5 xét nghiệm vi sinh chẩn đoán lao

XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO 11 PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB Được áp dụng để chẩn đoán và phát hiện lao ở các nước có gánh nặng về lao với nguồn lực hạn chế Dễ thực hiện, chi phí thấp 

Bệnh phẩm phải được đảm bảo về chất lượng và

số lượng; được thu thập, vận chuyển và xử lý

đúng cách.

Tùy theo thể loại bệnh lao mà các loại bệnh

phẩm được thu thập khác nhau:

Thwaites, G E., T T Chau, and J J Farrar 2004 Improving the bacteriological

diagnosis of tuberculous meningitis J Clin Microbiol 42:378-9.

118 BN LMN/HIV âm

5

 Các bệnh phẩm phải được chuyển đến phòng xét nghiệm

ngay lập tức

 Nếu không có điều kiện chuyển mẫu ngay (đàm), có thể

giữ mẫu ở 40C trong vòng 3-4 ngày

6

SỰ PHÁT TRIỂN CÁC TEST

CHẨN ĐOÁN

7

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN MỚI …

 Cần:

Cho kết quả nhanh

Cho kết quả chính xác: độ nhạy, đặc hiệu cao

Test có thể được lưu trữ và thực hiện ở nhiệt độ phòng

Dễ thực hiện, đơn giản

Không cần trang thiết bị hiện đại, phức tạp

Rẽ tiền

Có thể áp dụng rộng rãi ở những nước có mật đô lao cao

10

XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO

11

PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB

Được áp dụng để chẩn đoán và phát hiện lao ở các

nước có gánh nặng về lao với nguồn lực hạn chế

Dễ thực hiện, chi phí thấp

Cho kết quả chính xác và nhanh, trong vòng vài giờ.

Không phân biệt vi khuẩn sống hay chết, vi khuẩn

nhạy hay kháng thuốc, MTB hay NTM

Các phương pháp soi:

Soi trực tiếp (áp dụng rộng rãi)

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP (1)

Rửa nhẹ dưới vòi nước

Rửa nhẹ dưới vòi nướcFuchsin 0.3% - 05 phút

NHUỘM

ZIEHL NEELSEN

14

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP NHUỘM ZN (2)

Rửa nhẹ dưới vòi nước

Rửa nhẹ dưới vòi nướcAuramine 0.1% - 20 phút

NHUỘM HUỲNH QUANG

16

SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (3)

(%)

Độ đặc hiệu (%)

 Sử dụng đèn LED cực sáng như 1 nguồn sáng phản chiếu, chuyển

ánh sáng thường thành ánh sáng huỳnh quang

 Không thay bóng đèn

 Không tạo nhiệt trong quá trình sử dụng

 Giảm năng lượng tiêu thu

KHV HUỲNH QUANG LED

SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (4)

18

Soi trực tiếp (ZN) Tăng 6% (0.1% - 13%) Không thay đổi

Soi huỳnh quang cổ

điển

Tăng 5% (0 – 11%) Tăng 1% (-0.7% - 3%)

Giảm thời gian đọc tiêu bản còn 50% so với ZN

KHV HQ LED đã được TCYTTG khuyến cáo sử dụng vào năm 2009 để phát hiện lao ở các nước có dịch tể lao cao

PHƯƠNG PHÁP CẤY

 >100 - 1000 vi khuẩn/ml đàm

 Vi khuẩn lao tăng sinh tốt trên môi trường trứng chứa

glycerol và asparagine hoặc môi trường lỏng chứa serum

hoặc albumin bò

 Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30 – 50% so với phương

pháp soi

 Cho kết quả chậm vì thời gian nhân đôi dài (18-24 giờ):

 Các chủng cấy dương có thể dùng để thực hiện :

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)

 Được TCYTTG công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đoán lao

 Các loại môi trường:

 Löwenstein-Jensen (LJ): môi trường trứng chứa Glycerol và

 Bệnh phẩm được xử lý với NALC-NaOH hoặc NaOH 2-4%

(ngoại trừ dịch cơ thể vô trùng như dịch não tủy…)

 Cặn lắng của bệnh phẩm đã xử lý được cấy trên môi trường

LJ, ủ ở 35-370C cho đến khi thấy khóm trùng mọc

21

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (2)

 Đọc và phân tích kết quả:

 Đọc kết quả hàng tuần

 Thường có kết quả cấy dương sau 3-4 tuần :

Khóm trùng có màu kem, sần sùi như bông cải súp lơ

Khi hòa tan khóm trùng trong nước muối sinh lý sẽ thấy sự

hiện diện của các hạt rất nhỏ

Quan sát dưới KHV: hình ảnh dây thừng với chiều dài khác

nhau

 Nếu có kết quả cấy dương trong vòng 1 tuần:

Nhóm vi khuẩn mọc nhanh (Mycobacterium Other Than

Tuberculosis – MOTT hay Nontuberculosis

mycobacteria-NTM)

 Trả kết quả âm tính sau 8 tuần

Tỉ lệ ngoại nhiễm chấp nhận: 2-3%

22

Mẫu cấy LJ dương

Khóm trùng vi khuẩn lao trên mẫu cấy dương

Đọc kết quả Giải thích

1-19 khóm trùng Dương tính: số cụ

thể20-100 khóm trùng Dương tính: 1+

 Vi khuẩn lao mọc tốt trên môi trường này

 Sau khi pha chế, có thể sử dụng trong vài tuần (giữ

4-80C)

 Môi trường có chứa malachite green dùng để ức

chế sự phát triển của các tạp khuẩn.

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (1)

 Hệ thống BACTECTMMGITTM 960 (Becton Dickinson, Sparks,

MD)

 Ưu điểm:

 Vi khuẩn lao mọc và phát triển trên môi trường lỏng nhanh

hơn môi trường đặc

 Độ nhạy cao hơn phương pháp cấy đặc khoảng 10%

 Đọc kết quả bằng máy

 Thời gian cho kết quả nhanh (10-14 ngày)

 Khuyết điểm

 Đắt tiền

 Tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn (5-10%)

Năm 2007, TCYTTG khuy ế n cáo s ử d ụ ng ph ươ ng pháp

c ấ y l ỏ ng đ ể tăng t ỉ l ệ phát hi ệ n

25

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (2)

 MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube

 Tube MGIT chứa Middlebrook 7H9, OADC và PANTA

 Đáy tube được phủ 1 lớp silicon chứa muối ruthenium

(ruthenium salt) đóng vai trò như 1 chất phát huỳnh quang

 Bình thường, oxy hiện diện trong môi trường cấy sẽ che lấp

sự phát quang của muối ruthenium

 Khi vi khuẩn sử dụng oxy để chuyển hóa và tăng sinh trong

môi trường nuôi cấy, lượng oxy trong môi trường sẽ giảm, sự

phát quang ở đáy tube sẽ được nhìn thấy khi xem dưới đèn

UV

 Cần xác định sự hiện diện của AFB trong mẫu cấy 26

ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO (1)

Định danh vi khuẩn lao chủ yếu dựa vào các tính chất sau:

 Vi khuẩn sinh trưởng chậm

 Nhiệt độ sinh trưởng 35 – 370C

môi trường cấy lỏng

XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

29

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC(1)

 Phương pháp kháng sinh đồ cổ điển: phương pháp tỉ lệ kháng

(proportional DST method)

 Là phương pháp kháng sinh đồ gián tiếp

 Được công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đoán lao kháng

thuốc

 Tính chất kháng thuốc được xác định dựa trên tỉ lệ % của

số khóm trùng đếm được ở ống môi trường có thuốc trên

ống môi trường không thuốc

 Được khuyến cáo thực hiện ở những bệnh nhân lao/nghi lao

kháng thuốc: BN bỏ trị, thất bại điều trị, tái trị, HIV…

 Rẽ tiền

 Thời gian có kết quả từ 28 – 42 ngày kể từ khi có kết quả 30

Thuốc kháng lao hàng 1 Thuốc kháng lao hàng 2

31

PZA: Phương pháp Wayne: positive: nhạy (có pyrazinamidase)

pyrazinamidase/MTB (pncA gene)

PZA (prodrug) Pyrazinoic acid (POA)

dạng hoạt động của PZA, diệt MTB Jonmalung et al BMC Microbiology 2010, 10:223

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC(1)

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC(3)

 Giải thích kết quả: vd: với tỉ lệ kháng 1%

 Nếu tỉ lệ này <1%: chủng nhạy

 Nếu tỉ lệ này≥1%: chủng kháng

32

BACTECTMMGITTM960 SIRE/PZA

Kháng sinh đồ gián tiếp

Cơ chế hoạt động của máy tương tự MGIT 960

Một bệnh phẩm: Ống control

Ống INH 0.1g/ml Ống RIF 1g/ml Ống STR 1g/ml Ống EMB 1g/ml

Máy tự so sánh độ phát quang đo được ở ống thuốc so

với ống không thuốc để xác định sự nhạy/kháng thuốc

LINE PROBE SSAY – LPA

GENOTYPEMTBDR-PLUS(1)

Xét nghiệm sinh học phân tử

Phát hiện M.tb complex trực tiếp từ mẫu đàm hoặc từ

mẫu cấy dương

Phát hiện chủng kháng INH (đột biến gen katG và

Mẫu đàm soi âm

Không giải thích được

Năm 2008, TCYTTG khuyến cáo:

Áp dụng test SHPT này trong chẩn đoán sớm lao đa

XPERT MTB/RIF (1)

Hệ thống khép kính

Xét nghiệm trực tiếp từ mẫu đàm

Phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF

Có kết quả trong 90 phút

Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30% so với phương pháp soi

566/567(99.8)

157/174 (90.2)

604/616 (98.1)

2 mẫu đàm

n=x/y

(%)

1423/1482 (96.0)

1127/1134 (99.4)

296/348 (85.1)

1215/1232 (98.6)

1 mẫu đàm

n=x/y

(%)

675/732(92.2)

551/561 (98.2)

124/171 (72.5)

604/609(99.2

Catharina C Boehme et al NEJM,

38

Năm 2010 - 2011, TCYTTG khuyến cáo:

 Ưu tiên áp dụng Xpert MTB/RIF trong chẩn đoán sớm

lao và lao đa kháng, ở các đối tượng:

 Có nguy cơ mắc lao đa kháng

 Bệnh nhân HIV(+) có triệu chứng nghi ngờ mắc lao

hoặc lao đa kháng

 Có thể áp dụng để chẩn đoán lao ở những bệnh nhân có

triệu chứng nghi lao nhưng không thuộc nhóm ưu tiên 39

40

TRIỂN KHAI ÁP DỤNG KỸ THUẬT …

KHV huỳnh quang LED: Thay thế KHV đèn

sáng và KHV huỳnh quang cổ điển

Kỹ thuật SHPT (LPA): Chuẩn vàng, không thể

loại bỏ pp cấy và kháng sinh đồ cổ điển

Xpert MTB/RIF: Thay thế cho phương pháp soi.

Xpert MTB/RIF không thể loại bỏ hoàn toàn sự cần thiết

của các pp soi, cấy và LPA trong tương lai gần 41

 Xét nghiệm dựa trên sự phát hiện kháng nguyên mycobacterial

lipoarabinomannan (LAM) antigen trong nước tiểu

 Xét nghiệm thực hiện trên mẫu nước tiểu nên có ưu điểm hơn

so với xét nghiệm thực hiện trên mẫu đàm vì mẫu nước tiểu dễ

thu thập và lưu trữ, và không có các nguy cơ kiểm soát nhiễm

khuẩn liên quan đến thu thập mẫu đàm

 Kháng nguyên LAM là một lipopolysaccharide hiện diện

trong thành phần màng tế bào của mycobacterial, được giải

phóng trong quá trình chuyển hóa hoặc phân hủy tế bào vi

khuẩn

 LAM được tìm thấy nổi bật ở những người đang mắc lao; và

có phản ứng chéo thấp với nhiễm mycobacteria không lao

 Sự hiện diện của LAM trong nước tiểu có liên quan gián

tiếp đến đáp ứng miễn dịch của người; và quá trình phát

hiện nó có đóng góp vào việc phá triển các test POC có

chi phí không đắt

 Có độ nhạy chưa đạt yêu cầu, test LAM nước tiểu hiện

tại không thích hợp để sàng lọc lao Tuy nhiên, không

giống các phương pháp chẩn đoán lao khác, nó có độ

nhạy được cải thiện ở nhóm HIV/Lao và cải thiện hơn

nữa nếu CD4 thấp

44

1. Ngoại trừnhững trường hợp đặc biệtđược nêu dưới đâyđối

với người nhiễm HIV có CD4 thấp hoặc những người bệnh

rất nặng, LF-LAM không được dùng để chẩn đoán lao

(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp)

2. LF-LAM có thể được dùng để hỗ trợ chẩn đoán lao ở bệnh

nhân người lớn ngoại trú nhiễm HIV có các triệu chứng của

lao (lao phổi/lao ngoài phổi) và có CD4 ≤ 100 cells/μL, hoặc

người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể CD4 là bao

nhiêu/không biết số lượng CD4 (khuyến cáo có điều kiện,

bằng chứng có chất lượng thấp)

Lưu ý:

Khuyến cáo nàycũng áp dụng đối với BN HIV ngoại

trúcó triệu chứng mắc lao (LP/LNP) có CD4 ≤100

cells/μL, hoặc người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể

CD4 là bao nhiêu/không biết tình trạng CD4, dựa trên

khái quát kết quả của BN nội trú

Khuyến cáo nàycũng áp dụng đối với BN HIV trẻ em

có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) , dựa trên khái quát kết

quả của BN người lớn

3. LF-LAM không được dùng làm test sàng lọc lao

(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp ) 46

WHO 2015, FL-LAM Policy Guidance

(02 mẫu cấy âm trên 2 mẫu đàm khác nhau)

(02 mẫu cấy âm trên cùng mẫu đàm hoặc khác mẫu đàm)

Có ít nhất 01 mẫu cấy âm

1 TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 xét nghiệm thay

thế cho XN soi đàm để chẩn đoán lao phổi ở người lớn

có triệu chứng nghi lao (Khuyến cáo có điều kiện, bằng

chứng có chất lượng thấp)

2 TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 XN hỗ trợ thêm

XN soi đàm đối với những BN người lớn có triệu chứng

nghi lao phổi, đặc biệt khi cần làm thêm XN ở BN soi

đàm âm tính (Khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có

chất lượng thấp)

• Các khuyến cáo này được áp dụng ở những nơi có thực hiện

XN soi đàm trực tiếp

• TB-LAMP không được sử dụng để thay thế các XN sinh học

phân tử nhanh để phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng

RIF, đặc biệt là ở nhóm BN có nguy cơ mắc lao đa kháng

thuốc

• Chưa có bằng chứng để kết luận liệu TB-LAMP có giá trị chẩn

đoán hỗ trợ đối với XN soi đàm ở BN đồng nhiễm HIV có

triệu chứng và dấu hiệu mắc lao

• Các khuyến cáo này chỉ áp dụng đối với XN TB-LAMP trên

mẫu đàm ở BN có triệu chứng và dấu hiệu mắc lao

• Các khuyến cáo này cũng được áp dụng ở trẻ em, dựa trên

The TB diagnostics pipeline - FIND

XPERT MTB/RIF ULTRA

54

Xpert MTB/RIF Ultra for detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance: a

prospective multicentre diagnostic accuracy study Lancet Infect Dis 2018; 18: 76–84

Next-generation Xpert® MTB/RIF Ultra assay recommended by WHO

Sử dụng catridge Xpert MTB/RIF Ultra để thay thế cho

cartridge Xpert MTB/RIF