch) Nhóm tuổi là biến thứ tự bao gồm 4 giá trị
Giới tính: là biến nhị giá gồm 2 giá trị là nam và nữ.
Nơi cƣ trú: là biến danh định, thu thập tỉnh thành nơi bệnh nhân cư trú.
Y u tố nguy cơ: là biến nhị giá gồm có 2 giá trị có tiếp xúc yếu tố nguy cơ và không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ Tiếp xúc với yếu tố nguy cơ bao gồm các trường hợp sau: Người chăn nuôi, người giết mổ, người chế biến thực phẩm, nhân viên thú y.
2.7.2 Các bi n số liên quan đ n xét nghiệm RBT
Dương tính thật: Một người mắc bệnh X và có kết quả xét nghiệm dương tính. Âm tính thật: Một người không mắc bệnh X và có kết quả xét nghiệm âm tính.
Dương tính giả xảy ra khi một người không mắc bệnh X nhưng kết quả xét nghiệm cho thấy họ dương tính Ngược lại, âm tính giả xảy ra khi một người thực sự mắc bệnh X nhưng kết quả xét nghiệm lại cho thấy họ âm tính.
Bảng các biến số thống kê, trong đó dương tính thật = (a), âm tính thật (d), dương tính giả = (b) và âm tính giả = (c)
Brucella (RBT) Nuôi cấy định danh
Dương tính Âm tính Tổng
Brucella (RBT) Nuôi cấy định danh
Dương tính Âm tính Tổng Âm tính c d c + d
(n = 96) Độ nhạy Độ đặc hiệu Giá trị tiên đoán dương Giá trị tiên đoán âm Tỉ lệ lưu hành của bệnh
Phương tiện nghiên cứu
Mẫu máu tĩnh mạch: 3 ml máu cho vào ống nghiệm không có chất chống đông để tách lấy huyết thanh dùng cho xét nghiệm RBT.
Máu toàn phần: mỗi bệnh nhân lấy hai chai cấy máu, 5 – 10ml cho vào từng chai cấy máu để nuôi cấy vi khuẩn (5 ml đối với trẻ em, 8 – 10 ml đối với người lớn).
2.8.2 Dụng cụ thi t bị và hóa chất
Bảng 2.1 Máy móc và thi t bị sử dụng
STT Tên thi t bị Mã thi t bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Kính hiển vi MI - 008 Olympus Nhật Bản
3 Máy định danh vi khuẩn ( Vitek 2) MI – 013 BioMérieux Pháp
Máy đo độ đục (Vitek Densicheck)
5 Máy ly tâm 33638 Eppendorf Mỹ
6 Tủ an toàn sinh học MWT16 –
7 Tủ lạnh thường MWT – F225 Alaska Nhật Bản
8 Tủ lạnh âm sâu -20 0 C MI – 026 Sanyo Nhật Bản
10 Tủ ủ CO2 MI - 007 Memmert Đức
Bảng 2.2 Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao
STT Tên dụng cụ Nước sản xuất
1 Bút chì sáp Việt Nam
5 Đồng hồ phòng thí nghiệm Việt Nam
6 Đũa thủy tinh Việt Nam
12 Ống nghiệm thủy tinh Việt Nam
13 Ống nghiệm không chứa chất chống đông
Kháng nguyên Rose Bengal Brucella (được bảo quản ở 2 0 C đến
Thuốc nhuộm Gram của hãng BioMérieux (Pháp)
STT Tên thuốc thử Số lƣợng
Crystal violet 20 gram Ethanol 96º 200 ml
Ammonium oxalate 8 gram Distilled water 800 ml 3
Potassium Iodide 20 gram Distilled water 1000 ml
Ethanol 96º 167 ml Distilled water Pha đủ 1 lít
Thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen đã được sửa đổi (phương pháp Stamp) của hãng BioMérieux (Pháp)
Bảng 2.4 Thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen
STT Tên thuốc thử Số lƣợng
Dung dịch nhuộm carbon fuchsin
1 Dung dịch A L.O.C High Suds (Amway) Nước cất
Xanh Methylene 0.25 Nước cất 99 ml Axit Acetic 1 ml
Môi trường tăng sinh BA tự đổ (phụ lục 1).
Phương pháp nghiên cứu
- Thu thập mẫu bệnh phẩm, mã hóa mã xét nghiệm cho từng bệnh phẩm.
- Mẫu thu lấy huyết thanh, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Tách chiết mẫu vào các Eppendorf 2ml, dán mã xét nghiệm.
+ Tiến hành xét nghiệm sàng lọc RBT.
+ Nếu kết quả dương tính, pha loãng mẫu huyết thanh với nước muối sinh lý ở độ pha loãng 1/4, 1/8…1/256.
Âm tính: ghi nhận kết quả, so sánh với kết quả định danh vi khuẩn.
Dương tính: ghi nhận kết quả (ghi cụ thể ở độ pha loãng nào), so sánh với kết quả nuôi cấy định danh vi khuẩn.
- Mẫu thu lấy máu toàn phần.
+ Cho 5 – 10ml máu vào chai cấy máu.
+ Để chai cấy máu vào máy Bactec, theo dõi.
+ Nếu sau 7 ngày máy không báo kết quả dương tính, bỏ mẫu Ghi nhận kết quả âm tính.
+ Nếu trong vòng 7 ngày mẫu báo dương tính, ta tiếp tục thực hiện đồng thời nhuộm Gram và Ziehl-Neelsen đã được sửa đổi (phương pháp Stamp), tiếp theo là định danh vi khuẩn trên hệ thống Vitek 2.Ghi nhận kết quả
Quy trình nghiên cứu đƣợc thực hiện theo sơ đồ
Ly tâm 3000/vòng trong 5 phút
Huyết thanh thu được cho vào Eppendorf
Nếu dương tính tiếp tục pha loãng ở 1/2, 1/4…1/128
Ghi nhận và so sánh với kết quả định danh vi khuẩn
Ghi nhận và so sánh với kết quả định danh vi khuẩn
3ml máu cho vào ống nghiệm không chứa chống đông
5-10 ml cho vào chai cấy máu
Cho vào máy Bactec (theo dõi trong 7 ngày) Âm tính Dương tính
Gram Quan sát hình dạng vi khuẩn
Ziehl-Neelsen Quan sát hình dạng vi khuẩn Âm tính
Dương tính, cầu trực khuẩn Gram âm Âm tính
Dương tính, cầu trực khuẩn
Nuôi cấy,định danh bằng máyVitek 2
Các quy trình xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu
Các thao tác thực hiện tất cả các kỹ thuật cần đảm bảo mức độ an toàn sinh học (ATSH) từ cấp 2 trở lên.
Kháng thể có trong huyết thanh kết hợp với kháng nguyên Brucella
Dung dịch huyền phù Brucella abortus biovar 1, chủng 99, bất hoạt với RBT, có nồng độ 0.5% phenol, được điều chỉnh pH xuống khoảng 3.6 - 3.7 để tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể có thể quan sát thấy, thể hiện dưới dạng những hạt màu đỏ trong dung dịch trong suốt.
Nguyên liệu phản ứng và mẫu huyết thanh để ở nhiệt độ phòng (22 o C ±
4 o C) khoảng một giờ trước khi làm phản ứng.
Lắc đều lọ kháng nguyên một cách nhẹ nhàng để kháng nguyên chắc chắn được đồng nhất.
Nhỏ 30 àl mẫu huyết thanh lờn trờn gạch men trắng.
Nhỏ 30 àl khỏng nguyờn lờn huyết thanh.
Trộn đều mẫu huyết thanh với kháng nguyên bằng que trộn.
Để đánh giá kết quả một cách chính xác, hãy nhẹ nhàng lắc tròn phiến kính trong 4 phút, có thể sử dụng máy lắc để đảm bảo quá trình được thực hiện đều đặn Sau 4 phút kể từ lúc bắt đầu lắc, hãy quan sát sự ngưng kết, đây là khoảng thời gian tốt nhất để đánh giá kết quả một cách đáng tin cậy.
Chú ý: Nếu kết quả dương tính tiếp tục thực hiện theo các bước: Để tăng độ đặc hiệu của xét nghiệm, tất cả các mẫu huyết thanh dương tính sẽ được pha loãng Thực hiện pha loãng mẫu huyết thanh của mẫu nghiên cứu với nước muối sinh lý 0.9 %.
+ Nhỏ 30 àl NaCl 0.9 % lờn trờn gạch men trắng ở 7 vị trớ liờn tiếp nhau đánh số thứ tự ở từng vị trí.
+ Ở vị trớ thứ 1 nhỏ 30 àl mẫu huyết thanh của mẫu dương tớnh.
+ Sau đú, 30 àl dung dịch pha loóng đầu tiờn này được chuyển sang giọt ở vị trí thứ hai với sự trợ giúp của micropipette và trộn lẫn để thu được độ pha loãng 1/4.
+ Từ đó, độ pha loãng 1/8 đến 1/128 thu được bằng cách truyền liên tục hỗn hợp, thay đầu pipet giữa các lần truyền.
+ Nhỏ 30 àl khỏng nguyờn lờn huyết thanh đó pha loóng ở 7 vị trớ liên tiếp, độ pha loãng cuối cùng dao động từ 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
+ Nhẹ nhàng lắc tròn phiến kính trong 4 phút.
+ Quan sát sự ngưng kết sau 4 phút kể từ lúc bắt đầu lắc là khoảng thời gian tốt nhất để đánh giá kết quả. Đánh giá kết quả
Phản ứng âm tính: không có sự ngưng kết.
Phản ứng dương tính (có mặt kháng thể đặc hiệu): có các hạt ngưng kết lấm tấm màu hồng Ghi nhận kết quả dương tính kèm theo mức độ pha loãng.
The Rose Bengal Test (RBT) is a diagnostic tool used to detect Brucellosis in humans The test results can be either positive (left) or negative (right), indicating the presence or absence of the disease This diagnostic method has been proven to be effective in diagnosing human Brucellosis, as shown in the image The test is a valuable tool in the medical field, allowing healthcare professionals to accurately diagnose and treat this infectious disease.
Nguyên tắc hoạt động máy Bactec 9240
Trong môi trường cấy, khi có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu, chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất, thải khí Carbon Dioxide (CO2) vào môi trường, lượng CO2 này phản ứng với một chất nhuộm được gắn trong bộ phận cảm biến ở mỗi đáy chai (sensor) Phản ứng này điều chỉnh lượng ánh sáng được hấp thu bởi một bộ phát quang trong sensor Phần Photo Detector đo mức phát quang tương ứng với hàm lượng CO2 vi sinh vật thải ra môi trường Sau đó, hàm lượng CO2 này được máy phiên dịch cho ra kết quả dựa theo thông số mẫu dương tính đã được cài trước.
Lấy máu khi bệnh nhân đang sốt.
Lấy máu trước khi bệnh nhân dùng kháng sinh.
Bệnh nhân đang truyền (máu, dịch,…) phải khóa dây truyền và lấy máu ở tay bên đối diện.
Nếu bệnh nhân vừa ăn xong phải chờ 2 – 3 giờ sau ăn mới lấy máu.
Bệnh nhân đang dùng kháng sinh: Phải dừng thuốc ít nhất 24 giờ trước khi lấy máu.
Các bước tiến hành cấy máu
Bước 1: Ghi lên vỏ chai cấy máu các thông tin: Họ tên, tuổi của người bệnh, ngày, giờ lấy máu, khoa điều trị (nếu bệnh nhân cấy máu nhiều lần phải ghi rõ số lần cấy máu vào chai cấy máu và phiếu xét nghiệm).
Bước 2: Lấy máu tĩnh mạch thao tác vô trùng tuyệt đối (khử trùng vị trí lấy máu 2 lần bằng cồn iod và sát khuẩn lại bằng cồn 70 o theo hình xoáy trôn ốc), nếu chọc tĩnh mạch một lần không lấy được máu, phải lấy lại bằng kim tiêm khác, tuyệt đối không để chạm kim tiêm vào bất cứ vật gì Thể tích máu lấy 10ml (người lớn), 5ml (trẻ em), có chai riêng.
Bước 3: Mở nắp bảo vệ chai cấy máu, sát trùng mặt nút cao su của chai bằng cồn 70 0 chờ khô (không sử dụng cồn iod), chọc kim qua nút cao su, bơm trực tiếp máu vào chai, lắc chai cấy máu để máu được trộn đều.
Bước 4: Chuyển ngay chai cấy máu và phiếu yêu cầu xét nghiệm về khoa
Vi sinh càng sớm càng tốt.
Bảo quản: Nếu không vận chuyển ngay có thể để ở nhiệt độ phòng (25 o C). Không được bảo quản trong tủ lạnh.
Bước 5: Để trong máy cấy máu tự động ở 35 o C (với chai cấy máu) và theo dõi trong vòng 7 ngày.
Bước 6: Với chai của máy cấy máu tự động: Sát trùng nắp chai, để khô, lấy bơm kim tiêm hút một lượng nhỏ dịch làm tiêu bản nhuộm Gram và nhuộm Ziehl – Neelsen tìm vi khuẩn Brucella Xem tính chất bắt màu, hình thể của vi khuẩn, ghi vào sổ xét nghiệm.
Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của fucshin.
Cố định phiến phết từ môi trường lỏng
- Dùng bút sáp để ghi tên mẫu hoặc số nhận diện, ngày thử nghiệm Vẽ vòng tròn để giới hạn vùng phiến phết vi khuẩn.
- Dùng khuyên cấy lấy một khuyên dịch khuẩn, dàn đều thành lớp mỏng giới hạn trong vòng tròn đã vẽ trên lam kính Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn.
- Hơ mặt dưới của lam kính qua lai trên ngọn lửa 2- 3 lần, tránh không để tiêu bản quá nóng.
Bước 1: Phủ dung dịch Crystal violet lên lam kính đã được cố định trong
1 phút, sau đó rửa lại bằng nước.
Bước 2 :Phủ dung dịch lugol trong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch lugol và rửa nhẹ với nước.
Bước 3: Cầm một đầu lam kính, nhỏ từ từ cồn 95 0 cho đến khi vùng phiến kính bạc màu đi (thời gian tẩy cồn thông thường từ 10-15 giây) Rửa ngay với nước để chấm dứt công đoạn tẩy màu.
Bước 4: Phủ dung dịch fuchsin lên lam kính 1 phút, đổ bỏ dung dịch và rửa qua nước.
Bước 5: Dùng giấy thấm để thấm khô hoặc để khô tự nhiên Khảo sát hình thể và tính chất bắt mầu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu Đọc kết quả
Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu đã được chấp thuận của hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh (số 143, ngày 20 tháng 03 năm 2019).
Thông tin bệnh nhân được mã hóa, giữ bí mật tuyệt đối, thông tin chỉ được sử dụng cho nghiên cứu không nhằm mục đích khác.
Thiết kế mô tả loạt ca không can thiệp, quá trình điều trị của bệnh nhân không bị gián đoạn.
Bệnh nhân không phải chi trả cho các xét nghiệm trong nghiên cứu.
KẾT QUẢ
Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella
3.1.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Brucella ở người
Tổng số có n = 96 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được thu thập từ bệnh viện bệnh Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh Tất cả mẫu máu được chúng tôi thực hiện song song hai xét nghiệm bao gồm: huyết thanh học RBT và cấy máu.
Bảng 3.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Brucella của xét nghiệm RBT và cấy máu Xét nghiệm Số lƣợng mẫu
Dương tính Âm tính Tỷ lệ nhiễm
Nhận xét: Tỉ lệ nhiễm Brucella thay đổi theo từng xét nghiệm được thể hiện trong bảng 3.1 Tỉ lệ nhiễm Brucella là n= 26 chiếm 27.1 % và n= 17 chiếm 17.7 % được xác định bằng thử nghiệm RBT và cấy máu tương ứng.
3.1.2 K t quả pha loãng huy t thanh đối với xét nghiệm RBT Để tăng độ đặc hiệu của xét nghiệm RBT, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu huyết thanh của bệnh nhân có kết quả RBT dương tính với nước muối lý
NaCl 0.9 % Tổng số có 26 mẫu RBT dương tính.
Bảng 3.2 K t quả pha loãng huy t thanh đối với xét nghiệm RBT dương tính (n&) Độ pha loãng Tần số Tỷ lệ
Nhận xét: Trong nghiên cứu, độ pha loãng cuối cùng dao động từ 1/2,
Dựa trên bảng 3.2, chúng ta có thể thấy rằng tần số xuất hiện ở các độ pha loãng khác nhau như sau: độ pha loãng 1/2 chiếm 19.2% với tần số 5; độ pha loãng 1/4 chiếm 15.4% với tần số 4; độ pha loãng 1/8 chiếm 7.7% với tần số 2; độ pha loãng 1/16 chiếm 30.8% với tần số 8; độ pha loãng 1/32 chiếm 7.7% với tần số 2; độ pha loãng 1/64 chiếm 7.7% với tần số 2; độ pha loãng 1/128 chiếm 3.8% với tần số 1 và cuối cùng là độ pha loãng 1/256 chiếm 7.7% với tần số 2.
3.1.3 So sánh k t quả pha loãng huy t thanh RBT đối với k t quả cấy máu
Bảng 3.3 So sánh k t quả pha loãng huy t thanh RBT đối với k t quả cấy máu
Nhận xét: Theo bảng 3.3 chúng tôi nhận ra rằng với độ pha loãng ≥ 1/8 tất cả các mẫu dương tính với RBT đều dương tính khi so với cấy máu Ở độ pha loãng < 1/8 thì độ đặc hiệu của xét nghiệm RBT không cao.
3.1.4 K t quả nuôi cấy định danh vi khuẩn Brucella
Sau khi thực hiện xét nghiệm cấy máu trên hệ thống máy cấy máu Bactec
9240 cho 96 mẫu máu của bệnh nhân, chúng tôi thu được kết quả có 17 mẫu dương tính Tiếp theo, thực hiện nhuộm soi đồng thời bằng hai phương pháp Gram và Ziehl-Neelsen cải tiến (phương pháp Stamp) để đánh giá sơ khởi. Độ pha loãng RBT Cấy máu
Bảng 3.4 K t quả nhuộm Gram và Ziehl-Neelsen cải ti n đối những mẫu cấy máu dương tính
Nhận xét: Qua nhuộm soi chúng tôi thu được kết quả như sau: đối với phương pháp nhuộm Gram quan sát được 17 mẫu cầu trực khuẩn Gram âm, thật thú vị đối với nhuộm Ziehl – Neelsen cải tiến kết quả cũng tương tự nhuộm Gram, thu được 17 mẫu cầu trực khuẩn (bảng 3.4).
Bảng 3.5 K t quả định danh vi khuẩn
Xét nghiệm Số lƣợng K t quả
Cấy máu 96 17 Định danh 17 Brucella menlitensis
Nhận xét: Đồng thời với kỹ thuật nhuộm soi các mẫu cấy máu dương tính, thực hiện định danh vi khuẩn trên hệ thống Vitek 2 compact Kết quả phân lập thu được 17 mẫu dương tính đều là B menlitensis (phụ lục 2) Những mẫu này cũng đều cho kết quả dương tính với xét nghiệm huyết thanh học RBT.
3.1.5 Đánh giá độ tương hợp của hai xét nghiệm RBT và cấy máu
K t quả Cấy máu Nhuộm Gram Nhuộm
Hình ảnh Cầu trực khuẩn,
Cầu trực khuẩn Đánh giá độ tương hợp giữa hai xét nghiệm Rose Bengal test và cấy máu, chúng tôi sử dụng Cohen ’ s kappa.
Theo Altman (1991), phân độ mạnh của tương hợp như sau:
Chỉ số Kappa Độ mạnh
Bảng 3.6 Độ tương hợp giữa hai xét nghiệm Rose Bengal và cấy máu Xét nghiệm Kappa Giá trị p CI (%) Độ tương hợp RBT và cấy máu
RBT: Rose Bengal test, CI: Confidence interval
Nhận xét: Theo bảng 3.6 ta thấy rằng kết quả Kappa= 0.67 (p < 0.001), với mức độ tin cậy là 95% Vậy chỉ số Kappa thuộc vào khoảng 0,61 – 0,80 Kết luận có sự tương hợp giữa hai phương pháp xét nghiệm.
3.1.6 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên âm của xét nghiệm huy t thanh học Rose Bengal
Sử dụng phần mềm thống kê Stata 13.0 và coi nuôi cấy định danh là tiêu chuẩn vàng: độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm, độ chính xác của RBT được tính theo công thức (bảng 3.12).
Bảng 3.7 Dữ liệu thô từ thử nghiệm RBT
Dương tính Âm tính Tổng
Bảng 3.8 Dữ liệu thống kê của RBT để chẩn đoán nhiễm Brucella so với nuôi cấy định danh vi khuẩn
Công thức Giá trị 95% CI Độ nhạy 94.1 89.39 đến 98.81 Độ đặc hiệu 87.3 80.64 đến 93.96
Công thức Giá trị 95% CI
Giá trị tiên đoán dương
Giá trị tiên đoán âm
98.6 96.23 đến 100.95 Độ chính xác 88.5 82.12 đến 94.88
Nhận xét: Theo bảng 3.12 ta thấy rằng: độ nhạy của xét nghiệm RBT là
94.1 % tương ứng với khoảng tin cậy (CI) 95% là (89.39 % - 98.81 %), độ đặc hiệu của xét nghiệm RBT là 87.3% tương ứng với khoảng tin cậy (CI) 95% là (80.64 % - 93.96 %), giá trị tiên đoán dương là 61.5 % tương ứng với khoảng tin cậy (CI) 95% là (51.77 % - 71.23 %), giá trị tiên đoán âm là 98.6 % tương ứng với khoảng tin cậy (CI) 95% là ( 96.23 % - 100.95 %), độ chính xác của xét nghiệm RBT là 88.5 % tương ứng với khoảng tin cậy (CI) 95% là ( 82.12 % - 94.88 %).
3.2 Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học và các y u tố liên quan đ n tình trạng nhiễm Brucella
3.2.1 Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học
Biểu đồ 3.1 Biểu đồ phân bố giới tính
Nhận xét: Trong nghiên cứu, có tổng số 96 bệnh nhân Trong đó có 55 nam chiếm 57.3 % và 41 nữ chiếm 42.7 %.
3.2.1.2 Độ tuổi Độ tuổi của bệnh nhân tham gia nghiên cứu trong tổng số 96 mẫu, trong đó thấp nhất là 1 tuổi và cao nhất là 82 tuổi Ta thấy rằng độ tuổi trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu là 43.5 ± 18.3.
Biểu đồ 3.2 Biểu đồ phân bố nhóm tuổi Nhận xét: Theo biểu đồ 3.2, ta thấy rằng bệnh nhân ở nhóm tuổi 21 – 40 chiếm đa số trong dân số nghiên cứu, chiếm 36.5%.
Dựa trên biểu đồ 3.3, tỉ lệ dân số nghiên cứu theo nơi cư trú cho thấy tổng số 96 bệnh nhân nhập viện tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, phân bố dân cư ở 18 tỉnh thành khác nhau.
Trong nghiên cứu, tỉ lệ dân số cư trú ở tỉnh Bình Phước chiếm đa số 28.1% và tỉ lệ dân số ở những tỉnh khác chiếm 71.9 %.
Bến Tre Bình Dương Bình Phước Bình Thuận Củ Chi Đak Nông Đak Lak Đồng Nai Đồng Tháp Gia Lai
Hồ Chí Minh Lâm Đồng Long An Tây Ninh Tiền Giang Trà Vinh Vĩnh Long Vũng Tàu
3.2.1.4 Y u tố nguy cơ Đối với những bệnh nhân tham gia nghiên cứu, chúng tôi thu thập thông tin về vấn đề tiếp xúc với nguồn bệnh bao gồm: Người chăn nuôi, người giết mổ, người chế biến thực phẩm, nhân viên thú y.
Theo biểu đồ 3.4, trong tổng số 96 người tham gia nghiên cứu, có 17.7% dân số tiếp xúc với yếu tố nguy cơ, tương đương với 17 trường hợp.
3.2.2 Các y u tố liên quan đ n tình trạng nhiễm Brucella
3.2.2.1 Mối liên hệ giữa tỉ lệ nhiễm và giới tính
BÀN LUẬN
Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella
Nuôi cấy vẫn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh nhiễm Brucella, với sự triển khai của các hệ thống nuôi cấy máu tự động tại các phòng xét nghiệm vi sinh cho bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Phương pháp này không chỉ tăng độ nhạy mà còn rút ngắn thời gian xét nghiệm, mang lại hiệu quả cao trong việc phát hiện bệnh.
Trong trường hợp không có cơ sở nuôi cấy và thiết bị an toàn sinh học, chẩn đoán bệnh Brucella chủ yếu dựa vào việc phát hiện kháng thể đặc hiệu qua các phương pháp huyết thanh học như xét nghiệm Rose Bengal, Serum agglutination testing, Enzyme-linked immunosorbent assay và Coombs test Mặc dù có nhiều xét nghiệm được sử dụng để chẩn đoán huyết thanh học của bệnh Brucellosis, nhưng chưa có xét nghiệm nào được coi là lý tưởng Do đó, cần một kỹ thuật lý tưởng để chẩn đoán bệnh Brucella, vì bệnh này dễ bị chẩn đoán sai nếu chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng.
Rose Bengal test là một xét nghiệm ngưng kết nhanh, sử dụng huyền phù
Xét nghiệm RBT cho thấy độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiễm trùng do Brucella spp., không phụ thuộc vào giai đoạn bệnh Với kỹ thuật đơn giản, không cần trang thiết bị hiện đại và thời gian thực hiện nhanh chóng (khoảng 4 phút), RBT trở thành lựa chọn lý tưởng để sàng lọc bệnh Brucellosis ở người Tuy nhiên, một nhược điểm lớn của xét nghiệm này là khả năng dương tính giả cao, chủ yếu do phản ứng chéo với các loại vi khuẩn khác.
Mặc dù nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng xét nghiệm RBT có độ nhạy cao, nhưng thông tin về tính đặc hiệu của nó ở các khu vực lưu hành vẫn còn hạn chế Nhiều nghiên cứu gặp phải vấn đề sai lệch do mẫu nghiên cứu không đại diện, bao gồm cả người khỏe mạnh và bệnh nhân mắc các bệnh khác Để cải thiện độ đặc hiệu và giá trị tiên đoán dương, có thể thực hiện pha loãng liên tiếp các mẫu huyết thanh với nước muối sinh lý.
Nghiên cứu của chúng tôi đánh giá giá trị của xét nghiệm huyết thanh học RBT bằng cách so sánh kết quả của xét nghiệm ngưng kết RBT với kỹ thuật nuôi cấy định danh, trong đó nuôi cấy định danh được xem là tiêu chuẩn vàng.
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ phần trăm dương tính của xét nghiệm RBT và cấy máu lần lượt là 27.1% và 17.7%, không có sự khác biệt đáng kể giữa hai phương pháp (p > 0,05) Hiện tại, dữ liệu về độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm huyết thanh học ở Việt Nam còn hạn chế Độ nhạy và độ đặc hiệu là yếu tố quan trọng giúp giảm sai sót trong chẩn đoán và điều trị Nghiên cứu cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán âm và dương của xét nghiệm RBT lần lượt đạt 94.1%, 87.3%, 98.6% và 61.5% Kết quả của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Ying-Hock Teng (2017) với độ nhạy 95.8% và độ đặc hiệu 93.4%, tuy nhiên, độ đặc hiệu của chúng tôi thấp hơn Sự khác biệt về độ nhạy có thể do các kháng nguyên RBT khác nhau và việc sử dụng kháng nguyên chất lượng cao từ các phòng xét nghiệm có kinh nghiệm là rất quan trọng Độ nhạy của RBT phụ thuộc vào nồng độ và công thức kháng nguyên thương mại.
Xét nghiệm RBT có độ đặc hiệu cao, không bị ảnh hưởng bởi các biểu hiện sốt của bệnh lao, sốt rét, sốt thương hàn, lupus ban đỏ và viêm khớp dạng thấp, theo nhiều nghiên cứu Tuy nhiên, kết quả dương tính giả có thể xảy ra do phản ứng chéo với một số vi khuẩn như Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Francisella tularensis, Salmonella, Pseudomonas maltophilia và Vibrio cholera Mặc dù đã có báo cáo về trường hợp dương tính ở những người tiêm vắc-xin Vibrio cholerae, nhưng không ghi nhận dương tính đối với xét nghiệm RBT ở bệnh nhân bệnh tả, cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong biểu hiện lâm sàng giữa hai bệnh này.
Brucella S-LPS tồn tại trong thời gian kéo dài ở một số ít bệnh nhân đã hồi phục
Bệnh Brucellosis có thể dẫn đến kết quả huyết thanh học không đặc hiệu, điều này cần được bác sĩ xem xét kỹ lưỡng Mặc dù một số tác giả cho rằng RBT có tính hữu dụng hạn chế ở các khu vực lưu hành, nghiên cứu của Ruiz-Mesa và cộng sự cho thấy độ đặc hiệu của huyết thanh đối với những người tiếp xúc nhiều lần với Brucella đạt 91,7% và 94,3% cho những người không tiếp xúc thường xuyên hoặc có tiền sử bệnh Do đó, việc chẩn đoán bệnh Brucellosis ở người cần phải kết hợp với các triệu chứng lâm sàng, không thể chỉ dựa vào kết quả xét nghiệm huyết thanh để đưa ra kết luận chẩn đoán.
Nghiên cứu hiện tại khẳng định rằng xét nghiệm huyết thanh học RBT là phương pháp hiệu quả để chẩn đoán gián tiếp bệnh Brucellosis ở người, đặc biệt khi kết hợp với triệu chứng lâm sàng Phương pháp này không yêu cầu cơ sở hạ tầng phức tạp, có chi phí thấp, độ nhạy cao và có thể cải thiện độ đặc hiệu thông qua thử nghiệm pha loãng huyết thanh RBT là lựa chọn lý tưởng cho các phòng xét nghiệm nhỏ chưa có trang thiết bị để nuôi cấy vi khuẩn Brucella.
Trong suốt quá trình thu thập số liệu, chúng tôi đã thu được tổng số mẫu là
Kết quả xét nghiệm huyết thanh học RBT cho thấy 26 mẫu dương tính, với độ pha loãng từ 1/4 đến 1/256 (bảng 3.2) Tất cả các mẫu dương tính với RBT đều cho kết quả dương tính khi pha loãng ≤ 1/8, so với 17 mẫu cấy máu tổng số (bảng 3.3), trong đó cấy máu được coi là tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên, ở độ pha loãng > 1/8, độ đặc hiệu của xét nghiệm RBT giảm Để cải thiện độ chính xác, chúng tôi khuyến nghị kết hợp kết quả cấy máu cho những bệnh nhân này.
Theo nghiên cứu, bệnh nhân ở Bình Phước có tỷ lệ nhiễm Brucella cao gấp 3.7 lần so với các khu vực khác, và những người tiếp xúc với yếu tố nguy cơ có tỷ lệ nhiễm cao gấp 3.2 lần so với nhóm không tiếp xúc Việc khai thác tiền sử bệnh nhân liên quan đến hai yếu tố này là cần thiết để cung cấp thông tin hỗ trợ cho lâm sàng trong việc chẩn đoán bệnh.
Kết quả từ xét nghiệm RBT cho thấy độ nhạy đạt 94.1% và độ đặc hiệu đạt 87.3%, với khoảng tin cậy 95% lần lượt là (89.39% - 98.81%) và (80.64% - 93.96%) Chúng tôi khuyến nghị áp dụng kỹ thuật huyết thanh học RBT như một phương pháp sàng lọc hiệu quả để chẩn đoán bệnh Brucellosis.
Theo tác giả Ramón Díaz, xét nghiệm RBT có nhiều ưu điểm vượt trội so với các xét nghiệm huyết thanh học khác như SAT, Brucellacapt, Coombs, ELISA và có độ nhạy cao nhất trong nhóm này Ông khuyên nên sử dụng RBT như một phương pháp sàng lọc hiệu quả để chẩn đoán bệnh Brucellosis Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy độ nhạy của xét nghiệm RBT đạt 94.1% với khoảng tin cậy 95% (89.39% - 98.81%) Vì vậy, chúng tôi đề xuất đưa RBT vào quy trình chẩn đoán bệnh Brucellosis, đặc biệt là cho các phòng xét nghiệm nhỏ không có điều kiện nuôi cấy và thiết bị an toàn sinh học, bởi đây là một xét nghiệm dễ triển khai và không yêu cầu cơ sở vật chất hiện đại Điều này cho phép sàng lọc bệnh nhân nghi ngờ nhiễm bệnh Brucellosis và tư vấn kịp thời cho họ đến các cơ sở y tế tuyến trên để điều trị.
Trong nghiên cứu, chúng tôi áp dụng kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen cải tiến, cho thấy rằng các mẫu nhuộm Gram (+) có hình ảnh cầu trực khuẩn Gram âm cũng cho kết quả tương tự với cầu trực khuẩn bắt màu đỏ trên nền xanh Chúng tôi khuyến nghị tích hợp cả hai phương pháp nhuộm này vào quy trình chẩn đoán bệnh nhiễm Brucella, nhằm đánh giá sơ khởi các mẫu cấy máu của bệnh nhân.
Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen đã được sửa đổi (phương pháp Stamp) có 2 điểm khác biệt so với cách nhuộm truyền thống.
- Là phương pháp nhuộm lạnh, không cần hơ lam phủ carbon fuchsin trên ngọn lửa đèn cồn.
- Dung dịch cồn – acid sử dụng là acid acetic 0.5% thay vì acid clohydric 3%, thời gian tẩy màu ngắn hơn nhuộm truyền thống.
Trên các cơ sở này, chúng tôi đề xuất một quy trình đơn giản để chẩn đoán bệnh nhiễm Brucella ở người.
Sơ đồ Quy trình chẩn đoán bệnh Brucella trên người
Bệnh nhân sốt ≥ 7 ngày Dengue âm tính
Ký sinh trùng sốt rét âm tính
Có tiếp xúc Không tiếp xúc
4.2 Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học và các y u tố liên quan đ n tình trạng nhiễm Brucella
Brucellosis là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng trên toàn cầu, đặc biệt ở các quốc gia đang phát triển, với khoảng 500.000 ca nhiễm được phát hiện hàng năm theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Tại Thổ Nhĩ Kỳ, đã có 189.226 trường hợp mắc bệnh được báo cáo, trong đó khoảng 90.000 ca được ghi nhận từ năm 2000 đến 2005, tương đương 15.000 ca mỗi năm Tại Iran, tỷ lệ lưu hành bệnh Brucellosis dao động từ 1.5 đến 107.5 trên 100.000 người vào năm 2003 Tuy nhiên, thông tin về tỷ lệ mắc bệnh Brucellosis ở Việt Nam và các yếu tố liên quan vẫn còn hạn chế.
Hạn chế của đề tài
Nghiên cứu mô tả này được thực hiện trên 96 bệnh nhân tại đơn vị nghiên cứu lâm sàng thuộc đại học Oxford, thành phố Hồ Chí Minh, bắt đầu từ tháng 09 năm.
Từ năm 2018 đến tháng 05 năm 2019, chúng tôi đã tiến hành xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella tại phòng xét nghiệm vi sinh Mặc dù nghiên cứu gặp một số hạn chế, chúng tôi vẫn rút ra được một số kết luận quan trọng.
1 Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella
Trên các cơ sở này, chúng tôi đề xuất một quy trình đơn giản để chẩn đoán bệnh nhiễm Brucellosis ở người.