Đề tài phân biệt thịt trâu và thịt bò bằng kỹ thuật PCR

Các phương pháp phát hiện thịt 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein Những phương pháp dựa vào protein sau đây có thể ứng dụng để xác định thành phần và nguồn gốc của các sản phẩm thịt và

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:

* Ban Giám hiệu trường Đại học Lạc Hồng, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học

và Môi trường – trường Đại học Lạc Hồng

* PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL TP HCM

* TS Hồ Thị Kim Hoa, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL TP HCM

* Quý cán bộ công chức tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - trường ĐHNL

TP HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành đề tài

* Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn, Đoàn Thị Tuyết Lê

TÓM TẮT

Đề tài “Phân biệt thịt trâu và thịt bò bằng kỹ thuật PCR” được tiến hành tại

Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP HCM từ ngày 15/10/2010 đến ngày 1/5/2011 Mục tiêu nghiên cứu là: xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu, thịt bò sử dụng primer tự thiết kế; ứng dụng quy trình PCR-trâu và PCR-bò để phát hiện thịt trâu và thịt bò đối với hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử

lý nhiệt, có có xử lý nhiệt và mẫu bột thịt trên thị trường nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc

Kết quả đạt được như sau:

Quy trình PCR phát hiện thịt trâu với forward primer và reverse primer có trình

tự như sau 5’- CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, 5’- ATGTAGCAGGGGCAT GAGAA-3’ Mẫu DNA được biến tính ở 94oC trong 4 phút sau đó được khuếch đại qua 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 94oC/1’, ủ bắt cặp ở 56oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’ và kết thúc ở 72oC/5’ Nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,001 ng/μl Tỷ lệ DNA thịt trâu thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò,

dê, cừu mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,1% Tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCR-trâu

có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1% Quy trình PCR-trâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC/15’,

120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt trâu với tỷ lệ

≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/30’ và 130oC/30’

Quy trình PCR phát hiện thịt bò với forward primer là 5’-CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, reverse primer là 5’-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC -3’ Quy trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC/4’; 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp

ở 54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’; kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’ Nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,001 ng/μl Tỷ lệ DNA bò thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,05% Tỷ lệ thịt bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò,

dê, cừu là 0,1% PCR-bò có khả năng phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý ở

80oC/15’, 180oC/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt bò với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’ và 130oC/30’

SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle by PCR

techniques” was carried out at Institute of Biotechnology & Environment, Nong Lam

University Ho Chi Minh city from October 15, 2010 to May 1, 2011 The project was aimed: (i) to establish PCR reactions for identification of beef and buffalo meat; (ii) consequently, to apply these reactions in identification of meat species in raw and processed meat mixtures

The results were summarized as follows:

PCR protocol for detection of buffalo meat (buffalo-PCR) using specific primers was accomplished A new set of primers for buffalo meat were designed and tested (Forward primer, 5'-CTACACATCCGACACAACAACAGC-3' and reverse primer, 5'-ATGTAGCAGGGGCATGAGAA-3') Amplification reaction was started with pre-denaturation step at 94oC/4', followed by 35 cycles including 94oC/1', 56oC/45'',

72oC/1’ and final extension at 72oC/5' The lowest concentration of buffalo DNA that could be detected by buffalo-PCR was 0.001 ng/μl The lowest rate of buffalo DNA in the DNA mixture reduced ratio of DNA from raw meat of buffalo, cattle, goat, sheep that buffalo-PCR could detect was 0.1%, which is the same as the lowest rate of buffalo meat that buffalo-PCR could detect in the meat mixture with reduced ratio of buffalo, beef, goat, sheep The PCR was successfully applied to detect buffalo meat in mixtures having been processed at 80oC/15’, 120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ but was not in the case of meat mixtures that had ≤ 10% buffalo meat and had been heated at

120oC/30’ and 130oC/30’

PCR protocol for detection of beef (cattle-PCR) was set up The new set of primers for the PCR to detect beef were: forward primer, 5'-CTACACATCCGACAC AACAACAGC-3’, and reverse primer, 5'-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC-3' The thermal process was as follows: 94oC/4' for initial denaturation, 35 cycles of denaturation at 94oC/1’, annealing at 54oC/45'', enlongation at 72oC/1’ and final extension at 72oC/5’ The cattle-PCR could detect cattle DNA with the concentration

as low as 0.001 ng/μl The lowest rate of cattle DNA in the mixture reduced ratio of DNA from the raw meat of the buffalo, cattle, goat, sheep that cattle-PCR could detect was 0.05% The lowest rate of cattle meat that cattle-PCR could detect in the reduced ratio mixture of buffalo, goats, sheep meat was 0.1% This PCR protocol was successfully to detect beef in meat mixtures which was processed at 80oC/15',

180oC/15' but was not to identify the meat in those had ≤ 10% buffalo meat and had been processed at 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’, and 130oC/30’

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

DANH SÁCH SƠ ĐỒ viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

Chương 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Mục đích 2

Chương 2 3

TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về thịt và thịt chế biến 3

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt 3

2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến 4

2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam 4

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới 4

2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam 5

2.2 Các phương pháp phát hiện thịt 6

2.2.1 Phương pháp dựa vào protein 6

2.2.1.1 Phương pháp điện di 6

2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch 8

2.2.1.3 Phương pháp sắc ký 8

2.2.2 Phương pháp dựa vào DNA 9

2.2.2.1 Phương pháp lai DNA 9

2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR 11

2.3 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài 21

2.3.1 DNA ty thể 21

2.3.2 Di truyền của ty thể 25

2.3.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến 25

2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp PCR 26

Chương 3 29

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 29

3.3 Vật liệu 29

3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA 29

3.3.2 Primer 29

3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 29

3.4 Phương pháp tiến hành 30

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 30

3.4.2 Tách chiết DNA 30

3.4.3 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò 31

3.4.3.1 Thiết kế primer 31

3.4.3.3 Kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 32

3.4.4 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bò 33

3.4.5 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò 33

3.4.5.1 Ứng dụng PCR-trâu 33

a Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu 33

b PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 33

c PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 34

d PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 34

e PCR-trâu với bột thịt trên thị trường 34

3.4.5.2 Ứng dụng PCR-bò 36

a Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò 36

b PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 36

c PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 36

d PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 36

e PCR-bò với bột thịt trên thị trường 36

Chương 4 38

KẾT QUẢ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò 38

4.2 Kết quả kiểm tra lý thuyết độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 38

4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR 38

4.2.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W 39

4.2.3 Kết quả BLAST 39

4.3 Kết quả kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 40

4.3.1 Bằng PCR 40

4.3.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B 40

4.3.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D 41

4.3.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F 41

4.3.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H 41

4.3.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua 43

4.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F&RB; F&RC đặc hiệu 43

4.3.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò 44

4.3.3.1 BLAST 44

4.3.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tự đoạn DNA của thịt trâu và bò 44

4.4 Xác định quy trình PCR-trâu 45

4.5 Xác định quy trình PCR-bò 45

4.6 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò 45

4.6.1 Ứng dụng PCR-trâu 45

4.6.1.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu 45

4.6.1.2 PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 46

4.6.1.3 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 46

4.6.1.4 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 47

4.6.1.5 PCR-trâu với bột thịt trên thị trường 48

4.6.2 Ứng dụng PCR-bò 49

4.6.2.1 Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò 49

4.6.2.2 PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 49

4.6.2.3 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 50

4.6.2.4 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 50

4.6.2.5 PCR-bò với bột thịt trên thị trường 53

Chương 5 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 65

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSE : bovine spongiform encephalophathy

GC : gas chromatography

HPLC : high performance liquid chromatography

IEF : isoelectric focusing

LC : liquid chromatography

LTRs : long terminal repeats

MT-ATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase 6

mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid

MT-ND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1

MT-ND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4

MT-ND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L

MT-ND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5

MT-ND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6

MT-RNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA

MT-TH : mitochondrially encoded tRNA histidine

MT-TL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUA/G)

MT-TS1 : mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN)

MT-TV : mitochondrially encoded tRNA valine

NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide

PCR : polymerase chain reaction

Prion : proteinaceous infectious particle

RCB : reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999) RP- HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography

SSRs : simple sequence repeats

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA 10

Hình 2.2: Genome của ty thể 24

Hình 4.1: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1-RBU1) và B (F1-RBU2) 41

Hình 4.2: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1-RC1) và D (F1-RC2) 41

Hình 4.3: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2-RBU1)và F (F2-RBU2) 42

Hình 4.4: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2-RC1) và H (F2-RC2) 42

Hình 4.5: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2 &RBU2 (Ta=56oC) 42

Hình 4.6: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua 43

Hình 4.7: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu 45

Hình 4.8: PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 46

Hình 4.9: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 46

Hình 4.10: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) 47

Hình 4.11: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) 47

Hình 4.12: PCR-trâu phát hiện thịt trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/15’(M5.1-M5.7) và 120oC/30’ (M4.1-M4.7) 48

Hình 4.13: PCR-trâu với bột thịt 48

Hình 4.14: Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò 49

Hình 4.15: PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 49

Hình 4.16: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 50

Hình 4.17: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) 51

Hình 4.18: PCR-bò phát hiện thịt bòtrong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120oC/30’(M4.1-M4.7) và 130oC/15’ (M5.1-M5.7) 52

Hình 4.19: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) 52

Hình 4.20: PCR-bò với bột thịt trên thị trường 53

DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt 20

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu 37

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt

xẻ) 3

Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển 21

Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA 23

Bảng 3.1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu primer 32

Bảng 3.2: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp 34

Bảng 3.3: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt 35

Bảng 4.1: Các primer thiết kế 38

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR 39

Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự cytochrome b các loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu 39

Bảng 4.4: Các tổ hợp primer 40

Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác nhau Do sự đa dạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế biến đã gây ra vấn đề gian lận thương mại Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi thành phần trên nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một vài loài thịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay vì lý do tôn giáo (ví

dụ, đạo Hindu không ăn thịt bò)

Thịt chế biến thường xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…) Đặc biệt đối với bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc tuy xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhưng được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ heo, trâu, bò, cừu, gà, dê,…nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn tồn tại và có khả năng gây bệnh Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc và có khả năng lây lan sang người

Vì lý do này, các nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam không cho nhập bột xuơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò của các vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE

Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiện chính xác và nhanh chóng các loại thịt trong những sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhau là nhu cầu cần thiết của thị trường và xã hội Có nhiều phương pháp để xác định nguồn gốc thịt như phương pháp phát hiện dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch, sắc ký), phương pháp phát hiện dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặc trưng cho loài như standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP.)

Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt Do đó, các phương pháp dựa vào DNA

thường được sử dụng hơn đặc biệt là các phương pháp PCR đặc trưng cho loài Trong

đó, các phương pháp Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP đòi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao Còn phương pháp PCR

dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi trong việc phân biệt loài của thịt Nếu có quy trình ly trích hợp lý, xác định gen mục tiêu thích hợp sẽ có thể phân biệt được các loại thịt đã xử lý nhiệt

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về thịt và thịt chế biến

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt

Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực phẩm

có nguồn gốc từ động vật Trong thương mại, thịt gồm có các mô: mô cơ, mô mỡ, mô

liên kết, mô xương sụn và mô máu Thành phần hóa học của thịt bao gồm nước,

protein, lipid, glucid, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ, khoáng, vitamin

và enzym Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử

dụng, khẩu phần nuôi dưỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể

học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004)

Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối

Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của nó đều khác nhau Do đó, tùy

theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính

chất của thịt Trong súc thịt, mô cơ là mô có giá trị dinh dưỡng cao nhất, thấp nhất là

mô liên kết Mô mỡ có giá trị năng lượng cao và còn làm cho thịt có vị béo Giá trị

thực phẩm của thịt đầu tiên được đánh giá qua tỉ lệ protein chứa trong đó và giá trị

sinh học của lượng protein đó

Trong dinh dưỡng con người và động vật, thịt và sản phẩm của thịt là nguồn

đạm, chất béo, vitamin, chất khoáng và các chất hòa tan Tất cả được sử dụng trong

cơ thể nhằm mục đích sinh tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể cũng như bù đắp năng lượng tiêu hao do hoạt động Thịt các loài động vật chứa hầu hết các nguyên tố

đa lượng và vi lượng cần thiết cho cơ thể, các vitamin nhóm B, acid pantotenic, vitamin PP Thịt heo chứa nhiều vitamin B1, B6 và acid pantotenic Thịt bò chứa nhiều vitamin B12

2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến

Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất thịt và các sản phẩm thịt là đại gia súc có sừng (trâu, bò…); gia súc (heo, cừu, dê ); và gia cầm (như gà, vịt, ngỗng,…) Để đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ thịt và nâng cao giá trị sử dụng của thịt thì chúng phải được chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục tiêu sử dụng Chế biến làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất dinh dưỡng

từ thịt, hạn chế sự nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, kéo dài tuổi thọ của sản phẩm do đó tăng giá trị sử dụng của thịt chế biến

Thịt chế biến có hai nhóm lớn: thịt chế biến làm thức ăn cho người và thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc Thịt chế biến làm thức ăn cho người thường được chế biến từ mô cơ, mô mỡ Thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thường là bột thịt) còn được chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác là phụ phế phẩm trong giết mổ gia súc như da, lông, xương, móng và các nội quan

Có nhiều phương pháp chế biến thịt cung cấp thực phẩm cho con người: phơi khô, ướp muối, ướp đường, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy), hun khói Trong đó phương pháp sử dụng nhiệt độ là phổ biến nhất Tùy theo loại sản phẩm và mục tiêu

sử dụng mà người ta xử lý ở mức nhiệt độ khác nhau Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến như xúc xích, lạp xưởng, thịt hộp, cá hộp được xử lý ở 800C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp được xử lý ở 1200C; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc và con người, nhiệt độ xử lý là 1300C (Hồ Thị Thu Nguyệt, 2003)

2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới

Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức nhiều cuộc điều tra trên đối tượng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy

có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu của sản phẩm Đặc biệt là

sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt gia súc khác nhau, các nhà sản xuất thường ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá trị thấp được trộn vào trong sản phẩm Một số trường hợp lại ghi sai tỷ lệ giữa các loại thịt Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần loài, độ an toàn và chất lượng sản phẩm thịt chế biến trên thị trường của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn còn

ít (http://archive.food.gov.uk)

Một cuộc điều tra khác của bộ môn Công Nghệ thực phẩm và vệ sinh thực phẩm, trường Thú y, Đại học Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt được trộn vào trong các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là 39,2% xúc xích lên men 35,7% xúc xích Ý, 27,2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tươi, 6,2% thịt viên

có chứa thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm Cụ thể là xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức với thành phần ghi trên nhãn là thịt bò nhưng kết quả kiểm tra lại có lẫn thịt gia cầm Các mẫu thịt bò tươi kiểm tra cho thấy

dương tính với thịt hươu và thịt ngựa

2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với nhà quản lý Ngay cả thịt tươi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận như thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò Đối với các sản phẩm thịt chế biến như xúc xích bò, chả giò bò, thịt hộp trên thị trường

có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng với thành phần trên nhãn hiệu đã đăng kí, đặc biệt các thực phẩm chế biến nhập khẩu

Những năm gần đây, Việt Nam đặc biệt quan tâm đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Các bệnh dịch nguy hiểm đã và đang diễn ra Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các sản phẩm động vật vẫn thường xảy ra Cục Thú y đã phối hợp với Vụ pháp chế - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm –

Bộ Y tế, Cục quản lý Thị trường – Bộ Công thương thường xuyên tổ chức thanh tra, kiểm tra công tác kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức tạp Tuy nhiên, chính quyền địa phương chưa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa các cơ quan, ban ngành tại địa phương chưa thống nhất và chặt chẽ

(http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=182&Itemid=65)

Thêm vào đó, công tác kiểm tra đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có nguồn gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập:

- Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật và tiêu chuẩn của Việt Nam Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ, nên việc kiểm tra chất lượng , kiểm dịch và thủ tục phê duyệt thường kéo dài

- Trong khi đó, các nước nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lượng, kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nước nhập khẩu thường rất chặt chẽ Các yêu cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của các nước này cũng rất cao

- Các nhà nhập khẩu nước ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải được lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm lông móng, dịch tả heo, dịch tả gà (newcastle), BSE và những vùng này phải được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) công nhận

- Yêu cầu tiêu chuẩn của Việt Nam thường không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu chuẩn của các nước nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006)

2.2 Các phương pháp phát hiện thịt

2.2.1 Phương pháp dựa vào protein

Những phương pháp dựa vào protein sau đây có thể ứng dụng để xác định thành phần và nguồn gốc của các sản phẩm thịt và từ thịt:

¾ Phương pháp điện di

¾ Phương pháp miễn dịch

¾ Phương pháp sắc ký

2.2.1.1 Phương pháp điện di

™ Bản chất của phương pháp điện di

Phương pháp điện di dựa vào sự phân tách của các phân tử protein trong điện trường sau khi ly trích từ mô Đầu tiên, protein đi qua lớp starch gel, sau đó đi qua lớp polyarylamide và agarose Sự phân tách protein được biểu hiện trên polyarylamide gel (PAGE), trên polyacrylamide gel chứa một tác nhân biến tính (sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE) hoặc nhờ điểm đẳng điện (isoelectric focusing - IEF) trên gel

agarose hoặc gel polyacrylamide (PAGIF)

Phương pháp IEF bao gồm sự phân tách trên một gel mà được xác định nhờ sự thay đổi pH Các protein riêng lẻ di chuyển theo giá trị pH mà tương đương với điểm đẳng điện (isoelectric point ) Điện di PAGE cũng được quan tâm nhờ sự vắng mặt của tác nhân biến tính Trong phương pháp này, sự phân tách protein phụ thuộc vào vật mang và kích thước của phân tử protein Các protein di chuyển từ cực dương sang cực âm phụ thuộc vào điện tích của chúng Trong trường hợp của SDS – PAGE, phân

tử protein mang điện tích âm được lấy từ SDS di chuyển từ cực dương với vận tốc phụ thuộc chủ yếu vào trọng lượng phân tử của chúng Có một mối tương quan tuyến tính giữa khoảng cách di chuyển của protein và giá trị logarit thập phân của trọng lượng phân tử mà có thể dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein Với sự hỗ trợ của điện di hai chiều (two dimensional electrophoresis 2-DE), nó có thể dùng để xác định thịt của nhiều loài liên quan của cá, chim, gia súc Sự phân tách protein có thể nhìn thấy được bằng mắt thường (trong trường hợp protein có chứa chất màu) hoặc sau khi nhuộm màu Những thuốc nhuộm thông thường gồm: coomasie blue, muối bạc, hoặc chất nhuộm có bản chất enzym (Hofmann, 1997)

™ Ứng dụng của phương pháp IEF

Sự phân tách protein nhờ IEF chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: pH thịt, tuổi và giới tính của gia súc cho thịt, dinh dưỡng, điều kiện nuôi, điều kiện dự trữ, hoạt tính tự nhiên hoặc protease vi sinh vật Có thể phân tách dựa vào thành phần đơn, ví dụ myoglobin là sắc tố cơ chuyên biệt loài Myoglobin sử dụng như là chỉ thị loài, sự phân tách cùng nhau có thể đạt được bởi những thịt thí nghiệm khác nhau của cùng một con vật hay của những con vật khác nhau của cùng một loài Điều này đã được chứng minh đối với thịt của các loài như bò, ngựa, heo, cừu, dê, kangaroo, lạc

đà, gấu, thỏ, gà, vịt, đà điểu, band myoglobin được xác định và chúng có thể được phân biệt cơ bản những myoglobin (Hofmann, 1997) Trong trường hợp, những thú

có quan hệ gần nhau, ví dụ như heo và heo rừng, mẫu myoglobin thì tương tự nhau

Kỹ thuật IEF có thể được sử dụng để xác định những thú có liên quan nhau với lượng myoglobulin thấp Ví dụ, thịt gà và thịt gà tây

™ Ứng dụng của phương pháp PAGE và SDS-PAGE

Phương pháp điện di PAGE có thể được sử dụng để xác định protein của các

loại thịt heo, bò, ngựa, cừu, cá, dê, hươu Phương pháp này cũng có thể sử dụng để phát hiện thịt của những loài có quan hệ với nhau, nhưng protein dùng để kiểm tra không được xử lý nhiệt Việc xác định các sản phẩm thức ăn bổ sung từ thịt của

những loài khác nhau đã xử lý nhiệt có thể thực hiện trong điều kiện protein kiểm tra

được phân hủy trong dung dịch guanidine chloride và điện di đẳng điện sau khi nhuộm enzym (Pyz, 1998)

Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) có thể phân tích các protein khó tan trong các dung môi khác hơn là trong dung dịch SDS Phương pháp này cũng có thể ứng dụng cho các protein không tan trong dung dịch có chứa urê, được sử dụng để phân tích chất lượng của protein, ví

dụ protein nhiều loài cá hoặc phân tích số lượng dựa vào thuốc nhuộm Tuy nhiên, phương pháp này không tiện lợi vì kết quả đạt được có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi, dinh dưỡng, stress, sự sai khác về chất lượng của thịt cũng như thịt đông lạnh bảo quản không tốt so với thịt tươi (Minkiewicz & ctv, 2000)

sự xuất hiện nhiều phương pháp miễn dịch mới, bao gồm các phương pháp miễn dịch phóng xạ, các phương pháp miễn dịch enzym, và các phương pháp miễn dịch sắc ký không enzyme (non-enzymatic chromatographic immunoassays hay lateral flow) với

độ nhạy và độ chính xác được cải thiện rất nhiều

2.2.1.3 Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được ứng dụng để phân biệt loài trong các mẫu thịt dựa vào sự kiểm tra thành phần acid béo (Verbeke & Brabander, 1985), histidine dipeptides (Carnegie & ctv, 1983; Chung & ctv, 1998) Trong các kỹ thuật trên, HPLC được sử dụng rộng rãi

nhất Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng cao áp ngược pha (RP-HPLC) được sử dụng để phân biệt loài của thịt tươi và thịt chế biến dựa vào histidine peptides phụ thuộc vào loài, tỷ lệ đặc trưng của carnosine với serine (C/E) (Chung & ctv, 1998) Mặc dù, mẫu sắc ký giống nhau ở các cơ khác nhau trong một loài, nhưng có nhiều protein đặc trưng và có nhiều peak protein thay đổi (Toorop & ctv, 1997; Ashoor & ctv,1998) gây khó khăn cho việc phân tích dữ liệu Dựa vào lý do căn bản là chất béo không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, phương pháp LC được phát triển cho việc phát hiện thịt heo và

mỡ heo trong các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến dựa vào tăng tỷ lệ triglyceride có trong acid béo bão hòa với triglyceride chứa trong acid béo không bão hòa (Saeed & ctv, 1989) Tuy nhiên, vì lượng mỡ trong sản phẩm thịt thường thay đổi nên khó xác định lượng thịt giả mạo (bị pha trộn) từ phương pháp dựa vào chất béo Cũng như phương pháp điện di, phương pháp sắc ký có thể phân biệt loài riêng biệt, nhưng phương pháp sắc ký ít hiệu quả trong việc phát hiện loài thịt giả mạo được pha trộn trong các hỗn hợp thịt tươi và thịt chế biến vì tính phức tạp cao của các peak Thêm vào đó, phương pháp sắc ký đòi hỏi trang thiết bị đắc tiền và quy trình chuẩn bị mẫu khó khăn

2.2.2 Phương pháp dựa vào DNA

2.2.2.1 Phương pháp lai DNA

Các nghiên cứu ban đầu sử dụng DNA để phát hiện loài của thịt đã sử dụng những phương pháp đơn giản Nhờ đó mà những probe DNA đã đánh dấu được lai với DNA bộ gen của mẫu thấm trên màn nilong Mô hình thí nghiệm cho một kiểm tra được chỉ ra ở hình 2.4 Sự chuẩn bị probe không đòi hỏi bất kỳ kiến thức trước như tính chính xác về trình tự DNA nghiên cứu Sự gắn kết chuyên biệt về loài của probe với DNA mục tiêu là nhờ probe lai với trình tự bổ sung với probe trên DNA mục tiêu Những trình tự bổ sung với probe được sắp xếp một cách ngẫu nhiên và được tìm thấy xuyên suốt genome như trình tự “satellite”

Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA

3 mẫu thuộc 3 loài: X, Y, và Z; sử dụng probe được chuẩn bị từ loài Y

(Lockley & ctv, 2000)

Ly trích DNA Ly trích DNA

Biến tính DNA và gắn kết lên màng

Tổng hợp probe và đánh dấu

Lai probe với màng

Rửa để loại bỏ probe không gắn kết Phát hiện probe được lai

2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR

Phương pháp PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua vì khả năng khuếch đại của kỹ thuật PCR có thể phát hiện trình tự DNA mục tiêu khi lượng mẫu hạn chế Các phương pháp dựa vào PCR để phân biệt loài của thịt đã được phát triển

từ thập niên trước Tất cả những phương pháp PCR này được phân thành 2 nhóm (Hui, 2006) Đó là Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) và PCR đặc trưng cho loài (species-specific PCR) RAPD khuếch đại nhiều trình tự chưa được biết trước sử dụng các primer không chuyên biệt, dẫn đến kết quả fingerprint đặc trưng cho từng loài (species-specific fingerprints) của sản phẩm PCR được quan sát trên gel điện di Species-specific PCR (species-specific PCR) sử dụng các cặp primer đặc trưng và bảo tồn mà các primer này bắt cặp với những trình tự dùng để phân biệt loài của DNA nhân hay DNA ty thể Vì thế cần phải biết trước về trình tự DNA mục tiêu

để thiết kế primer Sản phẩm PCR sau đó có thể được phân biệt dựa vào kích thước, giải trình tự, hoặc dựa vào những phân tích tiếp theo như đa hình chiều dài phân đoạn (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) hoặc đa hình cấu tạo chuỗi đơn (Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) Ưu điểm của kỹ thuật PCR là tính hiệu quả và ít tốn thời gian

a Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Những primer chuyên biệt hoặc ngẫu nhiên khuếch đại những marker DNA đa hình được sử dụng để phân biệt loài của thịt Những primer chuyên biệt này thường ngắn, kích thước khoảng 10 bp Do trình tự của những primer này chuyên biệt nên không cần biết trước trình tự DNA của loài Trong cùng điều kiện PCR, các primer này sẽ khuếch đại hàng loạt vị trí cho ra nhiều band khác nhau khi điện di Từ đó xác định được band chuyên biệt về loài Những cặp primer khác nhau sẽ cho ra sản phẩm

khác nhau (Lee & ctv, 1994; Cushwa, 1996; Roa & ctv, 1996; Koh, 1998)

Phương pháp RAPD sử dụng những primer bất kỳ dựa trên những trình tự oligonucleotide ngắn khuếch đại nhiều trình tự không xác định cùng một lúc Sau khi điện di trên gel, sản phẩm PCR sẽ cho ra các dạng fingerprint có tính duy nhất cho một loài chuyên biệt Khả năng phân biệt của RAPD-PCR thì gần như không có giới hạn vì sự lựa chọn các primer bất kỳ là không giới hạn Tuy nhiên, không phải tất cả các primer ngẫu nhiên có thể phân biệt một cách thỏa đáng giữa các loài Sàng lọc và lựa chọn kỹ lưỡng các primer là điều quan trọng cho việc áp dụng thành công kỹ

thuật này (Saez & ctv, 2004) RAPD đã được ứng dụng phân biệt loài các động vật nuôi (Koh & ctv, 1998), nhiều loại thịt, sản phẩm thịt (Martinez & ctv, 1999; Bellagamba & ctv, 2003) RAPD được sử dụng để tạo ra những fingerprint rõ ràng từ các sản phẩm chế biến mà trong đó DNA hơi bị biến tính, như các sản phẩm cá muối hoặc xông khói (Martinez, 1997) Mặc dù kỹ thuật này thu được các fingerprint mang thông tin hữu ích trong thời gian ngắn nhưng hiệu quả không được biết trước vì điều kiện chu kỳ hay sự đa hình của các loài ngoại nhiễm Sử dụng những primer dài hơn

và điều kiện khuếch đại chính xác hơn có thể cải thiện tính hiệu quả (Desmarais & ctv, 1998) Vì thế, quy trình RAPD phải được tối ưu và thực hiện một cách chính xác Phân tử DNA thường bị gãy thành những đoạn nhỏ hơn trong các sản phẩm chế biến;

vì thế phân tích RAPD ít được tin cậy để sử dụng phân tích những mẫu đã qua khử trùng và đóng hộp RAPD thuận lợi như là một phương pháp định tính nhanh chóng cho việc phân biệt loài của thịt, nhưng mỗi một lần kiểm tra phải được chạy cùng với một mẫu chuẩn đã được biết trước (Koh & ctv, 1998) Tóm tắt về nguyên lý và ứng dụng của phương pháp RAPD trong phân tích di truyền của những loài vật nuôi được viết bởi Cushwa và Medrano (Cushwa & Medrano, 1996)

b PCR đặc trưng cho loài (Species-specific PCR)

PCR đặc trưng cho loài dùng để phân biệt loài đã được phát triển để khuếch đại một đoạn DNA với sự biến đổi đủ đặc trưng cho loài Các primer xuôi và ngược được thiết kế chuyên biệt cho mỗi loài dựa vào sự sắp gióng của các trình tự DNA có sẵn

từ các gen được chọn Thông tin đầy đủ về trình tự cho phép dự đoán kích thước của sản phẩm, giúp cho việc đọc kết quả trên gel thuận lợi Các gen ty thể như ATPase 8 đơn vị và 6 đơn vị (Tartaglia & ctv, 1998; Kremar & Rencova, 2003), D-loop và gen cytochrome b (Cyt b) (Kocher & ctv, 1989; Burgener & Hübner, 1998; Matsunaga & ctv, 1999; Colombo & ctv, 2000; Herman , 2000), DNA satellite (Guoli & ctv, 1999) các gen actin (Fairbrother & ctv, 1998; Hopwood & ctv, 1999), những yếu tố đặc trưng Art2 ngắn và CR1 dài nằm trải rác trên genome (Tajima & ctv, 2002) và gen hormone phát triển (Brodmann & ctv, 2003) đã được nghiên cứu trong việc xác định loài của động vật, với nhiều phương pháp tập trung vào gen Cyt b như là trình tự mục tiêu Độ đặc hiệu của các cặp primer mà được mã hóa từ trình tự gen Cyt b đã cho phép khuếch đại DNA của cá ngừ để xác định loài cá ngừ đã qua chế biến và trong đồ hộp trên thị trường

b1 Standar-PCR

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ

polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật in vitro

cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn

(tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào)

Sự khuếch đại nhờ những primer oligonucleotid Primer là những phân tử DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp Các primer này gồm có primer

“xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse primer) Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi Sự tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập

Các giai đoạn của PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm

ba giai đoạn (Too , 2001):

¾ Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường ở 94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút

¾ Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc

Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

¾ Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

™ Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m*2n (Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã

hóa)

™ Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu kỳ tiếp theo Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức:

Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x

n : Số chu kỳ

2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

x : Số bản sao của chuỗi mã hóa

+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

ƒ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

ƒ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

ƒ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu là

105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35

– 40

Các thành phần của một PCR

Theo Too (2001), các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm:

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của PCR Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không

có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược và cũng không có những cấu

trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb

- Polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt được sử

dụng rất phổ biến, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng

Taq DNA polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu

đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng

hợp DNA theo hướng 5’→3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C

- Các nucleotid (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA

- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzym polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Phân tích kết quả PCR

Sản phẩm của PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng

của tia UV (bước sóng λ=300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

Tartaglia & ctv (1998) đã phát triển phương pháp PCR chuyên biệt cho bò sử dụng trình tự DNA ty thể đặc trưng cho bò để thiết kế primer Phương pháp cho phép phát hiện thịt bò và bột xương bò ở mức 0,125% Nhờ khuếch đại DNA satellite sử dụng các cặp primer chuyên biệt cho bò, Guoli & ctv (1999) đã phát hiện thịt bò tươi, luộc (100oC, 30 phút) và autoclaved (120oC, 30 phút) mà không có hiện tượng bắt cặp chéo với các loài khác được kiểm tra

b2 Multiplex PCR

Multiplex PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng Multiplex PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể

từ đó multiplex PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online) Phương pháp multiplex PCR thực chất là phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định Chính vì vậy đoạn DNA mục tiêu nhân lên rất nhiều lần và có thể được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Multiplex PCR cho phép phân biệt cùng một lúc nhiều loài với một phản ứng PCR sử dụng một primer universal từ trình tự DNA bảo tồn trên gen cùng với nhiều primer được thiết kế từ trình tự đặc trưng cho từng loài (Matsunaga & ctv, 1999, Rodriguez & ctv, 2003) Thông tin chi tiết về trình tự của nhiều loài có thể tìm kiếm được và do đó sự đa hình về mặt phát sinh loài có thể được xác định dựa vào những primer chuyên biệt về loài Dưới điều kiện phản ứng nghiêm ngặt, những primer cho

ra một sản phẩm chỉ khi có sự hiện diện DNA của loài đặc hiệu với primer Nhờ vào

sự bắt cặp của các primer chuyên biệt loài với trình tự DNA đặc trưng ở mỗi loài, nó

có thể được dùng để kiểm tra sự hiện diện nhiều loài Trong phương pháp này, có thể

sử dụng một primer forward chung (dựa vào vùng bảo tồn trên cytochrome b ở các

loài) và các primer reverse riêng (dựa vào vùng không bảo tồn trên cytochrome b) Phương pháp multiplex PCR được sử dụng để phát hiện nhiều loài của thịt (Meyer & ctv, 1994; Matsunaga, 1999; Behrens, 1999)

b3 Real time PCR

Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn DNA chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành (McPherson & Moller, 2006)

Phương pháp Real – time PCR dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang Trong khi chạy Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu Mẫu xét nghiệm chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít DNA đích Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ DNA chuẩn Nồng độ DNA trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn

Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu Các hóa chất khác nhau dùng trong mục đích này (Weighardt , 2004):

- Phẩm nhuộm chèn vào DNA sợi đôi sẽ phát huỳnh quang: ethidium bromide, SYBR Green I

- Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang: TaqMan probe, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe, Molecular Beacons probe, Scorpions và TaqMan Minor Groove Binder (MGB) probe

Trong đó, kỹ thuật TaqMan probe thường được sử dụng trong việc phân biệt loài (Holland & ctv, 1991) Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong DNA đích Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’

Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu Khi DNA đích tích lũy, probe gắn vào DNA đích nhưng chưa phát quang Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài,

Taq DNA polymerase tiến tới đầu 5’ của probe Hoạt tính 5’Æ3’ exonuclease của Taq DNA polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe

Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên Mức độ huỳnh quang tương ứng với số DNA chuyên biệt mong đợi Khác với SYBR Green I, primer dimer

và các sản phẩm DNA khuếch đại không đặc hiệu sẽ không cho tín hiệu huỳnh quang (McPherson & Moller, 2001)

Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần

Kỹ thuật TaqMan sử dụng các primer chuyên biệt cho loài đã được phát triển để phát hiện thịt bò hoặc thịt heo trong thực phẩm với giới hạn phát hiện từ 0,1 % xuống 0,01% (Lahiff & ctv, 2002; Laube & ctv, 2003)

b4 PCR-RFLP

Chikuni và ctv (1994) đã thiết kế primer cho PCR dựa vào trình tự DNA satellite I của cừu để khuếch đại DNA cừu và dê nhưng không khuếch đại được ở các loài khác như bò, trâu, hươu, ngựa, heo, gà, thỏ Giải trình tự sản phẩm PCR cho thấy 92% tương đồng Tuy nhiên, có 4 vùng enzym cắt giới hạn khác nhau ở cừu và dê vì

thế có thể phân biệt hai loài này bằng enzym cắt giới hạn Sử dụng ApaI cắt sản phẩm

374 bp cừu cho ra hai đoạn 236 bp và 138bp Vùng cắt của enzym này không tồn tại trên sản phẩm PCR của dê Kỹ thuật này gọi là PCR – RFLP Nó được sử dụng rộng rãi để phân biệt loài của nhiều loại thịt (Meyer & ctv, 1995; Borgo & ctv, 1996; Beneke & ctv, 1998; Hopwood & ctv, 1999; Wolf, 1999; Partis, 2000) Hơn nữa, việc phân biệt loài không cần giải trình tự sản phẩm PCR mà chỉ ủ sản phẩm PCR với nhiều enzym cắt giới hạn, rồi sau đó dựa vào kết quả điện di các đoạn DNA mà sau khi ủ với enzym có thể phân biệt được loài của thịt

b5 PCR-sequencing

Giải trình tự trực tiếp của sản phẩm PCR là một kiểm tra xác nhận lý tưởng So sánh trình tự Cyt b trên ngân hàng gen, Brodmann & ctv (2001) cho rằng các động

vật có xương sống tương đồng khoảng 80%, động vật trong cùng một giống tương đồng khoảng 94% Sự tương đồng trên 99% là cùng một loài Trước đây, giải trình tự được cho là tốn kém nhưng nhờ những tiến bộ gần đây trong quá trình giải trình tự nucleotide, phương pháp này ngày nay trở nên đơn giản và nhanh hơn Từ khi việc giải trình tự sản phẩm PCR trở thành một công việc chuẩn trong phòng thí nghiệm mà thực hiện kỹ thuật DNA tái tổ hợp thì dữ liệu về trình tự DNA của các loài động vật

sẽ được hình thành để việc xác nhận rõ ràng (Bossier, 1999) Tuy nhiên, vẫn còn một

số khó khăn cho việc ứng dụng giải trình tự cho hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau

Phương pháp trực tiếp để có thông tin từ sản phẩm PCR là giải trình tự Thông tin có được sẽ sử dụng để xác định nguồn gốc loài của các loại thịt Các nghiên cứu liên quan đến vấn đề này thường có khuynh hướng tập trung khuếch đại trình tự DNA

ty thể, đặc biệt là gen cytochrome b (Lockley & ctv, 2000) DNA ty thể có nhiều ưu điểm hơn DNA nhân ở các nghiên cứu xác định loài của các sản phẩm thịt (Alberts & ctv, 1994) DNA ty thể có khuynh hướng được thừa hưởng từ mẹ và do đó sẽ tránh được sự tối nghĩa về mặt trình tự của mã di truyền ở kiểu gen dị hợp tử DNA ty thể

có tỷ lệ biến dị tương đối cao so với nhiều gen trong nhân Điều này có ý nghĩa trong việc tích lũy đủ những điểm đột biến để cho phép sự phân biệt chính xác những loài

có quan hệ gần với nhau Tuy nhiên, phải chú ý rằng DNA ty thể cũng biểu hiện một mức độ thay đổi trong loài và vì thế phải cẩn thận trong nghiên cứu sự khác biệt về nguồn gốc dựa trên sự đa hình (Chow & ctv, 1993)

b6 PCR-SSCP (PCR- Single Strand Conformational Polymorphism)

PCR được sử dụng để khuếch đại vùng giống nhau của DNA từ những loài khác nhau, thường là một phần của gen cytochrome b ty thể Sản phẩm chuỗi đôi sau đó được biến tính cho ra DNA chuỗi đơn có cấu trúc bậc hai phụ thuộc vào trình tự của

nó Sau khi điện di trên gel polyacrylamide trong điều kiện thích hợp, sản phẩm với những cấu trúc bậc hai khác nhau di chuyển khác nhau trong điện trường và thu được những đoạn khác nhau Sử dụng phương pháp này có thể phân biệt các loài có ít sự khác biệt thậm chí chỉ là sai khác một base (Hayashi ,1996) Phương pháp này có thể phân biệt thịt lợn và thịt lợn lòi (Rea & ctv, 1996)

Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt

(Hui, 2006 )

RAPD-PCR Species-specific PCR

Standard-PCR Multiplex PCR Real time PCR PCR-RFLP PCR-sequencing PCR-SSCP

Lai DNA Dựa vào PCR

Phương pháp dựa vào DNA Các phương pháp phân biệt loài của thịt

Sắc ký Khí Lỏng Lỏng cao áp

AGID

HeoMiễn

dị h

RIA

2.3 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài

2.3.1 DNA ty thể

DNA ty thể là DNA tồn tại trong ty thể DNA ty thể được phát hiện bằng kính hiển vi điện tử (Nass &ctv, 1963) và được phát hiện bằng phương pháp sinh hóa (Ellen &ctv, 1964)

DNA ty thể có dạng vòng DNA ty thể và DNA nhân được cho là tách biệt trong nguồn gốc tiến hóa, với DNA ty thể có nguồn gốc từ genome dạng vòng của vi khuẩn cộng sinh với tổ tiên của tế bào eukaryote ngày nay (thuyết cộng sinh tế bào) Mỗi ty thể chứa khoảng 2-10 bản sao mtDNA (Wiesner & ctv, 1992) Trong các sinh vật hiện có, đa số các protein hiện diện trong ty thể (khoảng 1500 loại khác nhau ở hữu nhũ) được mã hóa bởi DNA nhân, nhưng những gen này được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn, đã được chuyển vào nhân tế bào eukaryote trong suốt quá trình tiến hóa Mặc dù mtDNA được đóng gói bởi các protein và có khả năng sửa chữa DNA, nhưng những chức năng bảo vệ này ít hơn DNA nhân Vì thế mtDNA dễ ảnh hưởng lên sự hư hại do oxi hóa Đột biến ở mtDNA là nguyên nhân các bệnh di truyền từ mẹ

và các bệnh liên quan đến tuổi

Ở người và ở các động vật đa bào nói chung có khoảng 100-10.000 bản sao của mtDNA trong một tế bào (trừ trứng và tinh trùng) (Bogenhagen & Clayton, 1974) Ở động vật hữu nhũ, mỗi phân tử mtDNA gồm 15.000 – 17.000 bp, mã hóa cho 37 gen: 13 gen cho những protein trong chuỗi vận chuyển (polypeptides), 22 cho transfer RNA (tRNA), và 1 trong 2 gen còn lại mỗi gen mã hóa cho một đơn vị lớn và một đơn vị nhỏ của RNA ribosome (rRNA)

¾ 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển (Transport chain)

Được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển

NADH dehydrogenase

(complex I)

ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, MT-ND5, MT-ND6

¾ 2 gen mã hóa rRNA: MT-RNR1 (12S) và MT-RNR2 (16S)

¾ 22 gen mã hóa tRNA

Được trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA

Hình 2.2: Genome của ty thể

http://www.mitomap.org/MITOMAP/mitomapgenome

™ Sự giảm mtDNA của tinh trùng trong quá trình thụ tinh với trứng Tinh trùng

có thể mang một ít ty thể ở phía đuôi như là một nguồn năng lượng để cho tinh trùng hoạt động trên hành trình dài tìm đến với trứng Khi một tinh trùng nào

đó may mắn gắn được với trứng trong quá trình thụ tinh thì đuôi của nó cũng rụng đi Hệ quả là cơ thể mới được tạo thành chỉ chứa ty thể của mẹ truyền cho Năm 1999, Sutovsky và ctv đã làm thí nghiệm trong đó ty thể tinh trùng (có mtDNA) được gắn ubiquytin và nhận thấy chúng bị phá hủy ở phôi (Sutovsky, 1999)

™ Sự thiếu sót của mtDNA tinh trùng để vào trứng ở một số ít sinh vật

Mặc dù có một vài bằng chứng gần đây cho thấy rằng trong một số trường hợp hiếm, bào quan này cũng được di truyền từ bố Người ta cho rằng ty thể có thể đôi khi được di truyền từ bố ở một vài loài như loài trai (Hoeh & ctv, 1991; Zouros & ctv, 1992; Penman & Danny, 2002) Ty thể được di truyền từ bố cũng được tìm thấy ở một vài loài côn trùng như ruồi (Kondo & ctv, 1992), ong (Meusel & Moritz, 1993),

và loài ve (Fontaine & ctv, 2007)

Di truyền của ty thể từ bố có thể gặp trong các trường hợp sau: phôi được dòng hóa, sự loại bỏ ty thể từ bố xảy ra sau, trong điều kiện phòng thí nghiệm

Như vậy không giống với DNA của nhân tế bào, vật chất di truyền của ty thể không có hiện tượng trộn lẫn qua mỗi thế hệ do đó nó thay đổi với tốc độ chậm hơn Điều này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quá trình tiến hóa của con người

với 1 của DNA nhân) Trong khi đó, thịt chế biến thường có DNA bị biến tính Nên việc khuếch đại mtDNA là dễ dàng hơn

Trong các gen của ty thể, gen cytochrome b thường được sử dụng trong việc phát hiện loài (Kocher & ctv, 1989; Irwin & ctv, 1991; Matsunaga & ctv, 1999; Hsieh

& ctv, 2001; Bellagamba & ctv, 2003; Pascoal & ctv, 2005; Maede, 2006) Nhưng không phải sử dụng hết hoàn toàn trình tự gen cytochrome b mà chỉ sử dụng một phần Lý do là kích thước của gen này lớn (khoảng 1140 bp)

Để thuận tiện trong việc nghiên cứu, DNA ty thể thường được ly trích từ cơ

Vì ty thể thực hiện chức năng hô hấp giải phóng năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào, tạo ra một số sản phẩm trung gian cần thiết Do nhu cầu năng lượng là khác nhau đối với các tế bào trong cơ thể và cũng như các loại tế bào nên số lượng ty thể trong tế bào cũng khác nhau và sự sắp xếp ty thể trong tế bào cũng phụ thuộc rất nhiều vào chức năng sinh lý cũng như điều kiện môi trường Vì thế, ở các tế bào như là cơ, gan thì hoạt động cần thiết phải có một lượng lớn năng lượng sinh học tế bào

2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA của các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu

Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự DNA ty thể dài 2001bp của 23 dòng chó Kết quả nghiên cứu cho thấy trên DNA ty thể có trình tự bảo toàn cho cả 23 dòng chó

Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phương pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột xương thịt dựa trên đoạn gen bảo toàn của DNA ty thể bò

Năm 1999, Matsunaga và ctv đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt chế biến Tác giả sử dụng 7 đoạn primer với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài Primer xuôi được thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của DNA ty thể, còn primer ngược được thiết

kế dựa vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài Các cặp primer này cho ra các sản phẩm PCR có kích thước khác nhau tương ứng với 6 loại thịt Các đoạn DNA của dê, gà,

bò, cừu, heo, ngựa lần lượt có kích thước: 157bp, 227bp, 274bp, 331bp, 398bp, 439bp Kết quả PCR được quan sát bằng điện di DNA của dê, bò, cừu, heo, được phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 100oC hay 120oC, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện được ở 120oC Giới hạn thấp nhất của nồng độ DNA

mà phản ứng PCR còn phát hiện được là 0,25 ng

Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv thiết kế cặp primer có tính chuyên biệt cao trên đoạn bảo toàn của gen DNA ty thể Cặp primer này được dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phương pháp PCR Phương pháp này tỏ ra hữu dụng

cả thịt tươi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu,

gà

Một phương pháp để phát hiện những trình tự DNA ty thể của thịt bò, thịt cừu, thịt heo, thịt gà dựa vào PCR đã được phát triển Phương pháp cho phép phát hiện trong hỗn hợp có 0,01% loài mục tiêu (Kremar & Rencova, 2003)

Dalmasso & ctv (2004) đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát hiện nguồn gốc loài của thịt làm nguyên liệu trong sản xuất thức ăn gia súc (thú nhai lại, gia cầm, cá, heo) Primer được thiết kế dựa vào các vùng khác nhau của DNA ty thể (12S rRNA, tRNA và 16S rRNA) sau khi sắp gióng cột với các trình tự có sẵn trên ngân hàng gen Giới hạn phát hiện là 0,004% cho primer cá, 0,002% cho primer thú nhai lại, gia cầm và heo

Năm 2004, Miguel và ctv đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện thịt heo,

bò, cừu, dê trong thịt tươi và thịt chế biến Primer forward chung được thiết kế dựa vào trình tự DNA bảo tồn trên gene RNA ribosome 12S ty thể, reverse primer được thiết kế dựa vào trình DNA chuyên biệt mỗi loài Kích thước khác nhau của các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt ở mỗi loài được phân tách bằng phương pháp điện di Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 1% cho mỗi loài Phương pháp này có thể xác định chính xác những loài heo, bò, cừu, dê; có ích trong việc kiểm tra các sản phẩm thịt hỗn hợp, tránh tình trạng giả mạo hoặc không đúng như đã ghi trên nhãn

Việc xác định nhanh thịt bò có trong thực phẩm là cần thiết để kiểm soát hiệu quả mầm bệnh bò điên Năm 2004, Hong và ctv đã sử dụng phương pháp multiplex

PCR để phát hiện trình tự DNA chuyên biệt của thịt bò trong thực phẩm Đồng thời tác giả cũng sử dụng phương pháp multiplex PCR để đánh giá chất lượng của mẫu kiểm nghiệm nhờ vào việc khuếch đại vùng DNA trên gene ribosome 18 S chuyên biệt ở bò Sản phẩm khuếch đại là đoạn DNA của lactoferrin Tác giả dựa vào sự khác nhau ở trình tự ty thể chuyên biệt để xác định thịt bò Độ đặc hiệu của phương pháp này được xác nhận dựa vào sự vắng mặt của sản phẩm PCR tương đồng có thể phát hiện sử dụng những mẫu thực phẩm liên quan mà không có thịt và bột xương bò, hoặc những mẫu DNA từ động vật có xương sống mà những thứ bỏ đi của chúng thường có trong thức ăn chăn nuôi Phương pháp này có thể phát hiện sự hiện diện của thịt bò trong thực phẩm khi những mẫu thực phẩm này chứa > 0,02 % thịt và bột xương bò Hơn nữa, phương pháp này ít ảnh hưởng bởi việc xử lý nhiệt kéo dài Độ đặc hiệu, thuận tiện và nhạy của phương pháp này cho thấy rằng nó có thể được sử dụng để phát hiện thịt bò

Arslan & ctv (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cách chế biến thịt đối với việc phát hiện thịt bò đã qua xử lý nhiệt bằng kỹ thuật PCR Nhóm tác giả đã xử lý thịt bằng cách luộc ở 97,5oC trong 140 phút, 200 phút, 230 phút; quay ở 200oC trong

80 phút, 120 phút, 150 phút hoặc hấp khử trùng ở 120oC trong 30 phút, 60 phút, 90 phút; rán ở 115oC trong 45 phút, sau đó rán thêm cho đến khi không còn mùi thơm của thịt Sản phẩm khuếch đại là 271 bp của DNA ty thể Kết quả cho thấy rằng ngoại trừ mẫu thịt bò rán ở 80 phút, thịt bò được phát hiện trong tất cả các mẫu còn lại Trịnh Thị Thanh Huyền và ctv (2007) cũng đã sử dụng phương pháp multiplex – PCR để phân biệt thịt cừu, heo, bò Nghiên cứu đã xác định được quy trình thích hợp, trong đó lượng FSIM: RP: RBC: RS lần lượt là 12: 25: 7: 5 pmol, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính ở 94oC/1 phút, bắt cặp ở 54oC/

45 giây, kéo dài ở 72oC/ 1phút Nồng độ thấp nhất của thịt cừu, bò mà phản ứng multiplex-PCR có thể phát hiện là 1 ng/μl