Xác định đa hình kiểu gene ACE I/D bằng kỹ thuật PCR và ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR-RFLP của một số vận động viên điền kinh và bơi lội ở Việt Nam

Đặc biệt, dựa trên các nghiên cứu ở cấp độ phân tử, các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 36 gene đóng vai trò quyết định tới đặc tính sức mạnh và sức bền của các hoạt động thể chất, được ph

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Đề tài:

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GENE ACE I/D BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN

ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GENE ACE I/D BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN

ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM

Họ và tên học viên: PHẠM THỊ NHÀN Người hướng dẫn: TS LUYỆN QUỐC HẢI

Cơ sở đào tạo: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 60420114

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của các VĐV đỉnh cao, bao gồm: yếu tố di truyền, yếu tố về chế độ tập luyện, chế độ dinh dưỡng, cảm xúc, môi trường và thiết bị luyện tập, trí tuệ, khả năng nhận thức và các yếu tố môi trường khác Tuy nhiên, yếu tố di truyền được xác định là quyết định tới 50% vai trò ảnh hưởng lên sự vận động thể chất của con người (Hopkins, 2001) Một báo cáo của Ahmetov và Rogozkin năm 2009 cũng cho rằng, yếu tố di truyền quyết định tới 66% sự thành công ở các VĐV đỉnh cao Bản đồ gene người được công bố năm 2007 cũng đã đưa ra 239 gene có ảnh hưởng đến hoạt động thể chất, trong đó có 214 gene trên nhiễm sắc thể thường, 7 gene trên nhiễm sắc thể X và 18 gene ty thể Đặc biệt, dựa trên các nghiên cứu ở cấp độ phân tử, các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 36 gene đóng vai trò quyết định tới đặc tính sức mạnh và sức bền của các hoạt động thể chất, được phân loại thành các nhóm chỉ thị di truyền liên quan đến thành tích thi đấu của các VĐV thể thao (Ahmetov và cs, 2012) Những công bố này như một nền tảng vững chắc cho việc ứng dụng công nghệ gene trong phân loại, đào tạo và tuyển chọn VĐV

Cần phải khẳng định rằng, thành tích thể thao của một cá nhân bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau trong đó có yếu tố di truyền Các gene đóng vai trò khác nhau trong việc xác định sự khác biệt giữa người này và người kia thông qua sự biểu hiện các tính trạng như: thành phần của sợi cơ và mức tiêu thụ oxy Ví dụ: ở những môn thể thao cần sức bền thì tố chất di truyền (do gene quy định) ảnh hưởng lên đến hơn 50% thành tích có thể đạt được (Hopkins, 2001) Đây là những dữ liệu khoa học từ các nghiên cứu dựa trên dữ liệu di truyền của một số lượng lớn các VĐV thành tích cao Việc phát hiện các biến dị di truyền

có liên quan mật thiết tới thành tích của các VĐV đỉnh cao cho phép chúng ta đánh giá tiềm năng thành tích có thể đạt được ở những người cùng mang các biến dị đó

Trong số các gene có liên quan đến thành tích thể thao, biến dị di truyền

của các gene ACE và ACTN3 được tập trung nghiên cứu nhiều nhất với nhiều

công trình đã được công bố trên các tạp chí khoa học thể thao uy tín trên thế giới, vì chúng được cho rằng có mối quan hệ mật thiết đến thành tích thể thao của VĐV Tuy nhiên, bên cạnh rất nhiều nghiên cứu chỉ ra sự liên quan mật thiết

giữa kiểu gene ACTN3 và ACE tới hiệu suất thể thao của các vận động viên,

cũng có những nghiên cứu cho kết quả phủ nhận giả thuyết này Chính vì thế, việc thực hiện nghiên cứu trên từng quốc gia/dân tộc để xem xét, kiểm chứng lại giả thuyết đã đưa ra là vô cùng cần thiết (Fang Ma và cs, 2013)

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào được tiến hành để khảo sát và đánh giá về tần suất cũng như mức độ ảnh hưởng của 2 gene này đối với hiệu suất thể thao của VĐV người Việt Nam Chính vì vậy, tôi đã lựa chọn đề tài nghiên cứu:

“Xác định đa hình kiểu gene ACE I/D bằng kỹ thuật PCR và ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR-RFLP của một số vận động viên điền kinh và bơi lội ở Việt Nam”

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Xác định kiểu gene ACE I/D của một số vận đông viên điền kinh và bơi

lội bằng kỹ thuật PCR Bước đầu phân tích sự phân bố của các đa hình gene này giữa các nhóm vận động viên khác nhau, xem xét sự ảnh hưởng của các đa hình gene tới thành tích thể thao của vận động viên

- Xác định kiểu gene ACTN3 R577X của một số vận đông viên điền kinh và

bơi lội bằng kỹ thuật PCR-RFLP Bước đầu phân tích sự phân bố của các đa hình gene này giữa các nhóm vận động viên khác nhau, xem xét sự ảnh hưởng của các đa hình gene tới thành tích thể thao của vận động viên

NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

- Hệ thống cơ sở lý luận và thực tiễn trong việc nghiên cứu, giải mã gene người nói chung và gene của các tài năng thể thao nói riêng

- Tiến hành thu thập mẫu của các VĐV điền kinh và bơi lội cũng nhƣ các mẫu đối chứng để làm mẫu nghiên cứu

- Xây dựng quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu tế bào niêm mạc miệng và mẫu máu trên thẻ FTA

- Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại và xác định kiểu gene ACE I/D và

ACTN3 R577X

- Tối ƣu hóa phản ứng PCR để khuếch đại và xác định kiểu gene ACE I/D

- Tối ƣu hóa phản ứng PCR-RFLP để khuếch đại và xác định kiểu gene

ACTN3 R577X

- Phân tích tần số kiểu gene ACE I/D và ACTN3 R577X của các đối tƣợng

nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu, giải mã hệ gene người

1.1.1 Giới thiệu chung về hệ gene người

Hệ gene người chứa toàn bộ thông tin di truyền của con người Những hiểu biết về hệ gene người là tiền đề cho việc ứng dụng di truyền phân tử trong lĩnh vực y học và các lĩnh vực nghiên cứu khoa học khác

Lịch sử về giải trình tự DNA người được bắt đầu vào năm 1977 khi Sanger công bố phương pháp xác định thứ tự các nucleotide của phân tử DNA Cùng năm đó, gene người đầu tiên cũng được giải mã thành công Năm 2003, sau 13 năm nghiên cứu, dự án hệ gene người dưới sự đứng đầu của James Watson (Viện sức khỏe quốc gia - Mỹ) và sau đó là Francis Collin đã hoàn tất trước thời hạn 2 năm, hàng nghìn trình tự hệ gene người đã được giải mã Thành công này

đã mở ra triển vọng mới trong việc chẩn đoán và chữa trị các bệnh cho con người Trình tự của hệ gene người bao gồm 2.851.330.913 nucleotide, nằm trong phần euchromatic của hệ gene Chúng bị dán đoạn bởi 341 chỗ trống (gaps), trong đó 33 gaps dài khoảng 198 Mb là heterochromatin và 308 gaps (dài khoảng 28 Mb) là euchromatin Do vậy, hệ gene euchromatin dài xấp xỉ 2.88 Gb

và hệ gene người tổng thể dài xấp xỉ 3.08 Gb (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004; Elizabeth, 2012) Mặc dù các trình tự về hệ gene người được xác định gần như hoàn chỉnh bởi trình tự DNA, nhưng những hiểu biết về chức năng của tất cả các gene lại chưa được rõ ràng

Hệ gene người đơn bội chứa khoảng 20.000 gene mã hóa protein, ít hơn nhiều so với dự đoán Các trình tự mã hóa protein chỉ chiếm một phần nhỏ của

bộ gene (chiếm khoảng 1,5%), phần còn lại liên quan đến các phân tử RNA không mang mã, các trình tự DNA điều hòa, LINEs, SINEs, introns và các trình

tự chưa biết chức năng Với chiều dài tổng thể của hệ gene người khoảng 3 tỷ cặp base pair (bp), hệ gene người được tổ chức trong 22 cặp nhiễm sắc thể thường, nhiễm sắc thể X (1 nhiễm sắc thể với nam và 2 nhiễm sắc thể với nữ giới) và 1 nhiễm sắc thể Y (chỉ có ở nam giới) Các phân tử DNA dạng thẳng

chứa trong nhân tế bào DNA ty thể dạng vòng có trong ty thể (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001)

Thành phần của hệ gene người thường phân chia thành các trình tự DNA mang mã và không mang mã DNA mang mã là các trình tự có thể phiên mã sang mRNA và dịch mã sang protein trong quá trình sống, những trình tự này chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong hệ gene (khoảng dưới 2%) DNA không mang mã chiếm khoảng hơn 98% trong hệ gene và không được sử dụng để mã hóa protein Một số DNA không mang mã chứa các gene cho các phân tử RNA với những chức năng sinh học quan trọng, gọi là RNA không mang mã Các phân tử RNA không mang mã (ncRNA) có vai trò quan trọng trong tế bào, đặc biệt trong nhiều phản ứng tổng hợp protein và quá trình chế biến RNA Hệ gene người chứa các gene mã hóa cho 18.400 ncRNA bao gồm tRNA, rRNA, microRNA và các gene RNA không mang mã khác

Ngoài ra, DNA không mang mã cũng bao gồm các pseudogenes, introns, vùng không dịch mã của RNA, trình tự DNA điều hòa, trình tự DNA lặp lại và các trình tự liên quan đến nhân tố di truyền vận động (Ken, 2007; Lisa, 2008)

Hệ gene người có nhiều trình tự điều hòa gene khác nhau có chức năng quan trọng trong việc kiểm soát sự biểu hiện của gene Các trình tự này được biết đến

từ những năm 60 của thế kỷ 19 và chiếm khoảng 8% trong hệ gene (Dunham và

cs, 2012) Khoảng 8% hệ gene người chứa các trình tự DNA lặp lại Các trình tự này khác nhau ở từng cá thể và thậm chí ở cả các cá thể có mối quan hệ gần gũi

Vì vậy, các trình tự này có thể được sử dụng để xét nghiệm DNA phả hệ và phân tích DNA pháp lý Các trình tự lặp lại ít hơn 10 nucleotide được gọi là các trình

tự microsatellite Trong đó các trình tự lặp trinucleotide có tầm quan trọng đặc biệt vì đôi khi các trình tự này xảy ra trong vùng mã hóa protein và có thể dẫn đến rối loạn di truyền Ví dụ, bệnh Huntington là kết quả của các trình tự lặp

trinucleotide xảy ra bên trong gene Huntingtin trên nhiễm sắc thể số 4 Các yếu

tố di truyền vận động (transposons) là các trình tự DNA có thể sao chép và chèn bản sao của chúng ở các vị trí khác trên hệ gene của vật chủ Các yếu tố này

gene người có thể được phân loại thành LTR (long terminal repeat) retrotransposons (chiếm 8,3% hệ gene), SINEs (chiếm 13,1% hệ gene) bao gồm các yếu tố Alu, LINEs (chiếm 20,4% hệ gene) và các transposons DNA loại II (chiếm 2,9% hệ gene) (Dunham và cs, 2012)

Hình 1 1 Phân loại gene người theo chức năng của các protein được dịch mã

(http://www.pantherdb.org)

Bộ gene người có trình tự lặp lại và không lặp lại: Nhóm DNA lặp lại nhiều chiếm khoảng 10% tổng lượng DNA của tế bào, thường là các đoạn DNA ngắn dưới 10 bp, mức độ lặp lại có thể tới 105 – 107 một trình tự DNA nào đó trong một tế bào DNA lặp lại nhiều lần nằm quanh tâm động và hai đầu nhiễm sắc

Hình 1 2 Sơ đồ tổ chức cấu trúc bộ gene người (Tom và Andrew, 1999)

thể, không được phiên mã Nhóm DNA lặp lại ít chiếm khoảng 25%, thường là các đoạn DNA ngắn khoảng 100 bp, mức độ lặp lại một trình tự nào đó khoảng

1000 – 100.000 lần Nhóm này bao gồm các gene chịu trách nhiệm tổng hợp tRNA và rRNA DNA nhóm này được phiên mã nhưng không được dịch mã Nhóm DNA không lặp lại chiếm khoảng 64% bao gồm DNA của các gene cấu trúc mã hóa các phân tử protein DNA này được phiên mã và dịch mã (Hình 1 1)

Bộ gene người có trình tự mã hóa và không mã hóa (Hình 1 2) Các gene mã hóa RNA - không mã hóa cho protein cấu trúc chia làm bốn loại:

- RNA vận tải (tRNAs): có chức năng vận chuyển axit amin

- RNA ribosome (rRNAs): thành phần cơ bản của ribosome

- RNA hạch nhân nhỏ (small nucleolar RNA hay snoRNA) cần thiết cho quá trình xử lý rRNA, biến đổi base trong vùng hạch nhân

- RNA nhân nhỏ (small nuclear RNA hay snRNA) là thành phần chính của splicesome: bộ máy phân tử cắt các intron khỏi pre-mRNA ở trong nhân

Ngoài ra còn có thể có các RNA khác không mã hóa protein với biểu hiện ở mức thấp hơn Song song với đó thì còn có các gene mã hóa cho protein tạo ra

bộ protein Gene mã hóa protein có các đặc điểm làm cho bộ protein của người rất phong phú

1.1.2 Ứng dụng và triển vọng của nghiên cứu hệ gene người

Hiện nay, những hiểu biết về hệ gene người đang được ứng dụng ngày càng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực y - sinh học và pháp lý Kết hợp với nền khoa học công nghệ hiện đại, nhiều bệnh tật di truyền được phát hiện và chữa trị Đặc biệt, các bệnh liên quan đến đến đột biến bất thường nhiễm sắc thể gây ra các hội chứng như Down, Turner, Klinefelter, Edwards, … được phát hiện sớm ở thai kì (Glenn và cs, 2012; Joy và cs, 2012) Trên cơ sở đó có thể tìm ra các phương pháp sàng lọc, chữa trị nhằm sinh ra những cơ thể khỏe mạnh

Bên cạnh đó, liệu pháp gene cũng là một kỹ thuật sử dụng gene để ngăn ngừa

và điều trị bệnh tật Một số hướng nghiên cứu của liệu pháp gene như: Thay thế gene bệnh, gene đột biến bằng bản sao của gene khỏe mạnh, làm bất hoạt gene

bệnh Liệu pháp gene là hướng điều trị đầy hứa hẹn cho các bệnh di truyền, ung thư và một số bệnh truyền nhiễm do virus Hiện nay, liệu pháp gene đã được ứng dụng trong việc chữa trị một số bệnh như: Parkinson (Nikhil, 2007), bệnh ung thư (Kenneth, 1994), bệnh suy giảm miễn dịch (Hacein-Bey-Abina và cs, 2003) Các trình tự lặp lại ngẫu nhiên trên hệ gene người (Short Tandem Repeat - STR) cũng được sử dụng trong lĩnh vực y sinh học, pháp lý Đây là các đoạn lặp ngắn, số lần lặp lại đặc trưng cho mỗi cá thể Nhờ đó STR được sử dụng trong việc nhận dạng cá thể người, truy tìm tội phạm và xác định mối quan hệ huyết thống trong gia đình (Christian và cs, 2001)

Hướng nghiên cứu xác định các đa hình gene, tần suất và mối liên quan của các đa hình gene với những tính trạng hoặc bệnh tật đặc trưng cũng là hướng nghiên cứu được đặc biệt quan tâm hiện nay Dự án Hapmap quốc tế được thực hiện bởi sự hợp tác của các nhà khoa học từ nhiều nước, như: Nhật Bản, Anh, Canada; Trung Quốc, Nigeria và Mỹ (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov) là dự án tiêu biểu cho hướng nghiên cứu này

1.2 Nghiên cứu, giải mã gene của các tài năng thể thao

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bản đồ gene người liên quan đến thành tích thể thao đã được Wolfarth và cộng sự bắt đầu có những báo cáo định kỳ 2 năm 1 lần từ năm 2000 cho đến nay Báo cáo này cập nhật và thống kê các công trình nghiên cứu trên khắp thế giới về nhiều vấn đề liên quan như: sự bền vững của hệ thống tim mạch, sức bền của các VĐV đỉnh cao, sức mạnh của cơ bắp, các tính trạng liên quan đến thành tích thể thao khác Báo cáo này xuất hiện đầu tiên vào năm 2000 (gần như cùng lúc với công bố bản thảo về hệ gene người) và chỉ ra 29 vị trí gene có liên quan đến thành tích thể thao của VĐV Đến năm 2004 thì số lượng các gene này đã tăng 5 lần với

140 vị trí gene trên nhiễm sắc thể thường, 4 vị trí gene trên nhiễm sắc thể giới tính

và 16 vị trí gene trên hệ gene ty thể Đến năm 2006 - 2007 đã có tổng số 221 vị trí gene trên nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính X, 18 vị trí gene trên hệ gene ty thể Bảng 1.1 cho ta thấy sự quan tâm của giới khoa học trong lĩnh vực

này ngày càng nhiều, số lượng gene liên quan đến thể thao được công bố ngày càng tăng.

Bảng 1 1 Số lượng các nghiên cứu về gene có liên quan đến thành tích thể thao (Bray và cs,

2007)

Có quan điểm cho rằng tăng chức năng của một hoạt động này có thể làm cản trở một hoạt động khác Quan điểm này được chứng minh bằng các nghiên cứu về các VĐV tầm cỡ thế giới thi đấu ở nội dung 10 môn phối hợp, các VĐV

có thành tích tốt ở nội dung chạy nhanh 100 m, đẩy tạ, nhảy xa và 110 m vượt rào (các môn liên quan đến sức mạnh và tốc độ) thường thi đấu không thành công ở nội dung chạy 1500 m (cần sức bền) (Van Damme và cs, 2002) Nói chung, những phát hiện này được dựa trên một nguyên lý cơ bản là ảnh hưởng của nền tảng di truyền đến năng lực của VĐV; những VĐV thường có ưu thế ở nội dung này (đòi hỏi phải có tốc độ/sức mạnh như chạy nhanh) thì lại bị hạn chế ở nội dung khác (đòi hỏi có sức bền như marathon) (Giuseppe và cs, 2009)

Có nhiều hệ thống trong cơ thể liên quan đến các hoạt động thể thao (Bảng 1 2) Một ví dụ, chạy xa liên quan đến các hệ thống như co mạch, hô hấp, hệ thống hormol, hệ thống điều hòa nhiệt, thần kinh cơ… Mỗi hệ thống này có thể bị ảnh hưởng bởi một số lượng gene nhất định Có nhiều mối tương tác giữa các gene với nhau và giữa gene với môi trường Mối tương tác này là hết sức phức tạp

Gene xác định tiềm năng cho sự phát triển nhiều đặc trưng cấu trúc và chức năng quan trọng trong việc xác định khả năng thể thao Ví dụ, để trở thành một VĐV bóng rổ cấp quốc tế, VĐV đó phải có sự kế thừa gene chiều cao của bố

mẹ Thông qua các nhân tố môi trường như: chế độ dinh dưỡng, huấn luyện thì tiềm năng di truyền (tức là các gene) mới được biểu hiện mạnh (James, 2001)

Bảng 1 2 Ảnh hưởng của gene tới những đặc điểm của cơ thể (Hopkins, 2001)

Có những tính trạng bị tác động nhiều bởi gene (như chiều cao), nhưng cũng có những tính trạng phụ thuộc nhiều vào yếu tố môi trường (như vòng bụng) Gene xác định tốc độ và phạm vi năng lực của mỗi người trước những tác động của quá trình đào tạo, chế độ dinh dưỡng và các nhân tố môi trường khác

Trong những năm gần đây, sự phát triển của khoa học và công nghệ đã cho phép xác định ảnh hưởng của di truyền tới năng lực của VĐV Việc kiểm tra DNA là một cơ hội để khám phá những ưu thế di truyền của một VĐV, từ đó lựa chọn cho VĐV đó cho những môn thi đấu phù hợp Yếu tố di truyền được xem là có ảnh hưởng lớn tới độ khỏe, kích thước cơ và thành phần sợi cơ (nhanh và chậm), dung tích phổi, hấp thụ oxy, mềm dẻo và sức bền (James, 2001)

Bản đồ gene người 2007 đã đưa ra 239 gene liên quan đến hoạt động thể chất, cùng với 7 gene nằm trên nhiễm sắc thể X Thêm vào đó, 18 gene ty thể cũng được chứng minh là có liên quan đến họat động thể chất (Hình 1 3; Hình 1

4 và Bảng 1 3)

Hình 1 3 Bản đồ bao gồm toàn bộ các gene có mối liên hệ đến khả năng thể thao (Bray và

cs, 2007) (còn nữa)

Hình 1 3 Bản đồ bao gồm toàn bộ các gene có mối liên hệ đến khả năng thể thao (Bray và

cs, 2007) (tiếp)

Hình 1 4 Những gene ty thể có mối liên hệ với kiểu hình ảnh hưởng đến khả năng thể thao

(Bray và cs, 2007)

Bảng 1 3 Ký hiệu, tên đầy đủ và vị trí các gene có liên quan tới khả năng thể thao (Bray và

cs, 2007)

Gene hoặc

ACADVL Acylcoenzyme A dehydrogenase, very long chain 17p13p11

ANG Angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5 14q11.1q11.2

ATP1A2 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 2 (+) polypeptide 1q21q23

ATP1B1 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide 1q22q25

CASR Calciumsensing receptor 3q21q24

CETP Cholesteryl ester transfer protein, plasma 16q21

CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,

ATPbinding cassette (subfamily C, member 7)

7q31.2

FABP2 Fatty acid binding protein 2, intestinal 4q28q31

HIF1A Hypoxiainducible factor 1, alpha subunit 14q21q24

HLAA Major histocompatibility complex, class I, A 6p21.3

IGFBP1 Insulinlike growth factor binding protein 1 7p13p12

IGFBP3 Insulinlike growth factor binding protein 3 7p13p12

KCNQ1 Potassium voltagegated channel, KQTlike subfamily,

member 1

11p15.5

LAMP2 Lysosomalassociated membrane protein 2 Xq24

LEPR Leptin receptor 1p31

MTTD Transfer RNA, mitochondrial, aspartic acid mtDNA 75187585

MTTE Transfer RNA, mitochondrial, glutamic acid mtDNA 14674 – 14742

MTTI Transfer RNA, mitochondrial, isoleucine mtDNA 42634331

MTTL1 Transfer RNA, mitochondrial, leucine 1 (UUR) mtDNA 3230 – 3304

MTTL2 Transfer RNA, mitochondrial, leucine 2 (CUN) mtDNA 12266 – 12336

MTTM Transfer RNA, mitochondrial, methionine mtDNA 4402 – 4469

MTTS1 Transfer RNA, mitochondrial, serine 1 (UCN) mtDNA 7445 – 7516

MTTT Transfer RNA, mitochondrial, threonine mtDNA 15888 – 15953

MTTY Transfer RNA, mitochondrial, tyrosine mtDNA 5826 – 5891

NOS3 Nitric oxide synthase 3 (endothelial cell) 7q36

MTTL2 Transfer RNA, mitochondrial, leucine 2 (CUN) mtDNA 12266 – 12336

MTTM Transfer RNA, mitochondrial, methionine mtDNA 4402 – 4469

PPARG Peroxisome proliferative activated receptor, gamma 3p25

PPARGC1A Peroxisome proliferative activated receptor, gamma,

coactivator 1, alpha

4p15.1

SCGB1A1 Secretoglobin, family 1A, member 1 11q12.3q13.1

SERPINE1 Serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade E (nexin,

plasminogen activator inhibitor type 1), member 1

SLC25A4 Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine

nucleotide translocator), member 4

4q35

TK2 Thymidine kinase 2, mitochondrial 16q22q23.1

TNF Tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) 6p21.3

VDR Vitamin D (1,25 –dihydroxyvitamin D3) receptor 12q13.11

Tuy nhiên, để xác định những gene thích hợp ảnh hưởng đến tố chất của VĐV là rất khó khăn vì mỗi gene chỉ là một phần nhỏ trong cả một tổng thể di truyền Trong thực tế, chỉ thông qua một gene đơn để xác định tiềm năng của một VĐV không thể đưa ra một kết luận chính xác và có thể dẫn đến lạc hướng trong lĩnh vực thể thao Nhiều gene trong số này liên quan tới kiểu hình như hàm lượng cholesterol tổng số và HLD-cholesterol (lipoprotein cholesterol có tỷ trọng cao) lại có liên hệ hạn chế tới hoạt động thể thao Hơn nữa, nhiều kiểu gene được công bố cũng chỉ được nghiên cứu với những người ở một khu vực địa lý nhất định (mang tính đặc thù địa lý) Do đó, một số gene cũng không thật cần thiết đối với những người ở khu vực địa lý khác (Giuseppe và cs, 2009) Do vậy, cần phải có những nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gene và kiểu hình

sử dụng một số lượng người lớn nhất có thể ở các quốc gia khác nhau làm đối tượng nghiên cứu

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, việc kiểm tra và tuyển chọn VĐV vẫn chưa có một hệ thống khoa học hoàn chỉnh, chủ yếu vẫn dựa trên kinh nghiệm của huấn luyện viên thông qua các giải đấu Chính điều này đã làm cho thành tích thể thao Việt Nam luôn rất khiêm tốn Để đạt được thành tích trong các giải đấu quốc gia và đuổi kịp thành tích các nước trong khu vực và trên thế giới, chúng ta cần quan tâm tới các yếu tố tác động đến năng lực thể thao của các VĐV trong quá trình đào tạo

và tuyển chọn, đặc biệt cần bổ sung thông tin về di truyền Việc tuyển chọn một cách khoa học và đúng đắn sẽ giúp tìm được các VĐV có năng lực, phát huy tối

đa sở trường và thế mạnh của họ

Việc nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố di truyền tới tiềm năng thể thao của các VĐV vẫn còn là một lĩnh vực nghiên cứu khá mới mẻ ở Việt Nam Đây là hướng nghiên cứu hay, cần được ưu tiên tiếp cận để có thể góp phần nâng cao thành tích thể thao của Việt Nam trên đấu trường quốc tế, đồng thời tránh được

sự lãng phí về thời gian, tiền bạc cho ngành thể dục thể thao nước nhà

1.2.3 Ảnh hưởng của di truyền đến sức bền, sức nhanh và sức mạnh của VĐV

Phosphoryl oxi hóa là hệ thống cung cấp năng lượng chủ yếu trong các hoạt động thể thao Hệ thống vận chuyển oxy trong cơ chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như mật độ mao mạch, hàm lượng ty thể, thành phần sợi cơ (tỷ lệ cơ co chậm và

cơ co nhanh) Do đó, có thể kết luận bất kì gene nào giúp tăng khả năng hấp thụ

oxy (như gene EPO), mật độ mao mạch (như gene VEGF), hàm lượng ty thể (như gene PPARδ) và sợi cơ co chậm (như gene ACTN2) là những gene có lợi cho sức bền của các VĐV (Fallahi và cs, 2011) Theo Giuseppe và cs (2009)

tăng sức bền đồng nghĩa với tăng chức năng của ty thể (tăng sự biểu hiện gene ty thể và hoạt tính của enzyme ty thể) Trong các nghiên cứu ban đầu về mức độ

tiêu về sức bền), yếu tố di truyền có thể ảnh hưởng đến 50% (Bouchard và cs, 1988) Bên cạnh đó, những nghiên cứu tiếp theo về các cặp song sinh đã cho thấy yếu tố di truyền có thể ảnh hưởng cao hơn (Maes và cs, 1996) Sự khác nhau về kiểu hình sức bền, tăng từ 5 tới 60% giữa các cá thể (Bouchard và cs, 1988) Tất cả các nghiên cứu đều khẳng định gene là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng đến sức bền Với những tiến bộ về kỹ thuật di truyền cho chúng ta biết những chỉ thị phân tử, những gene đặc hiệu và đa hình có thể ảnh hưởng đến sức bền Để phát hiện được sự khác nhau về mặt di truyền giữa các

cá thể, một vài chỉ thị và kĩ thuật đã được sử dụng Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, hay là RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) ứng dụng trong xác định sự khác nhau về các gene ứng viên trong nhân và ty thể cũng đã bắt đầu được nghiên cứu Gần đây, đa hình đơn nucleotide (SNPs – single nucleotide polymorphisms) của những gene này là một trong những mối quan tâm hàng đầu về nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố di truyền đến tiềm năng thể thao Với quy mô nghiên cứu ngày càng lớn và có ý nghĩa thống kê tốt hơn, những chỉ thị kết hợp với haplotype cũng đã được phân tích Hầu hết các nghiên cứu trọng tâm đã lựa chọn những gene dựa trên những hiểu biết về sinh lý và hóa sinh của tính trạng sức bền Số lượng những gene tiềm năng ảnh hưởng đến sức bền là rất lớn, và ngày càng tăng (Bảng 1.8) Dựa vào chức năng có thể chia những gene ứng viên ảnh hưởng đến sức bền thành các nhóm khác nhau: nhóm

điều hòa hormone (EPO, EPOR, ADR…), nhóm chuyển hóa trao đổi chất và sinh năng lượng (CKMM, mtDNA…), nhóm chuyển hóa lipit (LPL, CPT,

LDLR…), nhóm tổng hợp hormone và các thụ thể hormone sinh trưởng (GH, GHR, IGF…), và nhóm khác (ACE, HSP70, TNFA…) (Claude và cs, 2012)

Bảng 1 4 Những gene ảnh hưởng đến sức bền của VĐV (Ildus và cs, 2012)

Gene Vị trí Đa hình gene

Chỉ thị liên quan đến sức bền

Nghiên cứu cho kết quả khẳng định

Nghiên cứu cho kết quả phủ định

Số mẫu nghiên cứu

Tổng số VĐV

Số mẫu nghiên cứu

Tổng số VĐV

ACTN3 11q13.1 R577X (rs1815739 C/T) 577X 3 518 11 2382

ADRA2A 10q24-q26 6,7/6,3 kb 6,7 kb 1 148 - -

ADRB2 5q31-q32 Gly16Arg (rs1042713 G/A) 16Arg 2 629 - -

ADRB3 8p12-8p11.1 Trp64Arg (rs4994 T/C) 64Arg 1 100 1 81

đa hình hoặc đa hình đơn

m.152C 1 100 - -

poly(C≥7) stretch at m.568-573

tố sinh học xác định đến sức nhanh và sức mạnh của VĐV gồm: sức mạnh của

cơ, tỷ lệ cơ co nhanh/cơ co chậm, khả năng hô hấp trong điều kiện yếm khí,…

Do đó, những gene ảnh hưởng đến các nhân tố trên đều có thể coi là những gene liên quan đến tiềm năng sức nhanh, sức mạnh của VĐV (Bảng 1 5)

Bảng 1 5 Những gene ảnh hưởng đến sức nhanh và sức mạnh của VĐV (Ildus và cs, 2012)

Gene Vị trí Đa hình gene

Chỉ thị liên quan đến sức nhanh/sức mạnh

Nghiên cứu cho kết quả khẳng định

Nghiên cứu cho kết quả phủ định

Số mẫu nghiên cứu

Tổng

số VĐV

Số mẫu nghiên cứu

Tổng

số VĐV

 Một số gene tiêu biểu quy định sức mạnh và sức bền của VĐV

Các nhà khoa học đã tìm ra được gene quy định sức mạnh của VĐV, những gene này có ảnh hưởng lớn trong các môn thể thao đòi hỏi tính mạnh như: bóng

đá, cử tạ, và chạy nhanh Có thể kể đến một số gene tiêu biểu như:

Gene ACTN3 : nằm trên nhiễm sắc thể số 11 Là gene cấu trúc mã hóa cho

protein α – actinin- 3 (một loại protein thuộc họ protein liên kết với actin Actinin

- α), nó có vai trò trong việc xác định phân phối loại sợi, thúc đẩy sự hình thành

nhanh chóng co giật sợi cơ ACTN3 có hai alen là (R) và (X), biến thể X là do

xuất hiện một stop codon sớm ở trong trình tự mã hóa, do đó nó là alen phi

nghĩa Mỗi người đều có hai bản sao của gene ACTN3, mỗi bản sao được thừa

hưởng từ cha hoặc mẹ, do vậy có 3 kiểu tổ hợp alen khác nhau:

XX: Sự kết hợp giữa hai alen X gây ra thiếu hụt α -actinin -3, tạo ra nhiều sợi co chậm và sẽ phát huy tối đa lợi thế ở các môn thể thao đòi hỏi sức bền như marathon Ước tính khoảng 18% dân số châu Âu có kiểu gene đồng hợp tử này

và họ không thể tạo ra protein α-actinin-3

RX: tạo ra lượng sợi co nhanh và sợi co chậm bằng nhau

RR: Sự kết hợp giữa hai alen R tạo ra nhiều sợi co nhanh, phù hợp với các môn thể thao đòi hỏi sức mạnh hay tốc độ (Yang và cs, 2003)

Gene ACE: Gene ACE nằm trên nhiễm sắc thể 17 Gene ACE có 20,546 bp

và gồm 25 exon Sau quá trình phiên mã và thành thục mRNA, mRNA của ACE

có 4,195 base và trực tiếp tổng hợp protein chứa 1,306 axit amin Tính đa hình

của ACE I/D tương đương với sự có mặt hoặc vắng mặt của một trình tự lặp lại dài 287 bp trong intron 16 Người có kiểu gene đồng hợp DD có mức độ ACE

hoạt động cao nhất và thấp nhất là người có kiểu gene đồng hợp II Phần lớn các

nghiên cứu đều thấy gene ACE có ảnh hưởng tới độ bền, độ nhanh của các

VĐV Trong đó alen I được coi như là alen có lợi đối với các VĐV thi đấu ở các nội dung đòi hỏi sức bền Trong khi đó alen D lại là alen có lợi cho các VĐV thi đấu ở các môn đòi hỏi sức nhanh (Ian, 2006)

Gene ADRB2: ADRB2 đóng vai trò quan trọng trong chức năng của tim và

phổi nghĩa là biến thể của gene này liên quan tới VO2 max, do đó làm tăng tính bền ADRB2 có 2 biến thể là alen C ( giúp tăng tính bền) và alen G (tăng BMI

và giảm VO2 max)

COL6A1: có 2 biến thể C và T

Kiểu gene CC (so với TC và TT): liên quan tới các bệnh phức tạp về cơ Kiểu gene TT (so với TC và CC): liên qua tới làm tăng sức bền

ADRB3: Nằm trên nhiễm sắc thể số 8, có 2 biến thể alen C và alen T:

Alen C: Liên quan đến sức bền

Kiểu gene TT: không liên quan đến sức bền hoặc khỏe so với nhóm đối chứng

Kiểu gene TC: liên quan tới sức bền so với đối chứng, nhưng không khỏe hơn so với đối chứng

Kiểu gene CC: hiếm có, liên quan tới cả độ bền và độ khỏe

ADRB1: Nằm trên nhiễm sắc thể số 10, có 2 alen: alen C và alen G

Alen C làm liên quan tới việc làm tăng VO2 max, do đó làm tăng sức bền Alen G làm giảm VO2 max (Giuseppe và cs, 2009)

1.2.4 Ảnh hưởng của di truyền tới cơ, dây chằng và gân

Bên cạnh các nghiên cứu ảnh hưởng của di truyền đến sức bền, sức nhanh

và sức mạnh của VĐV, cũng đã có những nghiên cứu đề cập tới ảnh hưởng của một số gene đến trạng thái của cơ, dây chằng và gân

Khả năng của cơ thể cung cấp năng lượng cho cơ hoạt động là một yếu tố quan trọng với một VĐV thành tích cao Có thể kể đến một số gene có vai trò

trong cung cấp năng lượng của cơ thể như: CK-MM, AMPD1

Gene CK-MM (creat kinase isoenzyme MM): được coi là gene chịu trách

nhiệm cho tái tạo ATP trong khi co cơ.Vùng 3’ UTR của gene CKMM có đa

hình A/G ảnh hưởng đến sự ổn định của mRNA và làm thay đổi biểu hiện gene

Nhiều nghiên cứu cho thấy đa hình A/G có liên quan tới sự hoạt động M-CK

trong tế bào cơ

AMPD1 (Adenosine monophosphate deaminase 1): là một enzyme hoạt

động cao trong cơ xương, đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng của cơ

Họ PPAR (PPARα, PPARγ, PPARδ): Nhiều nghiên cứu cho thấy các gene

trong họ PPAR (PPARα, PPARγ, PPARδ) có liên quan đến cơ Những biến thể của gene PPARγ (Peroxisme proliferator activated receptor-γ) thường liên quan

tới khả năng hấp thu glucose của cơ và làm chỉ số cơ thể BMI thấp hơn đối với

cả những người là VĐV cũng như không phải là VĐV Kiểu gene này thường liên quan tới các cuộc thi chạy ở các cự ly: ngắn, trung bình và dài

PPARγC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α):

tổng hợp một protein điều hòa liên quan tới chuyển hóa năng lượng Gene

PPARγC1α liên quan tới việc làm tăng số lượng ti thể và liên quan tới sự chiếm

ưu thế của sợi cơ co chậm loại I Những biến thể của gene này thường liên quan

tới sức bền Tăng mRNA của gene PPARGC1α giúp phục hồi cơ

Gene HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1-α): thường có ảnh hưởng đến

khả năng hấp thụ oxy và bổ sung năng lượng trong cơ Biến thể của HIF-1α làm

tăng hoạt hóa các gene giữ vai trò chuyển hóa năng lượng và vận chuyển oxy tới

cơ HIF-1α có vai trò “nhận biết” mức độ oxy trong tế bào, và thay đổi mức độ

oxy bởi cường độ làm việc của cơ Những biến thể của gene liên quan tới ưu thế sợi cơ co nhanh loại II và do đó thích hợp cho các môn có nền tảng là sức mạnh

Gene VDR (vitamin D receptor): liên quan tới kích thước và sức mạnh của

cơ Biến thể của gene VDR liên quan tới tổng khối lượng cơ cao và do đó giúp

cơ khỏe hơn Sự biểu hiên của VDR giảm cùng với tuổi

Gene VEGF: liên quan tới sự tạo mạch Hệ thống mạch cần nhận những tín

hiệu để sinh trưởng, VEGF bổ sung oxygen trong cơ và ảnh hưởng tới sức bền

của cá thể

Gene MSTN (myostatin): nằm trên nhiễm sắc thể số 2, ở vạch băng 32.2,

kéo dài từ base 190,920,425 đến base 190,927,454, có vai trò điều hòa sự sinh

trưởng của cơ xương Gene MSTN mã hóa cho protein cấu trúc, có tên là

Myostatin Myostatin thuộc họ TGFβ, một nhóm protein có vai trò giúp kiểm

soát sự sinh trưởng và phát triển của mô trong cơ thể Myostain đã được nghiên cứu ở chuột, bò và nhiều động vật khác, nó có chức năng tương tự ở trong

người Đột biến đồng hợp MSTN làm cho các bệnh nhân 1 - 4,5 tuổi không hoạt động, tăng khối lượng của cơ (http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MSTN)

Dây chằng và gân có cấu trúc tương tự nhau, chúng có cấu trúc collagenous với số lượng tế bào ít, nhưng chức năng khác nhau.Trong thể thao, dây chằng và gân không thể chữa lành một cách tự nhiên và là một vấn đề lớn với các VĐV

Đa hình trong gene COL5α1 liên quan tới tăng rủi ro tổn thương mô mềm cơ xương, đặc biệt là gân Những biến thể của gene COL1α1 liên quan tới những

rủi ro đứt dây chằng và trật khớp vai ở mức bình thường (Lippiet và cs, 2010)

1.3 Gene ACE

1.3.1 Cấu trúc gene ACE

Gene ACE nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể 17 (Hình 1 5) ACE có

20,546 base (từ cặp base thứ 61,554,421 đến cặp base thứ 61,575,740) và gồm

25 exon (Ian, 2006) Sau quá trình phiên mã và thành thục mRNA, mRNA của

ACE có 4,195 base và trực tiếp tổng hợp protein chứa 1,306 axit amin

Hình 1 5 Vị trí của gene ACE nằm trên nhiễm sắc thể 17

(Tính đa hình I/D của gene ACE được đặc trưng bởi sự có mặt hoặc không có mặt của

đoạn trình tự lặp lại dài 287 bp trong intron 16, theo Ian (2006)

1.3.2 Đặc điểm chức năng của gene ACE

Gene ACE quy định mã hóa cho enzyme chuyển hóa angiotensis

(Angiotensin Converting Enzyme), đây là một enzyme trong hệ thống Renin Angiotensin, có vai trò quan trọng trong điều hòa thể tích máu, cân bằng huyết

-áp, tim và mạch máu Khi thể tích máu trong cơ thể người hạ thấp khiến huyết

áp giảm, thận sẽ bài tiết một enzyme có tên là renin Renin sẽ kích thích sản sinh angiotensin I Angiotensin I được chuyển hóa thành Angiotensin II bởi enzyme chuyển hóa angiotensis (ACE) Angiotensin II là một peptide đa chức năng, hoạt động gián tiếp dẫn đến làm tăng co mạch, tăng sức cản của máu và tăng huyết áp

do cản trở quá trình sinh tổng hợp nitric oxide Ngoài ra sự co mạch máu bị tác động gián tiếp bởi ACE thông qua làm giảm Bradykinin Angiotensin II khởi động quá trình tăng thể tích mạch máu thông qua 2 hoạt động Angiotensin II kích thích sự chế tiết hormon aldosterone từ lớp cầu vỏ thượng thận Aldosterone làm tăng tái hấp thu nước và ion Na+

ở các tế bào biểu mô ống thận Điều đó sẽ dẫn tới việc tăng lượng nước trong cơ thể, phục hồi huyết áp (Tanriverdi và cs, 2005) Angiotensin II kích thích thùy sau tuyến yên tiết vasopressin từ đó giúp tăng thể tích và huyết áp của máu (Ian và cs, 2006)

Hình 1 6 Cấu trúc không gian của Angiotensin converting enzyme (Sturrocka và cs, 2004)

1.3.3 Đa hình gene ACE I/D và mối liên quan đến tiềm năng thể thao

Tính đa hình của ACE I/D thể hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một trình

tự lặp lại dài 287 bp trong intron 16 Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của alen I và alen D tới hàm lượng và hoạt tính của enzyme Angiotensin

Converting Năm 2000, Murphey và cộng sự đã chỉ ra mối tương quan ý nghĩa

giữa ACE và giảm bradykinin Kết quả thu được, những người có kiểu gene

đồng hợp tử DD có tỷ lệ chuyển hóa bradykinin cao nhất và kiểu gene II là thấp nhất Cambien và cs (1992) đã thấy những bệnh nhân có kiểu gene đồng hợp tử

DD có lịch sử bị nhồi máu cơ tim nhiều hơn Tuy nhiên cũng có nhiều nghiên cứu bác bỏ kết luận này Bohn và cs (1993) đã điều tra về tần số alen của một nhóm người sống sót khi bị nhồi máu cơ tim Kết quả cho thấy trong tổng số 234 người sống sót, tần số kiểu gene DD thấp hơn Kết luận này cũng tương đồng với các nghiên cứu của Miettinen và cs (1994); Samani và cs (1996) Một

nghiên cứu lớn hơn bởi Lindpaintner và cs (1995) cũng kết luận kiểu gene ACE

không liên quan tới rủi ro bị nhồi máu cơ tim Nghiên cứu này cũng cho thấy

không thể sử dụng kiểu gene ACE để dự đoán bệnh thiếu máu và không có mối liên hệ giữa kiểu gene ACE với bệnh động mạch vành (coronary artery disease) Nếu tính đa hình của ACE I/D liên quan tới những bệnh về tim, những

người mang kiểu gene DD sẽ tăng rủi ro về các bệnh tim mạch, điều này cũng đồng nghĩa với những người có alen I có thể có lợi do mức độ hoạt động của

ACE thấp hơn Những lợi ích hiệu quả của alen I tới hệ thống tim mạch có thể là

một lợi thế cho những người hoạt động đòi hỏi sức bền Có thể nói, phần lớn các nghiên cứu đều cho thấy người có kiểu gene đồng hợp DD có enzyme Angiotensin Converting hoạt động cao nhất và thấp nhất là người có kiểu gene đồng hợp II Tính đa hình I/D, vị trí và chức năng của một intron ảnh hưởng tới

mức độ hoạt động của enzyme ACE vẫn chưa được biết rõ Điều này có thể do

đa hình I/D ảnh hưởng tới các nhân tố điều hòa trong gene, ảnh hưởng tới phiên

mã hoặc suy thoái mRNA hoặc có thể hoạt động đơn giản như một marker cho vùng gene khác (Hình 1 7)

Hình 1 7 Những tác động của gene ACE trên hệ thống Renin-Angiotensin theo Ian (2006).

Những người mang alen D có hàm lượng và hoạt tính của ACE cao giúp tăng quá trình chuyển Angiotensin I thành Angiotensin II, kết quả làm tăng co mạch Ngược lại những người mang alen I có hàm lượng ACE trong huyết thanh

thấp hơn, từ đó làm giảm sự co mạch Với tầm quan trọng của kiểu gene ACE trong điều hòa tim mạch đã dẫn đến những nghiên cứu ứng dụng về kiểu gene

ACE tới những trường hơp cụ thể, một trong những hướng đó là nghiên cứu ảnh

hưởng của kiểu gene ACE tới tiềm năng của các VĐV

Đặc trưng chức năng của alen I là giảm mức độ hoạt động của enzyme

Angiotensin converting Alen này được coi là đột biến có lợi do ACE hoạt động

thấp dẫn đến kết quả là co mạch ít hơn và do đó tăng dẫn truyền oxy tới các cơ

đang hoạt động Chính vì vậy, những VĐV sở hữu một alen I hoặc hai alen I sẽ

có nhiều lợi thế hơn trong các hoạt động đòi hỏi sức bền như các môn thể thao:

chạy đường dài, bơi ở cự ly dài, xe đạp Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu

về tần số alen và kiểu gene của gene ACE có trong những VĐV ưu tú thi đấu tại

các giải đấu cấp độ quốc gia và quốc tế Gayagay và cs (1998) đã nghiên cứu

mối liên quan giữa kiểu gene ACE và các VĐV chèo thuyền (môn thể thao đòi hỏi sức bền) của các VĐV Olympic Australia Kết quả thu được tần số alen I và

kiểu gene II lớn hơn tần số alen D và kiểu gene DD Tương tự, trong một nghiên

cứu của Alvarez và cs (2000) về xác định mối liên quan giữa kiểu gene ACE và

những VĐV thi đấu ở các môn thể thao đòi hỏi sức bền: xe đạp, chạy dài và

bóng ném, tác giả tìm thấy tần số kiểu gene II/ID giữa các VĐV lớn hơn so với

nhóm đối chứng Hơn nữa, các VĐV xe đạp ưu tú gần như đều có kiểu gene đồng hợp II hoặc dị hợp ID và chỉ có một VĐV có kiểu gene đồng hợp DD Wood và cs (2001) cũng thấy kiểu gene II trong nhóm nghiên cứu lớn hơn so với nhóm đối chứng Kết quả nghiên cứu của Tsianos và cs (2004) thu được tần

số alen I ở nhóm VĐV bơi đường dài là 0,59 cao hơn so với những VĐV bơi ở

cự ly ngắn (chỉ có 0,29) Trong nhóm các VĐV đua đường dài chỉ có 1/15 VĐV

có kiểu gene DD Một nghiên cứu khác của Myerson và cs (1999) thu được kết

quả trong nhóm VĐV olympic Anh có tần số alen I tăng từ 35% đối với các

VĐV chạy nhanh (≤ 200 m) tới 65% với các VĐV chạy bền (≥ 5.000 m) Theo Nazarov và cs (2001), tần số alen D của các VĐV Nga (bơi, trượt tuyết, 3 môn hỗn hợp) là 72% trong nhóm VĐV thi đấu ở cự ly ngắn trong khi nhóm VĐV thi đấu ở cự ly trung bình có tần số alen I là 63% Scanavini và cs (2002) đã nghiên

cứu ảnh hưởng của đa hình I/D trong gene ACE tới các VĐV Italia (các môn thể

thao sức bền và tốc độ) Kiểu gene II được tìm thấy 30,3 % trong các nhóm VĐV thi đấu các môn sức bền so với 5,3% trong nhóm VĐV thi đấu ở các nội dung đòi hỏi tốc độ và 12,5% trong nhóm đối chứng Những nghiên cứu này gợi

ý alen I có thể liên quan tới sức bền của các VĐV Kenya là quốc gia chiếm ưu thế về chạy bền trong hơn 15 năm qua Năm 2005, Kenya có 23 trong tổng số 50 VĐV chạy bền hàng đầu (3000 m - 10000 m) (theo bảng xếp hạng của IAAF, 2005) Giải thích sự thành công của các VĐV Kenya trong các cự ly thi đấu này,

cứu của Scott và cs (2005) đã kiểm tra gene ACE đối với các VĐV Kenyan ưu

tú và những người dân Kenyan làm nhóm đối chứng Tần số alen I ở các VĐV quốc tế là 38%, các VĐV của Kenyan là 42% và nhóm đối chứng là 38% Một nghiên cứu tương tự bởi Moran và cs (2004) đã kiểm tra các VĐV Ethiopia Kiểu gene II chiếm 22,7% đối với các VĐV nam, và chỉ có 4,3% trong nhóm đối chứng Bên cạnh đó, tần số alen I (43%) cao hơn so với nhóm đối chứng (26%), nhóm đại diện cho người dân Ethiopia Nghiên cứu của Hagberg và cs

(1998) đã chỉ ra mối tương quan giữa kiểu gene ACE và VO2 max Nghiên cứu này cho thấy sau khi vận động, VO2 max có mối tương quan với kiểu gene ACE,

trong đó cao nhất là kiểu gene II và thấp nhất là kiểu gene DD Nghiên cứu cũng cho thấy sự khác nhau VO2 max giữa các cá thể là 12% Ngược lại những nghiên cứu khác chỉ ra không có mối tương quan giữa VO2 max và kiểu gene ACE

Theo nghiên cứu của Day và cs (2007) đã điều tra mối tương quan giữa kiểu

gene ACE, mức độ hoạt động của ACE và VO2 max ở nữ giới Nghiên cứu này

cũng chỉ ra không có mối tương quan giữa kiểu gene ACE hoặc sự hoạt động của ACE và VO2 max Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của Rankinen và cs (2000); Woods và cs (2001) cho thấy không có sự khác nhau về đường chuẩn VO2 max giữa hai kiểu gene đồng hợp là II và DD Các tác giả cũng nhận thấy không có gene tương tác hiệu quả đến VO2 max trong những nhóm này

Cũng có nhiều nghiên cứu đánh giả ảnh hưởng của đa hình I/D trong gene

ACE tới các cự ly thi đấu đòi hỏi tốc độ Myerson và cs (1999) đã nghiên cứu

mối tương quan giữa cự li chạy và kiểu gene ACE Kết quả thu được: tần số alen

I tăng với cư ly chạy dài và tần số alen D tăng khi cự ly chạy giảm xuống Hai nghiên cứu cũng cho kết quả tương tự đối với các VĐV bơi lội Nghiên cứu của Woods và cs (2001), cho thấy tần số alen D lớn hơn ở những VĐV bơi cự ly ngắn hơn 400 m Tuy nhiên, mối liên hệ này chỉ xảy ra trong nhóm VĐV ưu tú Trong khi đối với nhóm nghiên cứu không phải là các VĐV ưu tú thì mối liên quan này không có ý nghĩa Nghiên cứu thứ 2 được thực hiện với một nhóm VĐV bơi ở cự ly ngắn và ở cự ly dài (ít nhất 5 đến 10 km) bởi Tsianos và cs

(2004) Kết quả thu được, trong nhóm VĐV bơi ở cự ly ngắn, chỉ có 1 trong 19 VĐV bơi có kiểu gene II Nghiên cứu của Nazarov và cs (2001) đã đánh giá

kiểu gene ACE trong nhóm VĐV thi đấu môn bơi lội, chặn bóng, 3 môn phối

hợp (đua xe đạp, chạy, bơi) Nhóm các VĐV ở cự ly ngắn (đòi hỏi ít sức bền hơn) ở các môn bơi lội, chặn bóng có tần số alen D lớn hơn

Có thể nói, phần lớn các nghiên cứu hiện nay đều cho thấy gene ACE có

ảnh hưởng tới sức bền, sự nhanh nhẹn của các VĐV Trong đó alen I được coi như là alen có lợi đối với các VĐV thi đấu ở các nội dung đòi hỏi sức bền Alen

D được coi là alen có lợi cho các VĐV thi đấu ở các môn đòi hỏi sự nhanh nhẹn

1.4 Gene ACTN3

1.4.1 Cấu trúc của gene ACTN3

Gene ACTN3 nằm ở vị trí cánh dài của nhiễm sắc thể số 11 (11q 13.2) (Hình

1.8) Nó gồm 16,407 bp, chứa 21 exon Sau khi quá trình phiên mã hoàn tất và loại bỏ các introns thì sản phẩm gồm 2,858 base mRNA tương ứng với 901 axit amin của protein α-actinin 3 Biến dị di truyền ở exon 15 và 16 được tạo bởi các đột biến điểm nằm trong vùng mã hóa của phân tử DNA và được cho rằng có

ảnh hưởng đến chức năng của gene ACTN3 và tiềm năng đạt thành tích cao của

VĐV

Hình 1 8 Vị trí của gene ACTN3 trên nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2).

1.4.2 Đặc điểm chức năng của gene ACTN3

Sự biểu hiện của protein α-actinin-3 liên quan đến sợi cơ co nhanh loại II (Mills và cs, 2001), α-actinin-3 tham gia vào cấu tạo của đoạn α-actinin (thành phần chính của Z-line) Z-line có vai trò liên kết các sợi actin và giúp nâng đỡ, sắp xếp các sợi myosin (Yang và cs, 2003) Z-line (Hình 1.9) là một cấu trúc quan trọng của một khúc cơ, nó có chức năng hỗ trợ cho quá trình co - duỗi của

cơ Các nhà nghiên cứu nhận thấy α-actinin-3 có thể giúp làm giảm sự tổn thương cơ bằng cơ chế co lệch tâm (Yang và cs, 2003) Vai trò này đặc biệt quan trọng trong quá trình co - duỗi cơ mạnh α-actinin-3 chủ yếu có ở các sợi cơ co nhanh loại II

Hai kiểu đa hình độc lập nằm trên hai exon 15 và 16 của gene ACTN3 là các

biến dị ảnh hưởng đến chức năng của protein α-actinin-3 và có thể ảnh hưởng đến thành tích của VĐV Ở exon 15, một đột biến A → G làm thay đổi bộ ba mã hóa CAG → CGG, tức là từ axit amin Glutamine (Q) thành Arginine (R) Đột

biến này làm xuất hiện thêm một điểm cắt của enzyme giới hạn MspI ở alen

523R và do đó biến dị di truyền này dễ dàng được phân biệt bởi phương pháp RFLP Phương pháp phân tích này cho phép phát hiện nhanh các đột biến điểm

thông qua việc có hoặc không có vị trí cắt của enzyme giới hạn MspI Ví dụ: ở

exon 15, bằng phương pháp điện di DNA trên gel có thể dễ dàng phân biệt 2 dạng biến dị Đối với alen 523Q thì có 2 đoạn DNA, còn đối với alen 523R thì có

3 đoạn DNA (vì có thêm một điểm cắt mới)

Hình 1 9 Sự tham gia của gene ACTN3 vào cấu trúc sợi cơ

Ở exon 16, một đột biến điểm C→T làm thay đổi một bộ ba mã hóa CGA thành TGA Đột biến này làm thay đổi axit amin Arginine (R) thành một mã kết

thúc sớm (X) Hậu quả là tạo ra một protein α-actinin-3 không hoàn chỉnh Đột biến này được dự đoán là xuất hiện ở 16% dân số trên thế giới (Yang và cs,

2003) Protein α-actinin-2 (được mã hóa bởi gene ACTN2) có cấu trúc và chức

năng tương tự như protein α-actinin-3 và nó có mặt ở tất cả các dạng sợi cơ Người ta cho rằng, protein α-actinin-2 có thể bù đắp cho sự thiếu hụt của α-

protein chức năng α-actinin-3 được cho là có lợi đối với các VĐV nhờ vào cấu tạo sợi cơ co nhanh loại II trong quá trình thực hiện các động tác với cường độ cao như là chạy nước rút Tương tự như đa hình ở exon 15, đột biến thay thế nucleotide nằm trong exon 16 làm xuất hiện một điểm cắt giới hạn của enzyme

giới hạn DdeI ở alen 577X và cũng dễ dàng phân biệt bằng phương pháp RFLP

1.4.3 Đa hình gene ACTN3 R577X và mối liên quan đến tiềm năng thể thao

Gene ACTN3 lần đầu tiên được nghiên cứu bởi North và cs (1999) khi họ

phát hiện có một đột biến điểm ở exon 16 gây thiếu hụt protein α-actinin-3 Họ tiến hành lấy sinh thiết cơ của bệnh nhân bị bệnh cơ thần kinh và khám phá ra rằng thiếu hụt protein α-actinin-3 chỉ xảy ra ở 19% số mẫu, nên họ tin rằng sự thiếu hụt này không liên quan đến bệnh cơ thần kinh Ngoài ra, exon 15 cũng được nghiên cứu và kết quả cho thấy đột biến ở exon 15 và 16 là hoàn toàn riêng biệt, không phụ thuộc vào nhau Do đó, North và cs (1999) đã kết luận rằng sự thiếu hụt protein α-actinin-3 không gây ra bệnh

Việc thiếu một dạng bệnh lý liên quan đến sự thiếu hụt α-actinin-3 đã khiến

Mills và cs (2001) nghiên cứu về sự tiến hóa của gene ACTN3 để lý giải Như đã

đề cập, actinin-2 được tìm thấy ở tất cả các cơ bắp của người và giống actinin-3 đến 90% Sự khác nhau giữa 2 protein này xảy ra ở khoảng 300 triệu

α-năm trước và chúng bị thay đổi rất ít (Mills và cs, 2001) Mặc dù chúng tiến hành

các chức năng tương tự nhau ở cơ, nhưng thực tế cho thấy α-actinin-3 tác động lớn hơn đến hiệu quả hoạt động của sợi cơ co nhanh loại II Có thể thấy rằng, α-actinin-3 không ảnh hưởng đến tính trạng phổ biến, nhưng nó có một tác động đến một nhóm quần thể nào đó và điều này thể hiện rõ trong những điều kiện kiểm tra khả năng thể thao ở mức cao nhất (ví dụ: kiểm tra ở các VĐV chạy nước rút có thành tích hàng đầu) Các kết quả từ nghiên cứu này định hướng cho

các nhóm nghiên cứu khác tiến hành nghiên cứu gene ACTN3 ở các nhóm thí

nghiệm đặc thù hơn, ví dụ như là nhóm các VĐV chạy nước rút có thành tích cao

vì ở nhóm VĐV này cần một sự bùng nổ tối đa sức mạnh của cơ trong thời gian ngắn ở đường đua

Trong một nghiên cứu của Yang và cs (2003) giữa một nhóm VĐV và nhóm đối chứng của Úc Khi so sánh nhóm VĐV với nhóm đối chứng thì thấy không có sự khác biệt rõ rệt về tần số kiểu gene và tần số alen Tuy nhiên, khi chia nhóm VĐV thành 2 nhóm nhỏ: nhóm VĐV ở các môn thể thao cần tốc độ nhanh - mạnh (nhóm 1) và nhóm VĐV ở các môn cần độ bền (nhóm 2) thì có một số kết quả đáng lưu ý Kiểu gene XX có tần số thấp hơn ở nhóm 1 (Nam - 8%; Nữ - 0%) so sánh với nhóm đối chứng (Nam - 16% ; Nữ - 20%) Ngược lại, kiểu gene RR có tần số cao hơn rõ rệt ở nhóm 1 (RR 53%) so với nhóm đối chứng (RR 30%), kiểu gene XX ở nhóm 2 cao hơn không đáng kể (XX 24%) so với nhóm đối chứng (XX 18%) Qua nghiên cứu này, các tác giả nhận xét rằng tần số kiểu gene và alen không có sự khác biệt rõ rệt giữa nhóm VĐV hỗn hợp

và nhóm đối chứng Tuy nhiên, khi nhóm VĐV hỗn hợp được chia nhỏ theo tiêu chuẩn độ nhanh – mạnh và độ bền thì sự khác biệt lại rất rõ ràng ngay cả giữa nam và nữ Điều này gợi ý rằng alen R có thể hữu ích đối với các VĐV ở các môn cần tố chất mạnh – tốc độ (ví dụ: chạy cự ly 100 m, 200 m; bơi cự ly 50 m,

100 m)

Nhiều nghiên cứu khác cũng cho các kết quả tương đồng: Tần số kiểu gen

RR của 60 cầu thủ bóng đá hàng đầu, tham gia giải vô địch Tây Ban Nha là 48.3% cao hơn so với nhóm đối chứng (28.5%) (Santiago và cs, 2008) Tần số kiểu gen XX của 75 vận động viên ưu tú thi đấu ở các môn sức mạnh của Mỹ là 6.7% thấp hơn so với đối chứng (16.3%) (Roth và cs, 2008) 486 vận động viên Nga thi đấu ở các môn đòi hỏi sức mạnh có tần số kiểu gen XX là 6.4% thấp hơn

so với đối chứng (14.2%) (Druzhevskaya và cs, 2008) Thêm vào đó, Vincent và

cs (2007) đã chứng minh diện tích và số lượng sợi cơ loại II (co nhanh) của những người mang kiểu gen RR lớn hơn những người mang kiểu gen XX

Bên cạnh đó, cũng có 4 nghiên cứu không cho thấy mối liên quan giữa đa hình R577X và sức mạnh của các vận động viên (Sessa và cs, 2011, Ginevičienė

và cs, 2010; Scott và cs, 2010; Yang và cs 2007)

1.5 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để xác định đa hình gene

ACE và ACTN3

1.5.1 Kỹ thuật PCR

Kary Mullis là người đầu tiên phát minh ra kỹ thuật PCR và kỹ thuật này đã được công bố lần đầu tiên vào năm 1985 Chỉ sau một thời gian rất ngắn PCR đã trở thành một kỹ thuật phổ biến, được áp dụng rộng rãi trong cả nghiên cứu và xét nghiệm lâm sàng như: chuẩn đoán bệnh, phát hiện những mầm bệnh có trong thực phẩm, đồ uống và nhiều ứng dụng khác Ngày nay, kỹ thuật PCR được xem như một kỹ thuật kinh điển và được ứng dụng trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử vì nó độ nhạy cao, đơn giản và khả năng ứng dụng rộng rãi

Với kỹ thuật PCR, trình tự DNA mục tiêu sẽ được khuếch theo cấp số nhân nhờ sự xúc tác của enzyme DNA polymerase và máy chu trình nhiệt Một phản ứng PCR thông thường bao gồm một cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, dNTPs, DNA khuôn và dung dịch đệm

Mồi dùng trong phản ứng PCR là những đoạn DNA ngắn (thường dài 18-25 nucleotide) được thiết kế dựa trên trình tự DNA mục tiêu (mạch khuôn) Cặp mồi PCR phải được thiết kế sao cho có khả năng bắt cặp đặc hiệu tại 2 đầu trình

tự DNA mục tiêu và chỉ khuếch đại duy nhất đoạn DNA đó mà không phải bất

cứ đoạn DNA nào khác

Phản ứng PCR được thực hiện theo một chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: biến tính, bắt cặp, kéo dài và hoàn thiện sản phẩm (Hình 1.10)

- Giai đoạn biến tính DNA: thường được thực hiện tại 94oC, trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 2 phút, tùy thuộc vào kích thước sản phẩm PCR Dưới tác động của nhiệt, DNA mạch kép bị tách thành các sợi DNA đơn, tạo thành các khuôn cho mồi tới bắt cặp

- Giai đoạn bắt cặp giữa mồi và DNA khuôn: đây là giai đoạn rất quan

trọng, nó là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng sản phẩm PCR, nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi cũng như đặc

tính cấu trúc của cặp mồi (tỷ lệ GC, các chỉ số dimer, self-dimer, cấu trúc kẹp tóc ) Nhiệt độ bắt cặp thường dao động trong khoảng từ 55 – 65o

C, trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 2 phút

- Giai đoạn tổng hợp chuỗi DNA (kéo dài): thường được thực hiện ở nhiệt

độ 72oC để đảm bảo cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất, với hiệu suất và tính chính xác cao nhất, thời gian kéo dài sản phẩm cũng tùy thuộc vào kích thước của sản phẩm và thường dao động trong khoảng 1 – 3 phút

- Giai đoạn hoàn thiện sản phẩm: thường được thực hiện trong khoảng từ 5

– 10 phút tại 72o

C

Toàn bộ quá trình trên được thực hiện lặp lại (trừ giai đoạn hoàn thiện sản phẩm) từ 25 tới 40 chu kỳ trong vòng 2 – 4 giờ, kết quả là ta có thể thu được hàng tỷ bản sao từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu Do đó, PCR là một kỹ

thuật khuếch đại DNA trong điều kiện in vitro có hiệu suất và độ đặc hiệu cao,

có độ nhạy vượt trội, cho kết quả nhanh chóng, tính tự động hóa và có khả năng ứng dụng cao

Hình 1 10 Nguyên lý của phản ứng PCR

1.5.2 Kỹ thuật RFLP-PCR

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật phân tích tính đa hình của các đoạn DNA được cắt bởi các enzyme cắt giới hạn Kỹ thuật này đã được sử dụng phổ biến từ thập niên 80, cho đến nay đã có khoảng 3.400 enzyme cắt giới hạn đã được phát hiện Trong đó, có khoảng 540 REs đã được thương mại hóa Nguyên tắc chung của

kỹ thuật này dựa trên khả năng cắt đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với

vị trí nhận biết của chúng trên chuỗi DNA Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể

sẽ tạo ra những đoạn cắt có kích thước khác nhau Nhờ vào đó ta có thể nhận biết được sự khác nhau về cấu trúc gene của các loài khác nhau, các cá thể khác nhau trong cùng loài hoặc các bất thường về cấu trúc gene (các đột biến mất, thêm, đảo vị trí hay thay thế 1 hoặc vài cặp nucleotide)

Quy trình kỹ thuật RFLP thông thường bao gồm ba công đoạn chính: (1) tách chiết và tinh sạch DNA, (2) thực hiện phản ứng cắt các mẫu DNA với cùng chủng loại enzyme, (3) điện di và tiến hành phản ứng Southern blot

Trong thực tế, DNA thể gene của mỗi loài sinh vật đều rất lớn nên khi cắt

và thực hiện phản ứng Southern blot sẽ vô cùng phức tạp, tốn kém và mất rất nhiều thời gian phân tích kết quả Do đó, trong hầu hết các nghiên cứu, chỉ một vài trình tự gene mục tiêu được lựa chọn để nghiên cứu Hiện nay, kỹ thuật RFLP-PCR được sử dụng nhiều hơn so với kỹ thuật RFLP đơn thuần, đó là kỹ thuật dựa trên sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR và kỹ thuật RFLP truyền thống Quy trình kỹ thuật RFLP-PCR bao gồm các bước: (1) tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, (2) thực hiện phản ứng PCR  khuếch đại trình tự gene mục tiêu, (3) tinh sạch sản phẩm PCR và thực hiện phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn, (4) điện di sản phẩm cắt và phân tích kết quả

Phương pháp RFLP-PCR có những ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật RFLP truyền thống như: (1) có độ nhạy cao vì chỉ cẩn một lượng nhỏ DNA khuôn đã

có thể thu được lượng DNA cần thiết cho phản ứng cắt; (2) đơn giản, dễ thực hiện và có thể quan sát kết quả ngay sau khi điện di trên gel Agarose; (3) chi phí thấp vì không cần sử dụng mẫu dò để kiểm tra sản phẩm cắt; (4) an toàn do không phải đánh dấu bằng các hợp chất huỳnh quang hoặc chỉ thị phóng xạ