Đánh giá sự biểu hiện Gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và Interleukin - 2 bằng kỹ thuật Real - ti

1 MỞ ĐẦU Protein tái tổ hợp ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực sản xuất và trong nghiên cứu khoa học…Việc nghiên cứu phát triển các loại protein mới hay tìm cách nâ

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-THÂN VĂN MINH

ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI

ALPHA (MF(ALPHA)1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ

HỢP SINH AMYLASE VÀ INTERLEUKIN-2 BẰNG KỸ THUẬT

REAL-TIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội –Năm 2012

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-THÂN VĂN MINH

ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI

ALPHA (MF(ALPHA)1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ

HỢP SINH AMYLASE VÀ INTERLEUKIN-2 BẰNG KỸ THUẬT

REAL-TIME PCR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS.TS Trương Nam Hải

Hà Nội – Năm 2012

i

LỜICẢM ƠN

Tôixinbày tỏlòngbiếtơnsâusắctới:GS.TS.TrươngNamHải-Trưởng

phòngKỹthuậtDitruyền,ViệntrưởngViệnCôngnghệsinhhọc,đãtậntìnhhướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Trongthờigianhọctậpvàlàmviệc,tôiđãnhậnđượcsựquantâmgiúpđỡ, chỉ

bảotậntìnhvềchuyênmôn,sựđộngviênquýbáucủa TS Lê Thị Thu Hồng, TS Dương

Cẩm Thúy,ThS.NguyễnHồngThanh, CN Trần Nhật Anhvàcác anh chị

tạiphòngKỹthuậtDitruyền–ViệnCôngnghệsinh học,ViệnKhoa học vàCôngnghệViệtNam.Nhândịphoànthànhluậnvăn này,tôixin bàytỏlòng biếtơnsâusắccủamìnhtới sựgiúpđỡvôcùngquýbáuđó

Tôicũngxintrântrọngcảmơncácthầy TrườngĐạihọcKhoa họcTựnhiên,ĐạihọcQuốcgiaHàNội,đãtậntìnhgiảngdạy, dìudắt tôi trongthờigianhọctậptạitrường

giáo,côgiáotrongKhoaSinhhọc-Cuốicùng,tôixingửilờicảmơnđếnngườithântronggiađìnhvàbạnbè đã độngviênvàgiúpđỡtôi trongsuốtthờigianhọctậpvànghiêncứuvừaqua

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 3

1.1.1 Đặc điểm hệ biểu hiện P pastoris 3

1.1.2 Những ưu điểm của hệ biểu hiện P pastoris 5

1.1.3 Quá trình chuyển hóa methanol ở P pastoris 7

1.1.4 Cơ chế tiết protein ở nấm men 8

1.1.5 Vector biểu hiện gene ngoại lai của P pastoris 10

1.2 Tổng quan về α-factor và geneMF(ALPHA)1 12

1.3 Tổng quan về các protein ngoại lai trong đề tài 15

1.3.1 Tổng quan về Interleukin-2 15

1.3.2 Tổng quan về α-amylase: 17

1.4 Kỹ thuật Real-time PCR 18

1.4.1 Tổng quan về Real-time PCR 18

1.4.2 Phân tích kết quả Real-time PCR 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Chủng vi sinh vật và các gene biến nạp 24

2.1.2 Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR 24

2.1.3 Hóa chất, enzyme và các thiết bị máy móc 24

2.1.4 Phần mềm 25

2.1.5 Các loại môi trường và dung dịch 25

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp lên men và nuôi cấy các chủng P pastoris tái tổ hợp 27

2.2.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P pastoris 27

2.2.3 Kỹ thuật PCR 29

2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR 30

2.2.5 Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0 31

iv

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Lên men các chủng P pastoris tái tổhợp 33

3.2 Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men 36

3.2.1 Tách chiết RNA tổng số 36

3.2.2 Tinh sạch mRNA 37

3.2.3 Đo hàm lượng các mẫu RNA tổng số 40

3.3 Tối ưu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR 42

3.3.1 Tối ưu điều kiện Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 42

3.3.2 Tối ưu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 43

3.4 Kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1 44

3.5 Real-time PCR về biểu hiện của gene MF(ALPHA)1 46

3.5.1 Kết quả Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1 47

3.5.2 Phân tích so sánh mức độ biểu hiện gene MF(ALPHA)1 50

3.6 So sánh kết quả Real-time PCR và Microarray 53

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

v

MỤC LỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Các chủng biểu hiện P Pastoris 4

Bảng 3.1: Kết quả đo hàm lƣợng RNA bằng máy đo NanoDrop 41 Bảng 3.2: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trong Real-time PCR kiểm tra sự biểu hiện của

gene nội chuẩn IPP1 ở các chủng P pastoris nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau

của quá trình lên men 46 Bảng 3.3: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình trong Real-time PCR của gene

MF(ALPHA)1 ở các chủng P pastoris ở các thời điểm lên men 50

Bảng 3.4: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P pastoris control theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình 52 Bảng 3.5: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung

bình 52

Bảng 3.6: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ ngƣỡng

trung bình 52

vi

MỤC LỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Hình thái của nấm men P pastoris 3

Hình 1.2: Con đường chuyển hóa methanol trong nấm men P Pastoris 8

Hình 1.3: Sơ đồ khái quát quá trình phân khu các protein ở sinh vật nhân chuẩn 9

Hình 1.4: Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 11

Hình 1.5 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4 12

Hình 1.6: Thiết kế tạo các chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp 14

Hình 1.7 : Cấu trúc không gian của IL-2 16

Hình 1.8: Sơ đồ tiến hành phản ứng Realtime-PCR 20

Hình 1.9: Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sánh kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt 22

Hình 1.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy cho phép xác định Tm nhờ các đỉnh biểu đồ chảy của từng ống phản ứng 23

Hình 3.1: Các chủng P pastoris tái tổ hợp nuôi cấy trên môi trường MD đặc 33

Hình 3.2: Biểu đồ sinh trưởng của các chủng P Pastoris theo thời gian 34

Hình 3.3: Kết quả điện di kiểm tra protein ngoại lai được biểu hiện ở các chủng P Pastoris mang gene ngoại lai tại các thời điểm lấy mẫu khác nhau 35

Hình 3.4: Kết quả điện di RNA tổng số tại các thời điểm ở lần lên men thứ 1 37

Hình 3.5 Điện di mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại DNA 38

Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA 39

Hình 3.7: Kết quả Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 42

Hình 3.8 Kết quả sản phẩm Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 sử dụng 2 loại mồi ngược và ở 2 nhiệt độ gắn mồi 58°C và 59°C 43

Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 của các mẫu trong Real-time PCR 45

vii

Hình 3.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại gene IPP1 trong

Real-time PCR 45

Hình 3.11: Biểu đồ khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 của các mẫu nghiên cứu

trong real time PCR 48

Hình 3.12: Biểu đồ đỉnh chảy sản phẩm khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 của

các mẫu nghiên cứu trong real time PCR 49Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Real-time PCR với đoạn gene

1

MỞ ĐẦU

Protein tái tổ hợp ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực sản xuất và trong nghiên cứu khoa học…Việc nghiên cứu phát triển các loại protein mới hay tìm cách nâng cao năng xuất biểu hiện của một hệ thống vật chủ từ lâu đã được quan tâm nghiên cứu Một sản phẩm protein tái tổ hợp mới phụ thuộc rất nhiều vào việc chọn vật chủ biểu hiện, hiện nay vẫn chưa có một loại vật chủ phù hợp cho biểu hiện mọi loại protein nên trước khi bắt đầu sản xuất ở mức độ công nghiệp chúng ta phải lựa chọn một hệ thống biểu hiện phù hợp Có rất nhiều hệ thống biểu hiện được thương mại hóa để biểu hiện protein tái tổ hợp như sử dụng sinh vật nhân

sơ như E.coli, Bacillus… hay sinh vật nhân chuẩn như Nấm men Sacharomyces

cerevisiae, Pichia pastoris … hay các tế bào bậc cao như tế bào côn trùng hay tế

số phương pháp đã được sử dụng như: thay thế mã bộ ba cho phù hợp, biểu hiện đồng thời với chaperone hoặc với các protein khác, gây đột biến một số gen của chủng biểu hiện tối ưu điều kiện nuôi cấy … Tuy nhiên không phải tất cả các trường hợp đều thành công do những hiểu biết về di truyền phân tử và quá trình lý hóa trong chủng nấm men này vẫn còn hạn chế

Những kết quả phân tích so sánh hệ transcriptome của chủng P pastoris đối

chứng, chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase sử dụng YEAST_2 array, bao gồm khoảng 12.000 bô ̣ mẫu dò đă ̣c hiê ̣u cho các gen trong hê ̣

genome của S cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe cho thấy có 6 gene có sự

khác biệt trong biểu hiện gen giữa các chủng nghiên cứu trong đó có gene mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1 [15]

2

GeneMF(ALPHA)1 mã hóa cho α-factor có vai trò trong sinh sản của nấm men Gene(MF(ALPHA)1 không có mặt trong chủng P pastoris gốc ban đầu, nhưng trong vector biểu hiện pPIC9, được đưa vào các chủng nấm men P pastoris

trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào thông báo

về mối liên hệ giữa sự biểu hiện của gen ngoại lai và gene(MF(ALPHA)1 trong các

hệ biểu hiện

Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của gene(MF(ALPHA)1 trong các chủng

nghiên cứu sẽ được đánh giá bằng kỹ thuật Real-time PCR với mồi đặc hiệu Đây là phương pháp thông dụng nhất hiện nay được sử dụng để khẳng định lại kết quả microarray Kỹ thuật Real-time PCR đánh giá sự biểu hiện của gen sẽ có độ nhạy, độ chính xác lớn hơn và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn hơn để đánh giá sự

biểu hiện của gene(MF(ALPHA)1 từ đó có những định hướng cho những nghiên

cứu tiếp theo nhằm nâng cao mức độ biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng nấm

men P pastoris tái tổ hợp

Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá sự biểu biểu hiện gen

mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp

sinh amylase và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR”

Công việc được tiến hành tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris

1.1.1.Đặc điểm hệ biểu hiệnP pastoris

P pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae sinh vật nhân chuẩn, có khả năng

chuyển hóa methanol Nấm men này là sinh vật đơn bào, tế bào có dạng hình elip hoặc hình cầu và sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và sinh sản hữu tính bằng hình thức tiếp hợp (Hình 1.1)

Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P pastoris đều có nguồn gốc từ

chủng dại NRRL-Y 11430, và có thể được chia thành: các chủng dại (X-33, 114430); các chủng có quá trình đột biến làm khuyết histidinol dehydrogenase (GS115); các chủng có đột biến gây mất các gene liên quan tới quá trình sử dụng methanol (KM71, MC 100-3); các chủng khuyết protease (SMD1163, SMD1165, SMD1168) [19]

Y-Hình 1.1: Y-Hình thái của nấm men P pastoris[44]

4

Bảng 1.1: Các chủng biểu hiệnP Pastoris

-KM71H His4 arg4 aox1Δ::AGR4 Muts His

MC100-3 His4 ar4g aox1Δ::SAGR4

aox2Δ::Phis4 Mut-HisSMD1168 Pre4Δ his4 Mut+His- khuyết protease SMD1165 Prb 1 his4 Mut+His- khuyết protease

-Hầu hết các chủng mang đột biến ở genedehydrogenase histidinol (his4) để

cho phép lựa chọn các vector biểu hiện chứa his4 khi biến nạp khi DNA plasmid được biến nạp vào nấm men, ta thường nhận được các chủng tái tổ hợp thường có

ba kiểu hình: Mut+, Muts, Mut-[10, 12] Chủng có kiểu hình Mut+ phát triển tốt trong môi trường chứa methanol như chủng dại (X-33 và GS115) Chủng bị đột

biến mất geneAOX1 có kiểu hình Muts, còn chủng bị đột biến mất cả hai geneAOX

có kiểu hình Mut-, các chủng này sinh trưởng chậm trong môi trường có methanol

Ở chủng KM71H (his4 arg4 aox1Δ::AGR4) phần lớn gen AOX1 bị loại bỏ và thay bởi geneAGR4 của S cerevisiae, nên phải dựa vào gen AOX2 để tạo enzyme AOX

do đó tốc độ sinh trưởng trong methanol chậm Chủng MC100-3 (his4 arg4 aox1Δ::

SAGR4 aox2Δ::Phis4) có kiểu hình Mut-, bị loại bỏ cả hai gen AOX và thế bởi geneAGR4 và genePhis4 Chủng này không thể sinh trưởng trong môi trường có

methanol Tất cả các chủng, ngay cả chủng đột biến Mut-, đều có khả năng biểu hiện tốt qua promoter AOX1 Một số chủng có kiểu hình khuyết protease như: SMD1163, SMD1165 và SMD1168, có khả năng hạn chế sự gia tăng của protease một yếu tố quan trọng làm mất tính ổn định và giảm tiết protein ngoại lai, đặc biệt là trong môi trường lên men có mật độ tế bào cao, nên thường được dùng để biểu hiện các protein ngoại lai

5

1.1.2 Những ưu điểm của hệ biểu hiện P pastoris

E coli đã được sử dụng như vật chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp từ rất sớm,

tuy nhiên vì E coli là sinh vật nhân sơ nên không có khả năng thực hiện việc cải

biến sau dịch mã, nên loại protein được biểu hiện bị giới hạn, đặc biệt là protein có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn [18] Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp

trong E coli phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm cấu trúc của protein muốn biểu hiện

Khi protein muốn biểu hiện ở dạng tan nếu việc tạo cấu trúc bậc cao bị lỗi sẽ dẫn tới việc tạo thành các thể vùi nên yêu cầu có bước làm tan và tái gấp nếp để có protein

có đúng cấu trúc mong muốn tuy nhiên việc này không hề dễ dàng, tiêu tốn nhiều

thời gian, dẫn tới việc giảm nồng độ sản phẩm và tăng giá thành biểu hiện E coli

thường không phù hợp cho những nghiên cứu biểu hiện protein có cầu nối disulphide cao hoặc những protein yêu cầu có sự cải biến sau dịch mã như: glycosyl, phosphoryl hóa, lipid hóa, tạo cầu disulphide, sunfat hóa… Do đó, protein

tái tổ hợp được tạo ra từ E coli có thể bị thay đổi chức năng Trong trường hợp đó những hệ thống biểu hiện eukaryote như S cerevisiae, P pastoris… được ưu tiên

sử dụng[41]

Đối với S Cereviasiaetuy có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã của

eukaryote nhưng thường có sự glycosyl hóa quá mức với chiều dài chuỗi carbonhydrate gắn vào protein rất lớn từ 50-150 phân tử mannose Điều này làm tăng cao khối lượng phân tử của protein và đồng thời gây nên tính kháng nguyên ở

các protein tái tổ hợp Ngoài ra, quá trình N-glycosyl hóa ở S.cerevisiae luôn có

chứa các liên kết α-1,3 glycan ở các đầu kết thúc Các liên kết này có tính kháng nguyên cao nên cũng góp phần làm tăng tính kháng nguyên của phân tử protein [34, 37]

P pastoris có khả năng thực hiện nhiều biến đổi sau dịch mã đặc trưng

củasinh vật nhân chuẩn như: xử lý các trình tự tín hiệu (gồm cả dạng pre và prepro), gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide, glycosyl hóa, phosphoryl hóa, acetyl hóa, sunfat hóa, và gắn gốc đường ở đầu O và N góp phần làm tăng khả năng tan, ổn định về tính chất của protein và tạo nên các phân tử protein có hoạt tính sinh học Bên cạnh

6

đó Pichia cũng gắn các gốc đường với số mannose ngắn hơn nhiều so với S

cerevisiae Ngoài ra quá trình N- glycosyl hóa ở P pastoris thường chỉ gắn chuỗi

carbonhydrate với 8-14 phân tử mannose và không chứa các liên kết α-1,3 glycan ở các đầu kết thúc, do vậy chúng không làm tăng tính kháng nguyên của các protein [34] Đây là một đặc điểm nổi trội mà những hệ thống biểu hiện nhân sơ không

có được [24] Do đó P pastoris thường được lựa chọn để biểu hiện các protein có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn Thêm vào đó, P pastoris có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với S cerevisiae, [10, 18, 24] và có khả năng phát triển

ở dải pH rộng (từ 3 tới 7) do đó có thể điều chỉnh pH để tăng năng suất tạo protein, giảm các sản phẩm phụ và giảm thiểu tối đa tác động của protease [28]

Với promoter mạnh như AOX1 hoặc GAPDH, lượng protein tạo ra từ P

pastoris có thể tăng đến 30% tổng số protein tế bào[12] Gene được điều khiển bởi

các promoter này khi được kết hợp vào bộ gen của P pastoris sẽ tạo lên một chủng

có khả năng biểu hiện protein ở mức cao với hàm lượng lên đến vài gram/L Trong

đó promoter AOX1 được đặc biệt quan tâm vì khả năng cảm ứng bằng methanol, thuận lợi trong việc kiểm soát biểu hiện của gene[4]

Chất cảm ứng biểu hiện protein là methanol, rẻ tiền hơn so với chất cảm ứng

của hệ thống biểu hiện E coli là IPTG Thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản,

chi phí lên men thấp, không đòi hỏi các yếu tố tăng trưởng hoặc các chất bổ sung vốn đắt tiền Quá trình lên men có thể được thực hiện nhanh chóng đáp ứng các yêu cầu lên men, các thông số ảnh hưởng đến quá trình sản xuất cũng như hoạt tính protein như pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm soát

Các hệ thống biểu hiện bậc cao thường phải tiến hành nuôi cấy tế bào trên môi trường đắt tiền, thường mất nhiều thời gian và tốn kém, hơn nữa hiệu suất biểu hiện protein lại không cao

Cho đến nay, P pastoris đã được sử đụng để biểu hiện hơn 200 protein tái tổ

hợp khác nhau có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, thực vậtvà động vật, trong đó có protein của người

7

1.1.3 Quá trình chuyển hóa methanol ở P pastoris

P pastoris có khả năng sử dụng methanol như nguồn cacbon và năng lượng

duy nhất Quá trình chuyển hóa methanol xảy ra trong bào quan chuyên biệt là peroxisome để tránh tác dụng gây độc của hydrogen peroxide Các con đường chuyển hóa methanol trong nấm men liên quan tới một hệ enzyme, một trong số đó là enzyme alcohol oxydase (AOX) Enzyme này xúc tác phản ứng oxy hóa methanol thành formaldehyde Đây là bước đầu tiên của quá trình chuyển hóa methanol (Hình1.2) Phản ứng này tạo ra sản phẩm phụ hydrogen peroxide là chất gây độc cho tế bào Vì lý do này nên phản ứng đầu tiên phải xảy ra trong peroxisome do cơ quan nội bào này có thể thu hồi và phân giải H2O2[9] Formaldehyde được chuyển từ peroxisome ra ngoài tế bào chất và tham gia vào các con đường trao đổi chất khác Có hai gen mã hóa cho alcohol oxydase là AOX1 và

AOX2 GeneAOX1 chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính AOX1 của tế bào Quá trình biểu hiện geneAOX1 được điều hòa chặt chẽ bởi cơ chế ức chế/kìm hãm và cơ

chế cảm ứng Tuy nhiên, sự có mặt của methanol là cần thiết để kích hoạt phiên mã

geneAOX1 lên mức độ cao hơn Do alcohol oxidase là enzyme có hoạt tính thấp với

oxy phân tử, nên tế bào nấm men tổng hợp một lượng lớn enzyme này để bù lại [10, 12] Đây là một trong những nhân tố cơ bản trong quá trình phát triển hệ biểu hiện

P pastoris, promoter điều khiển tổng hợp AOX cũng được thiết kế cho quá trình

tổng hợp protein ngoại lai

8

1.1.4 Cơ chế tiết protein ở nấm men

Protein ngoại lai được biểu hiện trong tế bào nấm men muốn được tiết ra khỏi tế bào cần phải chứa một tín hiệu tiết ở đầu N để giúp cho các protein có thể đi qua màng tế bào Các trình tự tiết tự nhiên của nấm men đã được sử dụng nhiều là: SUC2 (invertase), PHO5 (acid phosphatase) và MT-α-1 (nhân tố tiếp hợp α) [22,

39, 41] Mặc dù nhiều trình tự tín hiệu tiết khác nhau đã được sử dụng thành công,

trình tự tín hiệu tiết prepropeptide α-factor của S cerevisiae được xem là thành

công nhất [13]

Vectơ dùng cho biểu hiện gene ngoại lai trong P pastoris có chứa tín hiệu tiết

được thiết kế sẵn, thông thường là POH1 hoặc MF-α (α-MF prepro) Đây là tín hiệu

có nguồn gốc từ nấm men S cerevisiae Tín hiệu này gồm khoảng 89 amino acid

giúp protein đi qua màng của mạng lưới nội chất dễ dàng Trong khi chuyển vào lưới nội chất, trình tự tiết MF- α của protein sẽ được loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã

sơ cấp và protein được tiết ra môi trường là các protein hoàn chỉnh [9, 41] Đồng thời, trong khi đi vào lưới nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác như quá trình glycosyl hóa Sau khi được chế biến trong mạng lưới nội chất, protein

Hình 1.2: Con đường chuyển hóa methanol trong nấm men P pastoris[19]

Hình 1.3: Sơ đồ khái quát quá trình phân khu các protein ở sinh vật nhân

chuẩn[43]

10

các trình tự tín hiệu đích khác nhau sẽ hấp thụ bởi các bào quan chuyên biệt tương ứng: ti thể 3a, 4a, lục lạp 3b, peroxisome 3c, 4b hoặc nhân 3d, 4c

1.1.5 Vector biểu hiệngene ngoại lai củaP pastoris

1.1.5.1 Đặc điểm chung của vector biểu hiện củaP pastoris

Có nhiều vector biểu hiện dành cho P pastoris đã được thiết kết và đều có 5

yếu tố sau [19]:

1 Promoter mạnh: thường là promoter AOX1 (5’ AOX1) là một đoạn trình tự

có chiều dài gần 1kb, cho phép protein được biểu hiện mạnh trong Pichia và định

hướng plasmid tích hợp vào hệ gene nấm men tại locus AOX1 Ngoài ra còn có

trình tự nằm sau trình tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gene AOX1 có tác dụng

định hướng plasmid tích hợp với hệ gene nấm men tại vị trí locus AOX1 [24]

2 Có một hoặc nhiều vị trí đa cắt nối (MCS): cho phép chèn gene mong muốn vào vector biểu hiện

3 Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ geneAOX1 của P pastoris là

trình tự dài khoảng 260 bp, cho phép kết thúc quá trình dịch mã và sự thêm đuôi poly A ở mRNA có hiệu quả cao

4 Gene chỉ thị chọn lọc (His4): là một gen nguyên vẹn của Pichiamã hóa cho

histidinol dehydrogenase, dài khoảng 2,4 kb và được sử dụng để bổ sung cho các

chủng Pichia bị đột biến genehis4

5 Một trình tự cần thiết cho sự sao chép và tồn tại của plasmid trong vi khuẩn (Ampicillin và ColE1 origin): Amp là gene kháng ampicillin cho phép chọn lọc tế bào mang vector tái tổ hợp ColE1 cho phép plasmid tái tổ hợp sao chép và tồn tại trong tế bào vi khuẩn

Ngoài ra một số vector biểu hiện còn có trình tự chuyên biệt kích thích quá trình tiết protein tái tổ hợp ra môi trường nuôi cấy như PHO1 của gen mã hóa cho

phosphatase trong P pastoris hoặc trình tự của gene mã hóa cho nhân tố giới tính α (α factor prepro peptide) của S cerevisiae[27]

11

1.1.5.2 Vector pPIC9

Khi sử dụng promoter AOX1 để biểu hiện protein ngoại lai có thể dùng các vector như: pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1, và pPIC9 Các vector pHIL-D2, pPIC3.5 được dùng biểu hiện protein nội bào, pHIL-S1, và pPIC9 được dùng để biểu hiện

protein ngoại bào Vector pPIC9 được sử dụng nhiều trong P pastoris

Đầu 5’ promoter AOX1 (nucleotide base 1-948), vị trí mồi 5’ AOX1 875), tín hiệu tiết (α factor) (S) (949-1218), vị trí mồi α (1152-1172), vùng đa nối (1192-1241), vị trí mồi đầu 3’AOX1 (1327-1347), đoạn kết thúc dịch mã 3’AOX1 (1253-1586), khung đọc mở (ORF)HIS4 (4514-1980), đoạn 3’AOX1 (4870-5626), ColE1 origin (6708-6034), gene kháng Ampicillin (713-6853)

(855-1.1.5.3 Tích hợp gene ngoại lai vào P pastoris

Các vector biểu hiện trong P pastoris được thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay locus his4 Giống như ở S cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định quá trình biến nạp vào P pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương

đồng trong bộ gene nấm men DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong bộ gene tế bào chủ

Hình 1.4: Bản đồ vector biểu hiện pPIC9[42]

1.2 Tổng quan về α-factor và geneMF(ALPHA)1

Sự sinh sản ở nấm men S cerevisiae liên quan đến sự tiết và đáp ứng của các

peptide pheromone [26] Các tế bào alpha tiết các nhân tố alpha (α-factor) để đáp ứng với nhân tố a và các tế bào a tiết nhân tố a để đáp ứng với các nhân tố alpha Đáp ứng của pheromone dẫn tới sự dừng lại trong pha G1 của chu kỳ tế bào, các thay đổi ở thành tế bào, sự biến đổi hình thái và sự cảm ứng của các gene mã hóa cho các sản phẩm liên quan đến quá trình sinh sản hay còn gọi là đáp ứng pheromone Các thể đột biến không sản xuất đƣợc pheromone sẽ không thể sinh sản đƣợc (sẽ không có khả năng kết hợp) [39]

Nhân tố alpha là một chuỗi peptide gồm 13 amino acid (aa) đƣợc mã hóa bởi

2 gene cấu trúc riêng biệt MF1, MF2 Hai gene này mã hóa cho các tiền peptide (tiền pheromone) lần lƣợt gồm 165aa và 120 aa [39] Cả hai tiền nhân tố đều có một

Hình 1.5 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4 [25]

13

chuỗi tín hiệu, một vùng điều khiển (vùng này chứa 3 điểm liên quan đến quá trình đường hóa đầu N), tiếp đến là vùng đệm và hai nhân tố alpha liên tiếp tương ứng

với mỗi tiền nhần tố Trong vùng đệm của geneMF1 chứa 4 trình tự lặp lại tất cả

chúng đều mã hóa cho peptide đồng nhất với trình tự của alpha được nấm men tiết

ra, vùng đệm của MF2 chứa 2 trình tự lặp lại, một trình tự mã hóa nhân tố alpha (Gln-5, Lus-7 α-factor), trình tự còn lại mã hóa cho peptide có sự khác biệt với nhân

tố alpha bởi sự thay thế 2aa (Asn-5, Arg-7 nhân tố alpha, do đó được gọi là factor’) [16] Tiền nhân tố MF1 sẽ trải qua nhiều bước biến đổi để tạo ra nhân tố alpha trưởng thành, MF1 trưởng thành phụ trách việc sản xuất của α-factor[27] Các nghiên cứu về α-factor’ cho thấy nó cũng tương đương với nhân tố alpha trong việc cảm ứng nhiều quá trình của đáp ứng pheromone bao gồm việc dừng chu

α-kỳ tế bào, cảm ứng quá trình kết dính Phải cần ít nhất 1 geneMF cho việc sản xuất

nhân tố alpha và quá trình sinh sản, bởi vì thể đột biến MF1/MF2 không có khả năng sản xuất nhân tố alpha và khả năng sinh sản [23] Đáng chú ý là việc bổ sung nhân tố alpha cho chủng MF1MF2 không thể khôi phục khả năng sinh sản của nó giống như chủng không đột biến Những kết quả tương tự cũng thu được với các chủng đột biến mà các gene cấu trúc của nhân tố alpha bị phá bỏ, việc bổ sung nhân

tố alpha từ bên ngoài cũng không thể khôi phục được khả năng sinh sản của thể đột biến MF1/MF2 [41] Một giả thiết để giải thích cho các kết quả này đó là các tiền MFα và MFA giữ nhiều vai trò trong quá trình sinh sản, vai trò trong sản xuất pheromone và các vai trò khác chưa sáng tỏ Một thể đột biến đặc biệt của mf1 (MF1::URA3A) có kiểu hình khác biệt, có khả năng kết hợp ở cường độ thấp hơn

10 lần so với thể đột biến vô hiệu (bất hoạt) MF1 mất toàn bộ geneMF1[20, 22]

Thể đột biến MF1::UR3A mã hóa cho protein lai bao gồm trình tự tín hiệu của

geneMF1, vùng điều kiển và trình tự vùng đệm, theo sau bởi rất nhiều amino acid

được mã hóa bởi đoạn URA3 [22, 39] Kiểu hình của thể đột biến MF1::URA3A cho thấy sản phẩm này của gene lai ức chế quá trình sinh sản, MF1::URA3A là thể

đột biến thay đổi chức năng và do đó vùng điều thuộc geneMF1 của chủng nguyên

14

bản có lẽ đóng vai trò tăng cường sự hợp nhất Như vậy geneMF(ALPHA) đóng vai trò kiểm soát và điều hòa quá trình sinh sản của nấm nem S cerevisiae[8]

GeneMFALPHA gồn 2 gene là geneMF(ALPHA)1 và gene MF(ALPHA)2 mã

hóa pheromone lai alpha-factor ở tế bào alpha ở nấm men Tuy nhiên, phần lớn

pheromone lai alpha được tạo ra bởi geneMF(ALPHA)1

Trình tự cấu trúc geneMF(ALPHA)1:

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGCATTGGTTGCAACTAAAACCTGGCCAACCAATGTACAAGAGAGAAGCCGAAGCTGAAGCTTGGCATTGGCTGCAACTAAAGCCTGGCCAACCAATGTACAAAAGAGAAGCCGACGCTGAAGCTTGGCATTGGCTGCAACTAAAGCCTGGCCAACCAATGTACAAAAGAGAAGCCGACGCTGAAGCTTGGCATTGGTTGCAGTTAAAACCCGGCCAACCAATGTACTAA [44]

GeneMF(ALPHA)1 không có trong chủng P pastoris gốc ban đầu, nhưng trong vector biểu hiện pPIC9, do đó được đưa vào các chủng nấm men P pastoris

trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp (Hình 1.6)

pPIC9

S 3‘TAOX1

15

A- chủng control; B- các chủng tái tổ hợp sinh protein ngoại lai: chủng sinh amylase hoặc và chủng sinh interleukin-2 5’PAOX1: trình tự 5’ AOX1 promoter; S- tín hiệu tiết α-factor.(MF(ALPHA1));3’TAOX1: 3’AOX1 terminator; 3’AOX1: trình

tự 3’ AOX1; Amp: gene kháng kháng sinh Ampiciline; GOI: gene ngoại lai tích hợp

vào genome của chủng P pastoris SMD1168 genome (AMY/IL-2)

1.3 Tổng quan về các protein ngoại lai trong đề tài

1.3.1 Tổng quan về Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2) ở người được biết đến dấu tiên như yếu tố kích thích tăng trưởng tế bào T, nó là một lymphokine có khả năng quản lý đáp ứng miễn dịch mạnh và đã được xác định như một chất dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư IL-2 là một cytokine do tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch tổng hợp nên IL-2 được Morgan D.A và các cộng sự phát hiện năm 1975 có hoạt tính kích thích sự sinh trưởng của các tế bào lympho T có nguồn gốc từ tủy xương IL-2 cũng là một trong

những cytokine đầu tiên được xác định ở mức độ phân tử Geneil-2 được Devos và

các cộng sự nhân dòng năm 1983 Sau đó cấu trúc tinh thể của nó được làm sáng tỏ năm 1992 bởi Taniguchi và các cộng sự Về bản chất, IL-2 là một glycoprotein được tiết dưới dạng monome với khối lượng phân tử xấp xỉ 15 kDa IL-2 tồn tại với cấu trúc không gian có 4 xoắn α tạo thành dạng khá điển hình của cytokine loại 1 IL-2, cũng được gọi là yếu tố tăng trưởng tế bào T, lần đầu tiên được mô tả như là một lymphokine có khả năng hoạt hóa in vitro các tế bào T IL-2 cũng đã được quan sát thấy nhiều khả năng điều chỉnh miễn dịch khác như tính chất gây độc của tế bào

T, các tế bào giết tự nhiên (NK), kích hoạt tế bào B, và hoạt hóa các tế bào giết (LAK) Trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã, protein hIL-2 bị cắt đoạn trình tự tín hiệu tiết dài 20 acid amin và tạo thành hIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 amino acid

16

Các kết quả nghiên cứu cho thấy có 3 vùng trên phân tử IL-2 có vai trò quyết định hoạt tính sinh học của cytokine này đó là: i) vùng tận cùng đầu N (các gốc acid amin 1-20), ii) vùng tận cùng đầu C (các gốc acid amin 121-133) và iii) cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105 [11] Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các đột biến mất 20 acid amin ở đầu N và 10 acid amin ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL-2 Phân tích trình tự acid amin cho thấy IL-2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các

vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide Việc hình thành chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định đến hoạt tính sinh học của IL-2 Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy đột biến ở gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide có thể làm giảm 8-10 lần hoạt tính của IL-2, trong khi đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm tới 250 lần Tuy nhiên sự đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hưởng rất ít đến hoạt tính IL-2 và sự thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser không ảnh hưởng tới hoạt tính của IL-2 Do vậy, đột biến thay đổi Cys ở vị trí 125 thành Ser có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc này với hai gốc Cys ở vị trí 58 và 105 Ngoài ra, tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí

Hình 1.7 : Cấu trúc không gian của IL-2 [40]

17

acid amin đầu tiên IL-2 trong tự nhiên tồn tại dạng glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vậy liều lượng lớn IL-2 sẽ gây nên độc tính của protein này trong cơ thể Vì vậy, IL-2 dạng thương phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ bị loại bỏ các gốc đường ở đầu N [14]

1.3.2 Tổng quan về α-amylase:

Amylase là nhóm enzyme phổ biến có cả trong thực vật, động vật, và các vi sinh vật Anselme Payen và Jean Peroz lần đầu tiên tinh sạch được amylase từ mạch nha và năm 1835 [20] Cho đến ngày nay amylase vẫn là enzyme được sử dụng nhiều trong trong các lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, sản xuất bia rượu, nước uống, thuốc trong y học…

Amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết glycoside của tinh bột, glycogen và các polysaccaride tương tự Sự tác động của nhóm enzyme này lên cơ chất theo hai hướng: các amylase nội phân cắt cơ chất một cách ngẫu nhiên tại các liên kết nằm bên trong phân tử và các amylase hướng ngoại thủy phân cơ chất từ đầu không khử Cơ chất chủ yếu của amylase là tinh bột một loại polysaccaride dự trữ phổ biến ở thực vật Đây là nguồn cung cấp cacbon, năng lượng chủ yếu cho động vật Tinh bột được hình thành từ hai đơn vị cơ bản là: malose và amylopectin

Cả hai đều được cấu tạo từ α-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết glycoside tạo thành các chuỗi liên tục, ngoài dạng thẳng, amylopectin còn có cấu trúc phân nhánh và tại điểm phân nhánh là liên kết α-1,6-glycoside Tỷ lệ phân nhánh là đặc điểm quan trọng của cơ chất vì các enzyme thủy phân cơ chất với tính đặc hiệu khác nhau [35]

Amylase có thể chia làm 3 dạng chính là: α-amylase, β-amylase và glucoamylase Các enzyme này khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng với liên kết glycoside và một số tính chất khác

α-amylase (EC3.2.1.1) có nhiều trong hạt nẩy mầm, tụy tạng, dịch tiếu hóa của động vật và trong cả vi khuẩn α-amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân bên trong chuỗi, chúng cắt ngẫu nhiên các liên kết α-1,4-glycoside nằm bên trong phân tử tinh

α-Amylase của nấm men như S fibuligera đã được nghiên cứu gồm 6 trình

tự aixit amin có tính bảo thủ cao nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme Axit amin tryptophan tại vị trí 84 (W84) là vùng bảo thủ thứ nhất và sự thay thế nó bởi leucin (L) sẽ làm tăng hoạt tính transglycosylation của nấm nem Ngoài ra, axit amin tyrosin tại vị trí 83 (Y83) cũng giữ vai trò quan trọng trong sự thủy phân bởi tính bảo thủ cao của nó trong cấu trúc enzyme xuất phát từ nhiều nguồn khác nhau

Sự thay thế Y(83) bởi W, L hoặc N sẽ làm tăng cường hoạt tính transglycosylation mạnh hơn đối với cơ chất maltoheeptoza so với khi thay thế W(84) bởi L [35] Mỗi phân tử enzyme yêu cầu ít nhất một ion Ca2+để duy trì cấu trúc bậc 4 của nó Khi cho thêm EDTA vào hỗn hợp phản ứng thì chất này sẽ tách io kim loại

ra khỏi hỗn hợp phân tử enzyme, do đó làm bất hoạt α-amylase Hoạt tính của enzyme sẽ được phục hồi trở lại nếu sau đó hỗn hợp phản ứng được ủ với nồng độ

Ca2+cao.Ngoài ra Ca2+các ion kim loại khác như Mg2+cũng cần thiết đối với hoạt động của enzyme Tuy nhiên khi bất hoạt enzyme sẽ không phôi phục trạng thái hoạt động nếu ủ ở Mg2+ Điều này cho thấy rằng, ion Ca2+rất cần thiết để biểu hiện hoạt tính của emzyme và Ca2+không thể thay thế bằng Mag2+

1.4 Kỹ thuật Real-time PCR

1.4.1 Tổng quan về Real-time PCR

Trong kỹ thuật PCR truyền thống kết quả của thí nghiệm chỉ được xác định khi đã hoàn tất các công đoạn của thí nghiệm, do đó công đoạn PCR thường mất rất nhiều thời gian Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bước đột phá trong

19

công nghệ sinh học Kỹ thuật này cho phép xác định kết quả của thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chính vì vậy được gọi là “Real-time” Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định lượng rất rộng, độ nhạy cảm cao

đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao (độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,2 chu kỳ) [6, 7, 18, 35] và phạm vi ứng dụng lớn Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR đã cải thiện đáng kể và đơn giản hóa định lượng DNA và RNA, kỹ thuật này đã trở thành một công cụ có giá trị lớn cho người nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử [17, 21, 34] Các biểu hiện của tất cả các gene trong một mẫu có thể được tạm đánh giá bằng các kỹ thuật microarray Nhưng sự biểu hiện của gene được lựa chọn có thể được đo với độ chính xác rất cao bởi Real-time PCR [6, 7] Đây là phương pháp tốt nhất để xác định số lượng của một DNA

cụ thể trong một mẫu sinh học phức tạp, hay định lượng biểu hiện gen [21, 25] Phương pháp này đã khắc phục được hầu hết những thiếu sót và hạn chế lớn của những phương pháp trước đó Việc sử dụng tính đặc hiệu và độ nhạy của PCR kết hợp với sử dụng mồi huỳnh quang để phát hiện trực tiếp gene đích, qua đó loại bỏ được các vấn đề như: thuốc nhuộm, chuyển màng, lai phóng xạ và thời gian làm thí nghiệm…[3]

Trong kỹ thuật Real-time PCR cả DNA và mRNA đều có thể được sử dụng làm mẫu thí nghiệm cho Real-time PCR Nếu sử dụng mRNA làm mẫu phải được sao chép ngược thành cDNA bằng RT-PCR Bước phiên mã ngược (reverse transcript) là rất quan trọng quyết định độ nhạy và tính chính xác khi định lượng, vì

số lượng cDNA được tạo ra, phải phản ánh một cách chính xác số lượng đầu vào của mRNA Kết quả RT có thể khác nhau hơn 100 lần trong các gene đích, sự khác nhau này do cấu trúc mRNA khác nhau, cách dùng mồi (hexamers, oligo (dT) hoặc mồi đặc hiệu của gene), và các đặc tính của enzyme sao mã ngược (dải động, độ hoạt động của RNase và ổn định nhiệt) [6, 21, 31]

Phản ứng phiên mã ngược và realtime có thể thực hiện trong một phản ứng RT-PCR, cách này đặc biệt là phù hợp khi phân tích một hoặc một vài gene và nó cũng giảm nguy cơ đồng nhiễm Tuy nhiên, tối ưu điều kiện phản ứng cho phản ứng

20

sao mã ngược và Real-time PCR thường khác nhau, và khi kết hợp một bước cho phản ứng thường giảm độ nhạy hơn so với phương pháp cách làm hai bước [6, 7] Khi làm RT-PCR, có thể phát sinh tín hiệu dương tính giả từ DNA trong mẫu Để tránh vấn đề này mồi PCR để định lượng mRNA thường được thiết kế với chiều dài trên một intron hoặc qua các biên exon [35] Nếu như thiết kế thí nghiệm không phải xử lý mẫu thì phải được kiểm tra sự nhiễm mẫu, bằng cách chạy thử một vài mẫu nhưng không phiên mã ngược, nếu thấy phát tín hiệu là mẫu có thể bị nhiễm và phải xử lý bằng DNase trước khi phiên mã ngược [30] Thông thường quy trình thực hiện một phản ứng Real-time PCR gồm các bước: chuẩn bị mẫu, tách DNA hoặc RNA, tổng hợp cDNA, thiết kế mồi, cài đặt chương trình cho phản ứng và phân tích kết quả[6, 30]

Chìa khóa làm nên tính ưu việt của kỹ thuật Real-time PCR là việt sử dụng chất phát huỳnh quang có khả năng bắt vào sản phẩm PCR Ngày nay, chất phát huỳnh quang được sử dụng như là phương pháp phát hiện đặc hiệu trong Real-time PCR Các huỳnh quang có thể được chia thành hai loại: loại đặc hiệu và loại không đặc hiệu [36] Các chất không đặc hiệu như SYBR Green I và BeBo [5, 38], đây là các chất bắt cặp với đôi sợi DNA, do có ái lực cao với sợi đôi Động học của phản ứng PCR thường được xác định thông qua sự phát quang của các thuốc nhuộm

Hình 1.8: Sơ đồ tiến hành phản ứng Realtime-PCR

21

DNA Cơ sở của Realtime-PCR là mối liên hệ thuận giữa tín hiệu thu được từ thuốc nhuộm với số bản sao của DNA [33]

1.4.2 Phân tích kết quả Real-time PCR

1.4.2.1 Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR (amplification graph) [1]

Biểu đồ khuếch đại có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt (hình 1.9), biểu đồ này có thể phân thành các giai đoạn:

“Pha ủ”: Cường độ huỳnh quang trong những chu kỳ đầu sẽ rất thấp và hầu

như không thay đổi, hiển thị bằng một đường thẳng nằm ngang, vì trong giai đoạn này dù DNA đích đã có thể được nhân bản thành các bản sao nhưng do số lượng chưa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng huỳnh quang đủ cường độ để máy ghi nhận

“Pha log”: khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất

định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu ngóc lên Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do

số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Chúng ta gọi giai đoạn này là “giai đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn tăng trưởng lũy thừa về số lượng bản sao của DNA đích

“Pha bình nguyên”: Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng

trưởng đến một mức nào đó thì độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên

vì các bản sao của DNA đích, do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa

Đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) cho chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan trọng là chu kì ngưỡng và biểu đồ nóng chảy

22

1.4.2.2 Chu kỳ ngưỡng (Ct)

Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó được đường biển diễn khuếch đại cắt đường nền (basal cycle) Cường độ huỳnh quang nền được thiết bị Real-time PCR ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang trong một số chu

kỳ đầu và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền

Giá trị Ct sớm hay muộn phản ánh số lượng bản DNA đích ban đầu do đó thông qua đánh giá so sánh giá trị Ct chúng ta có thể so sánh một cách tương đối số lượng DNA gốc ở các ống thí nghiệm Tuy nhiên, vì SYBR Green I bắt cặp cho bất

cứ sợi đôi DNA nào xuất hiện trong ống phản ứng sau các chu kỳ nhiệt kể cả các sợi đôi DNA không phải DNA đích, do vậy sự xuất hiện đường biểu diễn khuếch đại trong ống phản ứng sẽ không đặc hiệu 100 % cho sự có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích

Do đó để phân biệt đường khuyết đại của AND đích với đường khuếch đại của dimer primer ta dựa vào đỉnh nóng chảy

Hình 1.9: Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sánh kích thích vào mỗi

chu kỳ nhiệt

23

1.4.2.3 Biểu đồ nóng chảy

Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm DNA đích ở chiều dài, nên có thể phân biệt được được đường biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay là từ dimer primer bằng tính chất đặc trưng đó chính là nhiệt độ chảy (melting To, Tm), Nhiệt độ chảy của sợi đôi DNA tùy thuộc vào thành phần GC và chiều dài của nó: Thành phần GC càng cao thì Tm càng cao, sợi đôi càng dài thì Tm càng cao Sản phẩm khuếch đại

từ DNA đích dài hơn nên sẽ có Tm cao hơn là Tm của sản phẩm khuếch đại từ dimer primer

1.4.2.4 Phương pháp so sánh định lượng tương đối 2 ΔCt

Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngưỡng chênh nhau 1 đơn vị tương đương với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lượng RNA của gene đích Tỷ lệ lượng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng được tính theo công thức:

- Chủng nấm men P pastoris SMD1168 [ pep4, his4] đã tích hợp pPIC9

- P.pastoris pPIC9 chủng đối chứng – control

- P pastoris pPIC9Amy (chủng Amy)

- P pastoris pPIC9IL-2 (chủng IL-2)

 Các gene biến nạp vào các chủng nghiên cứu gồm:

- Gene amy mã hóa cho α-amylase có nguồn gốc từS Fibuligera

- Gene IL-2 mã hóa cho interleukin-2có nguồn gốc từ người

2.1.2 Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR

2.1.4 Phần mềm

Phần mềm LightCycler 4.0

2.1.5 Các loại môi trường và dung dịch

a Môi trường nuôi cấy chọn lọc và biểu hiện gene ngoại lai trong tế bào nấm

b Dung dịch tách chiết mRNA từ nấm men

- Dung dịch BY1 gồm có 1M sorbitol, 0.5M EDTA có bổ sung thêm 0.1% mercaptoethanol và zymolase tới nồng độ cuối cùng là 300 µg/ml

- Dung dịch RLT theo bộ kit được sử dụng để phá thành tế bào và được bổ sung 1% mercaptoethanol trước khi sử dụng

- Dung dịch RW1 được sử dụng để làm sạch mẫu tách chiết