Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng pichia pastoris tái tổ hợp sinh amylase và interleukin 2 bằng kỹ thuật real time PCR

pastoris tái tổhợp; tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men; tối ưu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR; kết quả Real-Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1;

Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa

Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase

và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR

Thân Văn Minh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: GS.TS Trương Nam Hải

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về Pichia pastoris; α-factor và geneMF(ALPHA)1; các protein

ngoại lai và kỹ thuật Real-time PCR Nghiên cứu về các vật liệu như: chủng vi sinh vật và các gene biến nạp; mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR; hóa chất, enzyme

và các thiết bị máy móc; phần mềm và các loại môi trường và dung dịch Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lên men và nuôi cấy các chủng P pastoris tái tổ hợp; phương pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P Pastoris; kỹ thuật PCR;

kỹ thuật Real-time PCR; xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0 Đưa ra kết quả và thảo luận: Lên men các chủng P pastoris tái tổhợp; tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men; tối ưu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR; kết quả Real-Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1; real-Real-time PCR về biểu

hiện của gene MF(ALPHA)1; so sánh kết quả Real-time PCR và Microarray

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Di truyền hóa sinh học; Nấm men Content

MỞ ĐẦU

Những kết quả phân tích so sánh hệ transcriptome của chủng P pastoris đối chứng,

chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase cho thấy có 6 gen có sự khác biệt trong biểu hiện gen giữa các chủng nghiên cứu trong đó có gen mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)

Kỹ thuật Real-time PCR đánh giá sự biểu hiện của gen sẽ có độ nhạy, độ chính xác lớn hơn

và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn hơn để đánh giá sự biểu hiện của gen

(MF(ALPHA)1 từ đó có những định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao

mức độ biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp

Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa

Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và

Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR”

Công việc được tiến hành tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris

1.1.1 Đặc điểm hệ biểu hiện P pastoris

P pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae sinh vật nhân chuẩn, có khả năng trao đổi

methanol

Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P pastoris đều có nguồn gốc từ chủng dại

NRRL-Y 11430

Bảng 1.1: Các chủng biểu hiện P Pastoris

Tên chủng Kiểu gen Kiểu hình

X-33 Chủng dại Mut+

GS115 his4 Mut+His

-KM71H his4 arg4 aox1Δ::AGR4 Muts His

-GS115/Albumin his4 Muts

MC100-3 his4 ar4g aox1Δ::SAGR4

aox2Δ::Phis4 Mut-His -SMD1168 Pre4Δ his4 Mut+His- khuyết protease SMD1165 Prb 1 his4 Mut+His- khuyết protease

1.1.2 Những ưu điểm của hệ biểu hiện P pastoris

P pastoris có khả năng thực hiện nhiều biến đổi sau dịch mã đặc trưng của sinh vật

nhân chuẩn

Có promoter mạnh như AOX1 hoặc GAPDH

Chất cảm ứng biểu hiện protein là methanol, rẻ tiền Quá trình lên men có thể được thực hiện nhanh chóng

1.1.3 Quá trình chuyển hóa methanol ở P pastoris

Quá trình chuyển hóa methanol xảy ra trong bào quan chuyên biệt là peroxisome để tránh tác dụng gây độc của hydrogen peroxide

1.1.4 Cơ chế tiết protein ở nấm men

Mặc dù nhiều trình tự tín hiệu tiết khác nhau đã được sử dụng thành công, trình tự tín

hiệu tiết prepropeptide α-factor của S cerevisiae được xem là thành công nhất

1.1.5 Vector biểu hiện gene ngoại lai của P pastoris

1.1.5.1 Đặc điểm chung của vector biểu hiện của P pastoris

1 Promoter mạnh: thường là promoter AOX1

2 Có một hoặc nhiều vị trí đa cắt nối (MCS)

3 Trình tự kết thúc dịch mã

4 Gen chỉ thị chọn lọc

5 Một trình tự cần thiết cho sự sao chép và tồn tại của plasmid trong vi khuẩn

1.1.5.2 Vector pPIC9

1.1.6 Tích hợp gen ngoại lai vào P pastoris

Các vector biểu hiện trong P pastoris được thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay locus his4 Giống như ở S cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định quá trình biến nạp vào

P pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng trong bộ gene nấm men DNA

tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong bộ gene tế bào chủ

Ở chủng Mut+

hoặc (Muts), gene sát nhập tại locus his4 do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện (Hình 1.5) Kết quả có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình His+ Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut+

hay MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+

biến nạp

1.2 Tổng quan về α-factor và gen MF(ALPHA)1

Nhân tố alpha là một chuỗi peptide gồm 13 amino acid (aa) được mã hóa bởi 2 gen cấu

trúc riêng biệt, MF1, MF2 Gen MF(ALPHA)1 không có trong chủng P pastoris gốc ban đầu, nhưng trong vector biểu hiện pPIC9, do đó được đưa vào các chủng nấm men P pastoris

trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp

1.3 Tổng quan về các protein ngoại lai trong đề tài

1.3.1 Tổng quan về Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2) ở người được biết đến dấu tiên như yếu tố kích thích tăng trưởng tế bào T, nó là một lymphokine có khả năng quản lý đáp ứng miễn dịch mạnh và đã được xác định như một chất dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư

1.3.2 Tổng quan về α-amylase:

Amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết glycoside của tinh bột, glycogen và

các polysaccaride tương tự α-Amylase của nấm men như S fibuligera đã được nghiên cứu

gồm 6 trình tự aixit amin có tính bảo thủ cao nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme

1.4 Kỹ thuật Real-time PCR

1.4.1 Tổng quan về Real-time PCR

Trong kỹ thuật PCR truyền thống kết quả của thí nghiệm chỉ được xác định khi đã hoàn tất các công đoạn của thí nghiệm, do đó công đoạn PCR thường mất rất nhiều thời gian Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bước đột phá trong công nghệ sinh học Kỹ thuật này cho phép xác định kết quả của thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chính vì vậy được gọi là “Real-time” Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định lượng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao (độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,2 chu kỳ) Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định lượng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao

1.4.2 Phân tích kết quả Real-time PCR

1.4.2.1 Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR (amplification graph)

1.4.2.2 Chu kỳ ngưỡng (Ct)

Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó được đường biển diễn khuếch đại cắt đường nền (basal cycle)

1.4.2.3 Biểu đồ nóng chảy

Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm DNA đích ở chiều dài, nên có thể phân biệt được được đường biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay là từ dimer primer bằng tính chất đặc trưng

đó chính là nhiệt độ chảy (melting To, Tm), Nhiệt độ chảy của sợi đôi DNA tùy thuộc vào thành phần GC và chiều dài của nó: Thành phần GC càng cao thì Tm càng cao, sợi đôi càng dài thì Tm càng cao Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài hơn nên sẽ có Tm cao hơn là Tm của sản phẩm khuếch đại từ dimer primer

1.4.2.4 Phương pháp so sánh định lượng tương đối 2 ΔCt

Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngưỡng chênh nhau 1 đơn vị tương đương với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lượng RNA của gene đích Tỷ lệ lượng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng được tính theo công thức:

Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật và các gen biến nạp

Chủng nấm men P pastoris SMD1168 [ pep4, his4] đã tích hợp pPIC9

- P pastoris pPIC9 chủng đối chứng – control

- P pastoris pPIC9Amy (chủng Amy)

- P pastoris pPIC9IL-2 (chủng IL-2)

2.1.2 Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR

Tên mồi Trình tự nucleotide

IPP1-Fw 5’-TACGGTGCCTTCCCTCAG-3’

IPP1-Rv 5’-TCCCTCATCCAACAAAGCCATAAC-3’

MF(ALPHA)1-Fw 5’-CTGCAGTTTTATTCGCAGCATCC-3’

MF(ALPHA)1-Rv1 5’-GCAGCAATGCTGGCAATAGTAG-3’

2.1.3 Hóa chất, enzyme và các thiết bị máy móc

 Hóa chất, enzyme:dùng các hóa chất enzyme dùng cho sinh học phân tử

 Máy móc và thiết bị:Máy Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche version 2.0

2.1.4 Phần mềm

Phần mềm LightCycler 4.0

2.1.5 Các loại môi trường và dung dịch

a Môi trường nuôi cấy chọn lọc và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm mem Pichia pastoris

b Dung dịch tách chiết mRNA từ nấm mem

- Dung dịch BY1 gồm có 1M sorbitol, 0.5M EDTA có bổ sung thêm 0.1% mercaptoethanol

và zymolase tới nồng độ cuối cùng là 300 µg/ml

- Dung dịch RLT theo bộ kit được sử dụng để phá thành tế bào và được bổ sung 1% mercaptoethanol trước khi sử dụng

- Dung dịch RW1 được sử dụng để làm sạch mẫu tách chiết

- Dung dịch RPE được bổ sung ethanol theo tỉ lệ 1 RPE: 3 Ethanol được sử dụng để làm sạch mẫu tách chiết

c Dung dịch xử lý DNA lẫn trong các mẫu RNA tách chiết

- Dung dịch EDTA 25mM

- Dung dịch DEPC 1%: Pha DEPC trong nước đến nồng độ 1% để loại bỏ toàn bộ RNase trong nước, sau đó đem khử trùng dung dịch để loại bỏ DEPC

- Dung dịch RLT và RPE (kit QiaGen)

d Dung dịch loại bỏ Rnase

- Dung dịch DEPC 1% để được dung dịch sử dụng cho quá trình loại bỏ RNase trong môi trường

e Dung dịch sử dụng điện di DNA trên gel agarose

- Dung dịch DEPC 1% để được dung dịch sử dụng cho quá trình loại bỏ RNase trong môi trường

f Dung dịch sử dụng điện di SDS-PAGE

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lên men và nuôi cấy các chủng P pastoris tái tổ hợp

2.2.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P Pastoris

a Phương pháp xử lý dụng cụ thí nghiệm để loại bỏ mRNA

- Toàn bộ dụng cụ thí nghiệm như: pipet, đầu tip, ống ly tâm, không có RNase Pipet được chúng tôi lau sạch bằng dung dịch DEPC 1% Đầu tip và ống ly tâm là sản phẩm đã được chứng nhận không có RNase và DNase

- Các dụng cụ khác như bể chứa, khay đổ điện di, chai thủy tinh pha dung dịch cũng được ngâm dung dịch DEPC 1% trong khoảng 2h trước khi khử trùng ướt

- Nước cất 1 lần, 2 lần và các dung dịch cần thiết khác được bổ sung DEPC trước khi khử trùng để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn RNase trong dung dịch

b Phương pháp tách chiết mRNA tổng số

Dịch tế bào nuôi cấy được kiểm tra OD600 trên máy quang phổ để xác định lượng tế bào cần thiết cho việc tách chiết Số lượng tế bào tối đa theo khuyến cáo của QiaGen là khoảng 5.107 tế bào cho một cột tách chiết Mẫu RNA tổng số của tế bào nấm men được tách chiết dựa trên kit tách chiết của Qiagen (RNeasy Mini Kit), trong đó tế bào được phá theo phương pháp dung giải enzyme Lấy 5x107

tế bào ly tâm ở 5000 vòng/ phút(v/p) trong 5 phút ở 40C, sau đó hòa trong 2 ml đệm Y1 (1M Sorbitol, 0.1 M EDTA, pH 7.4; 0.1% β-ME and 250 unit lyticase) Hỗn hợp lắc nhẹ trong 30 phút ở 30°C để tạo tế bào trần mẫu được ly tâm trong 5 phút ở 8000 v/p để thu tế bào trần Kết tủa thu được hòa trong 350 μl buffer RLT có chứa 1.43

M β-mercapto ethanol rồi khuấy mạnh nhằm dung giải tế bào trần Hỗn hợp được bổ sung 1 thể tích cồn ethanol 70%, đảo đều rồi đưa lên cột RNeasy có chứa màng lo ̣c Cartridges có tác dụng cố định RNA Cột RNeasy sau đó được ly tâm ở 13000 vòng trong 15 giây và phần dịch

đi qua màng sau đó sẽ bị loại bỏ Màng lọc gắn RNA của cột RNeasy được rửa lần 1 với 700μl dung dịch đệm RW1 và rửa lần 2 và lần 3 mỗi lần với 500 μl dung dịch đệm RPE qua

ly tâm 1 phút ở 13000v/p Sau đó, màng lọc được ly tâm thêm 1 phút nữa ở 13000v/p để loại

bỏ đệm dư thừa Màng lọc được đưa sang ống eppendorf mới; bổ sung 50 μl nước đã được xử

lý với DEPC và ly tâm trong 1 phút ở 13000v/p để thu mẫu mRNA tổng số Để quá trình thu mẫu hiê ̣u quả, bước thôi mẫu có thể được tiến hành 2 lần

Mẫu RNA được xử lý với DNaseI (6 units) để loại bỏ DNA tạp Hỗn hợp phản ứng ủ ở 37°C trong thời gian 30 phút Thêm 11 ul dung dịch EDTA 25mM, trộn đều ủ ở 65°C trong 10 phút

để dừng phản ứng bất hoạt enzyme DNase I Cuối cùng, mẫu tinh sạch qua cột lần nữa để loại

bỏ enzyme DNaseI và dung dịch đệm phản ứng

2.2.3 Kỹ thuật PCR

Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngưỡng chênh nhau 1 đơn vị tương đương với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lượng RNA của gene đích Tỷ lệ lượng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng được tính theo công thức:

2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR

Phản ứng Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I Chất này có đặc điểm là khi trong dung dịch có DNA mạch kép thì nó

sẽ gắn vào các sợi kép này và phát quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Ưu điểm của SYBR Green I là có nhiễu nền thấp và không gắn quá chặt vào sợi kép nên không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất của PCR Máy LightCycler được lập trình để thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu trong thời gian phản ứng Lượng sản phẩm PCR càng lớn, tín hiệu thu được sẽ càng mạnh Từ những tín hiệu này, máy sẽ số hóa và lưu lại dưới dạng dữ liệu thô

2.2.5 Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0

Xác định chỉ số Ct (Crossing Point) của mẫu Trong một phản ứng Real-time PCR, chu trình mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt lên trên mức huỳnh quang nền được gọi

là Ct (Crossing Point) của mẫu đó Trong đồ thị, Ct được thể hiệu khi đường cong đi lên đột ngột, là điểm mà sản phẩm PCR bắt đầu hiện diện trong số liệu Ct của một mẫu phụ thuộc vào nồng độ DNA ban đầu của mẫu đó Một mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp sẽ cần nhiều chu trình hơn và có chỉ số Ct cao, trong khi mẫu có nồng độ cao hơn sẽ cần ít chu trình hơn và

có Ct thấp

Định lượng tương đối đơn sắc/đơn kênh (Relative Quantification-Mono Color): Phân tích định lượng tương đối dựa trên cơ sở là nồng độ DNA tại Crossing Point là như nhau với tất cả các mẫu chứa cùng một loại DNA đích Mỗi mẫu đòi hỏi một số chu trình khác nhau để đạt tới Crossing Point, tùy thuộc vào nồng độ DNA ban đầu trong mẫu Đến cuối thí nghiệm, nồng độ DNA của các mẫu cũng khác nhau, phụ thuộc vào số chu trình đã được hoàn thành sau khi mẫu đó đạt tới Crossing Point Phương pháp định lượng tương đối sử dụng Ct, mức độ hiệu quả của phản ứng, số chu trình, và một số giá trị khác để xác định nồng độ DNA của các mẫu đã tăng như thế nào khi kết thúc PCR Các tính toán sau đó sẽ được sử dụng để so sánh giữa các mẫu và tính ra tỉ lệ cuối cùng giữa gene đích và gene tham chiếu

Đường cong nóng chảy (Melting Curves) và đỉnh nóng chảy (Melting Peak): Nhiệt độ nóng chảy của DNA có thể thay đổi trong một khoảng rộng, phụ thuộc vào trình tự, độ dài, và thành phần GC của chuỗi Chỉ cần sai khác một base giữa hai DNA đã có thể dẫn tới sự thay đổi nhiệt độ nóng chảy Chính bởi vậy, các chỉ số về nhiện độ nóng chảy có thể được sử dụng

để nhận diện sản phẩm DNA Để phân tích nhiệt độ nóng chảy, sự phát huỳnh quang của các mẫu cần được theo dõi trong khi nhiệt độ của máy LightCycler tăng lên chậm và đều Khi

nhiệt độ tăng, mức độ phát huỳnh quang sẽ giảm Trong trường hợp của chất nhuộm SYBR Green I, sự giảm này xảy ra do sự tách nhau của các mạch đơn trong DNA mạch kép, dẫn tới

sự giải phóng các phân tử SYBR Green I

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Lên men các chủng P pastoris tái tổ hợp

Các chủng P pastoris SMD1168 mang vector pPIC9 được nuôi cấy trên môi trường

MD đặc Kết quả điện di trên đã khẳng định các gene ngoại lai đã được đưa vào chủng P

pastoris MSD1168 và biểu hiện thành protein ngoại lai, đây là cơ sở để có thể tiến hành các

thí nghiệm tiếp theo

3.2 Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men

3.2.1 Tách chiết RNA tổng số

Kết quả trên hình cho thấy trên đường chạy có 2 băng điện di sắc nét, tương ứng với hai băng 28S và 18S của rRNA ribosome Sự xuất hiện của các băng này chứng tỏ RNA không bị phân cắt và mẫu đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm

3.2.2 Tinh sạch mRNA

Khi tách RNA luôn có lẫn một lượng DNA nhất định ở trong mẫu nên phải loại bỏ lượng DNA này, vì để kết quả phân tích Real-time PCR đòi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao và đặc biệt không bị lẫn DNA [30], nếu mẫu RNA còn lẫn DNA sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả thì nghiệm do DNA đó sẽ được nhân lên, nên việc loại bỏ DNA là yêu cầu bắt buộc

Mẫu được xử lý bằng enzyme DNaseI ở 37°C trong 30 phút để enzyme hoạt động loại bỏ toàn

bộ DNA còn lại trong mẫu Tiếp đó là bất hoạt enzyme bằng EDTA 25mM và cho mẫu qua cột để thu sản phẩm RNA có độ tinh sạch cao và không lẫn DNA

Để kiểm tra và đánh giá được chúng tôi dùng các phương pháp sau:

- PCR với mẫu RNA tổng số với cặp mồi đặc trưng cho gene il-2

- Điện di so sánh kết quả trước và sau khi loại DNA bằng enzyme DNaseI

- Thực hiện Real-time PCR với mẫu RNA để kiểm tra chất lượng của RNA có đảm bảo hay không

a Điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại DNA bằng enzyme DNaseI Qua ảnh điện di chúng ta thấy mẫu sản phẩm RNA tổng số sau khi xử lý loại DNA và làm sạch qua cột RNeasy-mini của QiaGene có độ sạch cao hơn

b Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của DNA trong mẫu RNA tách chiết

Khi mẫu RNA đã được xử lý bằng enzyme DNaseI thì các DNA lẫn sẽ bị phân giải hết,

để khẳng định được điều này và đồng thời thử đánh giá sảm phẩm tách, chúng tôi tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene il-2 để chứng minh mẫu có DNA hay không và chạy Real-time PCR để kiểm tra mRNA trong mẫu