đánh giá hiệu lực của arterakin đối với plasmodium falciparum và kháng chloroquin bằng kỹ thuật pcr tại quảng trị, đăk nông năm 2008-2010

Sự đề kháng của một chủng KSTSR với một loại thuốc mà trớc đó vẫn có tác dụng đợc định nghĩa nh sau: " Khả năng một chủng KSTSR có thể sống sót và nhân lên mặc dù ngời bệnh đã đợc điều t

đặt vấn đề

Sự xuất hiện của artemisinin (ART) và dẫn xuất vào đầu thập kỉ 70 đãlàm thay đổi hẳn tình hình bệnh sốt rét (SR) trên toàn cầu nói chung và ở Việtnam nói riêng Sau vụ dịch năm 1991 làm hơn 1 triệu ngời mắc và 4646 ca tửvong với những nỗ lực vợt bậc, chơng trình phòng chống sốt rét (PCSR) củaViệt Nam đã đạt đợc những kết quả đáng kể Tính đến tháng 11 năm 2010 tỷ

lệ tử vong do sốt rét ở Việt Nam chỉ còn 0,07/ 100.000 dân so với 0,12/100.000 dân của năm 2001 [11], [14], [28]

Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây về kí sinh trùng sốt rét (KSTSR)kháng thuốc của Tổ chức Y tế thế giới cho thấy đã có sự giảm hiệu lực điều trịcủa artesunat (AS) tại biên giới Thái Lan - Campuchia, Thái Lan - Myanmar(Noedl, Socheat 2009 và Lim 2010) Đây là các nớc thuộc khu vực tiểu vùngsông Mekong (GMS) [5], [40], [73], [81]

Việt Nam là một trong 6 nớc thuộc GMS với trên 27,4 triệu dân sốngtrong vùng có lu hành SR, có đờng biên giới giáp Lào, Campuchia là khu vực

có hiện tợng P falciparum kháng chloroquin (CQ) và fansidar ở mức độ cao.

Tình trạng giảm hiệu lực của các thuốc trong nhóm ART cũng đã đợc các tácgiả trong nớc nghiên cứu và phát hiện (Huong et al 2001) [68] Báo cáo gần

đây của Tạ Thị Tĩnh, Nguyễn Mạnh Hùng năm 2010 về hiệu lực điều trị của

AS đờng uống tại Đak Nhau, Bù Đăng, Bình Phớc cho thấy tỷ lệ đáp ứng lâmsàng tốt chỉ còn 87,5% [38], [39]

Sự giảm hiệu lực của các thuốc nhóm ART sau hơn 20 năm sử dụng làmột quan tâm đặc biệt của WHO trong khi hiện nay cha có một loại thuốc SRmới nào có hiệu lực cao tơng tự thay thế [38], [116]

Chiến lợc “Đẩy lùi sốt rét’’ đợc WHO phát động từ 2001 trong đó nổibật là khuyến cáo về sử dụng thuốc mà một trong những nội dung trọng tâm là

sử dụng các thuốc phối hợp có ART hoặc dẫn chất với một thuốc khác gọi tắt

là ACT (artemisinin based combination therapy) Thực hiện khuyến cáo củaWHO, chơng trình PCSRQG đã thay thế các phác đồ đơn trị liệu trớc đâybằng các ACT trong đó có Arterakin, một thuốc phối hợp gồm 2 thành phầndihydroartemisinin và piperaquin [44], [53], [117]

Việc giám sát hiệu lực của các thuốc sốt rét đồng thời đánh giá tình

trạng kháng thuốc của P falciparum với các thuốc khác bằng các kĩ thuật

hiện đại nh Sinh học phân tử cũng là một mục tiêu quan trọng của WHO.

Những thông tin gần đây cho thấy có sự nhạy cảm trở lại của P falciparum

với CQ Piperaquin, một thành phần của Arterakin cũng là thuốc tơng tự CQ,liệu có sự khác biệt nào về hiệu lực của Arterakin trên bệnh nhân mắc SR do

P falciparum có kháng và không kháng CQ không ?

Chính vì vậy, nghiên cứu này nhằm đạt tới 2 mục tiêu sau:

1 Đánh giá hiệu lực điều trị của Arterakin trên bệnh nhân sốt rét do P falciparum cha biến chứng tại Quảng Trị và Đăk Nông

2 Đánh giá kháng chloroquin từ các chủng phân lập của P falciparum tại

điểm nghiên cứu bằng kĩ thuật PCR.

Chơng 1 Tổng quan

nh chuột và linh trởng Ngời không nhiễm KSTSR của chim, động vật bò sát

ở một số nớc thuộc khu vực Đông Nam châu á khi phát hiện thấy ở ngời P knowlesi đợc phát hiện năm 1931 ở khỉ, năm 2004 thấy ở ngời tại Malaysia,

Singapor, Thailand, Myanmar Năm 2007 phát hiện ở Việt Nam Hiện cha xác

định đợc kí sinh trùng (KST) này có lây truyền từ ngời sang ngời hay chỉ lây

từ khỉ sang ngời Về hình thể P knowlesi dễ nhầm với P malariae, sự phân

biệt hai loại KST này chỉ xác định đợc bằng kĩ thuật sinh học phân tử [11],[47]

Đặc điểm chung của các KSTSR là kí sinh bắt buộc trong hồng cầu(HC) ngời và động vật có xơng sống Tuy vậy vật chủ chính là muỗi

Anopheles do chu kì sinh sản hữu tính của KST xảy ra ở muỗi Sự tồn tại trong

cơ thể ngời tùy thuộc vào từng loại KST Nếu không đợc điều trị và không

chuyển thành sốt rét ác tính (SRAT) thì P falciparum tồn tại từ 1-2 năm, P ovale và P vivax từ 1-5 năm, P malariae từ 3-50 năm [12], [64]

Ct: Miệng; Im: Màng trong; M: Ty lạp thể; Mn: Sợi trục; Mt: Các vi ti ống dẫn dới màng; N: Nhân; Pr: Chóp tận cùng; Rh: Túi electron; Sb: Thể hình cầu (Hốc thực bào)

Hình 1.1 Sơ đồ mô phỏng cấu trúc KSTSR của Aikawa và Seed 1980

KSTSR có kích thớc khoảng 15nm x 10nm Màng ngoài đợc bao phủbởi một lớp áo bề mặt dày 20nm, đậm đặc điện tử và các sợi fibrin Lớp áonày có thể bị tác động bởi Trypsin Lớp áo ngoài này đóng một vai trò nhất

định trong việc bảo vệ KST trớc đáp ứng của hệ thống miễn dịch của vật chủ[11], [64], [96]

Các nghiên cứu của Aikawa cho thấy chóp tận cùng và túi electron cóvai trò quan trọng trong việc giúp KST thâm nhập qua màng tế bào HC Sựthay đổi độ dày đặc của electron ở chóp tận cùng làm thay đổi điện thế màng

HC, giúp KST chui qua màng dễ dàng Thể hình cầu là các không bào tiêuhóa Cấu trúc dạng sợi chạy dọc tế bào giúp cho hình thể KST đợc vững chắc

Ty lạp thể của KST cũng là một cấu trúc quan trọng trong chuyển hóa chúng

có số lợng vách ngăn nhiều hơn so với ty lạp thể của các động vật có xơng

sống khác Có thể đây là yếu tố giúp KST sử dụng Glucose tốt hơn ngay cảtrong môi trờng yếm khí, làm giảm đờng máu trong các trờng hợp SRAT[42], [64], [96].

Chu kì sinh học của KST:

Thoa trùng sau khi đợc truyền từ muỗi sang ngời sẽ tồn tại trong máukhoảng 30 phút rồi nhanh chóng xâm nhập vào tế bào gan Đây là giai đoạnngoại hồng cầu, hay còn gọi là thời kì ủ bệnh không có triệu chứng, thời kìnày khác nhau ở từng loại KST Tại gan KST nhân lên vô tính tạo thànhMerozoite, số lợng các Merozoite đợc tạo thành trong cùng một khoảng thời

gian ở tế bào gan cũng khác nhau tùy theo từng loại KST trong đó P falciparum có số lợng nhân lên nhiều nhất Sau khi nhân lên ở tế bào gan các

Merozoite phá vỡ tế bào gan xâm nhập vào HC Tại đây KST phát triển thànhcác thể t dỡng non (Trophozoite) và trởng thành rồi thành thể phân liệt(Schizonts) non và già phá vỡ HC nhiễm và xâm nhập vào HC khác gây cơnsốt rét điển hình [12] [64]

Chu kì sinh học của KSTSR

Hình 1.2 Chu kì sinh học của KSTSR (CDC 2004)

Số lợng các thể phân liệt trong máu cũng khác nhau với từng loại KST,

P falciparum là loài có số lợng nhiều nhất, trung bình khoảng

20.000-500.000/ mm3, gấp 3 lần P vivax và 10 lần P malariae [12], [64] Sau khoảng

8-10 ngay, kể từ cơn sốt đầu tiên, một số mảnh phân liệt biệt hóa thành giaobào đực và giao bào cái (Gametocyte) Giao bào đực và giao bào cái đợc muỗi

Anopheles hút vào dạ dày, ở đấy giao bào cái phát triển thành giao tử cái, giao

bào đực phát triển kéo dài thành 4 -8 thể roi Mỗi roi là một giao tử đực tr ởng

thành Giao tử đực và giao tử cái hòa hợp với nhau tạo thành trứng (Ookinete).

Trứng di chuyển xuyên qua thành dạ dày muỗi và phát triển dới lớp thanh mạcmặt ngoài của dạ dày (Oocyste) Trứng lớn dần lên, nhân và nguyên sinh chấtphân chia phát triển thành nhiều thoa trùng hình thoi (Sporozoite) Trứng vỡ,thoa trùng đến tập trung ở tuyến nớc bọt muỗi Khi muỗi đốt ngời, thoa trùng

Chu kỳ hồng cầu Chu kỳ ở muỗi

Chu kỳ ở gan Giai đoạn gan

Giai đoạn mỏu

theo đó vào cơ thể tiếp tục thực hiện giai đoạn sinh sản vô tính ở ngời [11],[12], [64].

năm [11], [25], [64], [105]

Biểu hiệu lâm sàng chỉ thực sự xuất hiện ở giai đoạn nội HC, khi KSTnhân lên và phá vỡ HC hàng loạt sau 8-10 ngày kể từ lúc bị muỗi đốt Triệuchứng chung của bệnh SR cha biến chứng là các cơn sốt cao, rét run có tínhchu kì hoặc 24 giờ một cơn, hoặc 48 giờ (sốt cách nhật) tuỳ theo từng loạiKST Cơn SR điển hình có 3 giai đoạn sốt rét run, sốt nóng, vã mồ hôi, thiếumáu, lách to Khi bị SRAT, ngoài các triệu chứng trên còn có các triệu chứngnặng nh suy sụp đa phủ tạng, hôn mê, suy gan thận cấp do KSTSR làm tổn th-

ơng thực thể các phủ tạng dẫn đến tử vong [2], [104],

Có sự liên quan rõ ràng giữa dáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ vớitình trạng nhiễm KSTSR và mức độ nặng, nhẹ của bệnh Ngời có miễn dịchthờng có biểu hiện lâm sàng không điển hình, cơn sốt không mang tính chất

đặc thù của SR Hiệu quả điều trị ở ngời có miễn dịch cũng cao hơn ở ngờikhông có miễn dịch Muỗi đốt ngời đã có miễn dịch thì giao bào cũng bị ứcchế trong quá trình sinh sản hữu tính ở dạ dày muỗi Trẻ sinh ra từ những bà

mẹ bị SR tái đi tái lại cũng có miễn dịch thụ động do IgG từ mẹ truyền chotrong quá trình mang thai, tuy nhiên miễn dịch này chỉ tồn tại 3-6 tháng [12],

[77] Mặc dầu vậy miễn dịch trong SR (cả miễn dịch dịch thể lẫn tế bào)

không bảo vệ đợc cơ thể tránh mắc bệnh SR mà chỉ ức chế quá trình phát triểncủa KST Kháng thể đặc hiệu sẽ giảm dần sau khi tác nhân gây bệnh bị loại

khỏi cơ thể [77], [98].

1.1.2 Các khái niệm liên quan tới kháng thuốc.

Trong vòng vài thập kỷ gần đây, vấn đề KSTSR kháng thuốc đã trởthành một trong những cản trở chính đối với cuộc chiến chống lại bệnh SR

trên toàn thế giới Tình trạng kháng thuốc đã đợc chính thức công nhận đối với

3 trong số 5 loại KSTSR gây bệnh cho ngời Đó là P falciparum, P Vivax và

P malariae, trong đó đáng kể nhất là P falciparum kháng nhiều thuốc SR và

hiện đang là loài giảm nhạy cảm với ART và dẫn chất, một nhóm thuốc quan

trọng trong điều trị SR [21], [50], [100]

Sự đề kháng của một chủng KSTSR với một loại thuốc mà trớc đó vẫn

có tác dụng đợc định nghĩa nh sau:

" Khả năng một chủng KSTSR có thể sống sót và nhân lên mặc dù ngời bệnh

đã đợc điều trị và hấp thụ một liều lợng thuốc bằng hoặc cao hơn liều quy

định trong giới hạn chịu đựng của cơ thể " (WHO 1976)

Mức độ nhạy cảm của một thuốc đợc xác định theo nghiệm pháp in

vitro 28 ngày trớc đây “ Là mật độ KST giảm 75% sau 48 giờ điều trị so với ngày đầu, sau đó sạch hẳn vào ngày thứ 6 và 7 không xuất hiện lại KST trong vòng 28 ngày sau điều trị “ Năm 1986, Bruce-Chwatt và cs đã bổ sung thêm

Hiện tợng thất bại điều trị không đồng nghĩa với KSTSR kháng thuốc.Thất bại điều trị còn do các nguyên nhân khác nh thuốc giả, thuốc quá hạn,uống không đủ liều, sự dung nạp thuốc, đáp ứng miễn dịch v.v

Kháng chéo là tình trạng KST kháng lại các thuốc có cấu trúc hoá họchoặc cách tác động tơng tự nh nhau (các thuốc cùng nhóm)

Đa kháng là một chủng KST có khả năng kháng lại từ 2 thuốc khácnhau về cấu trúc hoá học và cơ chế tác động trở lên (các thuốc khác nhóm nh

CQ và ART hoặc CQ và MEF)

Kháng một phần (kháng tơng đối) là tình trạng thuốc vẫn có tác dụngnhng phải tăng nồng độ thuốc trong máu cao hơn liều thông thờng, trong giớihạn chịu đựng của cơ thể

Kháng hoàn toàn (kháng tuyệt đối) là khi nồng độ thuốc vợt quá ngỡngchịu đựng của cơ thể mà vẫn không có tác dụng [5], [26], [106]

1.1.3 Kí sinh trùng sốt rét kháng thuốc và các yếu tố ảnh hởng tới kháng thuốc

Cho đến nay, đã có nhiều giả thuyết về cơ chế KSTSR kháng thuốcsong cha có một giả thuyết nào đợc khẳng định hoàn toàn

+ Tăng khả năng thích nghi sinh lý, sinh hóa của KSTSR: Kiểu khángthuốc này không bền vững, khi dừng thuốc thì khả năng kháng thuốc củaKSTSR cũng mất dần

+ Cơ chế kháng di truyền: Là sự xuất hiện đột biến điểm trên một gennào đó của KSTSR Đột biến này quy định một loạt các đặc tính giúp KSTkháng lại một thuốc mà trớc đó vẫn có tác dụng diệt KST Các đặc tính này đ-

ợc di truyền cho thế hệ sau Kiểu kháng thuốc này xuất hiện hoàn toàn ngẫunhiên và bền vững không phụ thuộc vào sự có mặt hoặc tác động của thuốc Sự

đột biến diễn tiến qua 2 bớc Bớc 1 là sự xuất hiện đột biến một cách ngẫunhiên, bớc 2 đột biến này đợc nhân bản lên nhiều lần Kết quả là làm thay đổi

số lợng phiên bản copy của gen có vai trò xác định vị trí gắn của thuốc hoặcgen quy định hoạt động của quá trinh bơm thuốc, làm giảm nồng độ thuốctrong KST [43], [54]

+ Dựa vào cơ chế tác dụng của thuốc sốt rét: Cơ chế kháng một số loạithuốc SR đã đợc làm rõ nh cơ chế kháng CQ, các sulfamides do biết đợc cơchế tác động của các thuốc này [75]

để hình thành phức hợp “FP + protein gắn hem” tức hemozoin là một sắc tố

SR không độc CQ cạnh tranh với protein gắn hem để hình thành phức hợp(FP + CQ) phá huỷ màng lysosom và diệt KST [46], [49] Phân tích bằng kínhhiển vi điện tử cho thấy lysosome của KST là nơi bị tác động đầu tiên CQ cómặt Theo Fitch, KST tiêu hoá hemoglobin và tạo chất ferriprotoporphyrin(FPIX, còn gọi là hematin), thông thờng chất FP gắn vào một protein của KST

để hình thành phức hợp “FP + protein gắn hem” tức hemozoin là một sắc tố

SR không độc CQ cạnh tranh với protein gắn hem để hình thành phức hợp(FP + CQ) phá huỷ màng lysosom và diệt KST [5], [87] Phân tích bằng kínhhiển vi điện tử cho thấy lysosome của KST là nơi bị tác động đầu tiên CQ cómặt trong bào tơng của KST có tính kiềm yếu pH 7.4 đợc hòa tan và thấm quamàng vào môi trờng lysosome có tính axit, mất điện tích tạo thành QH+.CQH+ gắn vào ferriprotoporphyrin IX [78], [80]

Cơ chế kháng CQ của KST: Dựa vào cơ chế tác động của CQ là pháhuỷ màng Lysosom của KST Hiện nay giả thuyết về kháng CQ của KST đợcnhiều ngời chấp nhận là Do đột biến gen kiểu kháng này bền vững

P falciparum kháng CQ có liên quan chặt chẽ với các đột biến điểm trên gen vận chuyển CQ (Pfcrt) nh M74I, N75E, K76T, A220S, Q271E, N326S [46], trong đó đột biến tại điểm 76 trên gen Pfcrt (từ lysine thành

threonin) là liên quan chặt chẽ đến sự kháng thuốc [94] Các nhà khoa học

cũng đã xác định một số điểm đột biến trên gen đa kháng (Pfmdr1), nh N86Y,

F184Y, S1034C, D1042N, D1246Y Theo David A (2000) [60], các đột biếnnày chỉ đóng vai trò điều chỉnh mức độ kháng CQ và tham gia vào cơ chếkháng một số thuốc khác nh quinine, mefloquine, artemisinin [45], [46], [89]

Đột biến này dẫn tới sự thay đổi sau:

Đối với KST kháng chloroquin, Sự đột biến ở gen Pfcrt sẽ làm tăng hấp

thụ CQH+ từ đó một lợng lớn CQ bị đẩy ra ngoài (và phản ứng trùng hợpHemozoin của KST không bị ảnh hởng)

Đột biến của Pfcrt còn làm giảm khả năng hấp thu AAH+ từ đó làmtăng sự tích tụ H+ trong lysosom Sự đột biến này làm rối loạn quá trình cungcấp năng lợng cho hoạt động của bơm proton H+ [46]

Sự đột biến này cũng làm rối loạn quá trình cung cấp năng lợng chohoạt động của bơm P.glycoprotein trên màng KST từ đó tăng đào thải CQ rangoài nhiều gấp 4 lần [82], [84]

Ngoài ra chloroquin còn tác động tới phospholipase của KST, làm tăngthấm qua màng từ đó CQ dễ thoát ra ngoài [59] [68]

Nhạy với CQ Kháng với CQ

Hình 1.3 Sự chuyển hoá của chloroquin trong tế bào KST

Kháng các thuốc nhóm antifolates.

KST phân bào cần có ADN Tiền chất của ADN là purin và pyrimidin

đợc tổng hợp nhờ dihydrofolat reductase acid (DHFR) và dihydropteroatesyntetase acid (DHPS) PABA (para amino benzoic acid) tham gia vào quátrình tổng hợp DHFR Các thuốc sulfon, sulfamid, proguanil, primethamin cócấu trúc gần gũi với PABA nên cạnh tranh với PABA và hậu quả là làmKSTSR không tổng hợp đợc DHFR và DHPS, từ đó cản trở quá trình tổng hợpADN, làm rối loạn quá trình nhân lên của KST [48], [72] [74], [87]

Những nghiên cứu về di truyền ở Trung Mỹ và Thái Lan cho thấy sự đột

biến trên gen Pdhfr tại bộ mã Ser108Asn Đột biến ở vị trí này quyết định tính

kháng pyrimethamin (làm thay đổi cấu trúc protein DHFR do thay thếIsoleucine bằng Asparangin) [75], [88]

Cũng tơng tự nh vậy, những nghiên cứu ở Thái Lan với cycloguanil cho

thấy các chủng P falciparum nào mang đột biến ở Pfdhfr thờng có số lợng bản copy của gen Gch1 tăng cao Gch1 mã hoá GTP- cyclohydrolase 1, một

Enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp folate và biopterine Kết quả là làmEnzyme này mất hoạt tính[48] [55] [63].

Với sulfadoxin, cơ chế kháng của P falciparum đợc xác định là liên quan tới 5 điểm đột biến trên gen Pfdhps bao gồm các điểm Ser436Ala/Phe,

Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly, Ala613Thr/Ser Đột biến ở điểm 437 và

540 đợc xác định là quyết định tính kháng lại các sulfamides của KST [102]

Các nghiên cứu của Price và cs năm 2002 và 2006 cho thấy mối liên

quan mật thiết của gen Pfmdr1 với sự kháng lại mefloquin, halofantrin khi số lợng bản copy đột biến điểm tại Asn86Tyr trên gen Pfmdr1 tăng lên thì độ

nhạy của các thuốc này giảm đi [89], [100]

Tại khu vực tiểu vùng sông Mekong, các nghiên cứu in vitro trên thực

địa cũng cho thấy các phác đồ kết hợp của AS + MEF và AM+LUM có tác

dụng chọn lọc những chủng P falciparum hoang dại nào có chứa Alen Asn86,

(Dokomajillar et al, Happi et al 2009) [101]

Kháng atovaquone và các thuốc tơng tự.

Các nghiên cứu có ứng dụng sinh học phân tử của Musset năm 2006 đã xác

định đợc sự kháng lại Atovaquone có liên quan đến một đột biến đơn độc trên gen

cytochrom b (cytB) gồm các điểm Tyr268Asn, Tyr268Ser hoặc Tyr268Cys Các

đột biến trên cytB làm tăng IC50 của Atovaquone lên 1000 lần [79]

Kháng Quinine.

Cơ chế kháng Quinine của P falciparum khá phức tạp Các nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử cho thấy ở chromosom 13 của P falciparum có một

gen liên quan tới quá trình trao đổi các cation H+/Na+ gọi là gen Pfnhe-1 Đột

biến tại điểm ms4760 của gen này liên quan tới ảnh hởng của quinine vớiKST [83] Cũng trong thời điểm này, nghiên cứu đơn dòng từ các chủng phânlập ở thực địa của Reed và cs năm 2000 lại cho thấy mối liên hệ giữa đột biến

tại 4 điểm Asn86Tyr, Ser1034Syc, Asn1042Asp và Asp1246Tyr của nhiều

gen (Pfmdr1, Pfcrt, Pfnhe-1) với sự giảm nhạy cảm của quinin [67], [91].

Kháng artemisinin và dẫn chất.

Mặc dù cha khẳng định sự kháng với ART nhng s giảm nhậy cảm vớiART và dẫn chất đã đợc nói đến trong một số nghiên cứu gần đây Arjen M.Dondorp trong một nghiên cứu ngẫu nhiên mở năm 2007 tại biên giới Thailan

và Campuchia trên 40 bệnh nhân SR thờng bằng phơng pháp đánh giá hiệu lựcthuốc trên invivo và invitro sau đó phân biệt tái phát, tái nhiễm bằng PCR chothấy có sự khác biệt về thời gian sạch KST khi dùng liều artesunat (AS) khácnhau ở mỗi nhóm [41], [58]

Artemisinin (ART) tác động lên các KSTSR bằng cách khử cầu nốiendo-peroxyd rồi giải phóng ra O2 tự do Các gốc tự do này sẽ ức chế tổng hợpprotein, gây vón kết nhân, màng nhân, ty lạp thể, lysosom của KST Poonsakdi

và cs đã chỉ ra rằng men cystein proteaza trong các hốc thực bào của KST mấthoạt tính do tác động của ART Đồng thời cũng cho thấy, ART ức chế chuyểnhóa từ hemoglobin thành hemozoin trong KST [85]

Theo Nicholas P.J và một số tác giả khác đánh giá độ nhậy của AS trêninvitro bằng phơng pháp đồng vị, kết quả cho thấy là đột biến ở gen kí hiệu là

Pfmdr1 có khả năng gây đa kháng [56] Hoặc đột biến ở gen PfSERCA, gen qui định sự vận hành của men calcium ATPase6 thuộc hệ lới nội mô [101].

Đột biến tại Ser769Asn của gen này đợc cho là nguyên nhân KST khángartemether (đang đợc kiểm chứng) [82]

Một nghiên cứu khác cũng ở biên giới Campuchia và Thái Lan củaImwong (2010) lại cho thấy các gen nằm trên ribosom có trọng lợng 6-kb và

gen Pfubp-1 có liên quan tới kháng ART và kháng chéo với các

Mặc dù vậy, cho tới nay CQ vẫn đợc sử dụng trong điều trị SR do P vivax ở tuyến đầu của nhiều quốc gia trừ Indonesia, quần đảo Salomon và

Vanuatu [110]

Các nghiên cứu về dợc động học đã cho thấy liều có hiệu lực điều trị

của CQ với P vivax đã tăng lên 70-90ng/ml máu toàn phần Nghiên cứu

của Borneo và Baerd năm 2009 ở Thái Lan đợc coi là có ý nghĩa về sựkháng CQ của KST khi nồng độ CQ trong plasma lên > 100ng/ml mà vẫnthất bại [51], [71]

Cơ chế kháng CQ của P vivax là đột biến ở Tyr976Phe của gen Pvmdr-1 [95].

Hình 1.4 Tình hình P vivax kháng CQ và thất bại điều trị

Kháng mefloquine.

Mefloquine vẫn là thuốc có hiệu quả cao với P vivax, sau một thời gian

sử dụng rộng rãi, gần đây một số nghiên cứu in vitro tại khu vực tiểu vùng

sông Mekong cho thấy tỷ lệ KST mang gen Pvmdr-1 tăng lên nhanh chóng,

đột biến tại Tyr976Phe của gen này đợc cho là liên quan tới mức độ nhậy

cảm của MEF và AS trong những nghiên cứu trớc đây [71],[112]

Kháng sulfadoxin - pyrimethamin

Những nghiên cứu tế bào học về P vivax kháng

Sulfadoxin-pyrimethamin cho thấy đột biến ở các điểm 57, 58, 61, 117 trên gen Pvdhfr

liên quan tới tỷ lệ thất bại điều trị của thuốc [74] [93]

Kháng primaquine

Mặc dù đã có những báo cáo về sự giảm nhậy cảm của primaquine với

P vivax (Baird 2009) Cho đến nay thuốc này vẫn có hiệu quả cao với thể ngủ của P.vivax, P Ovale Các nghiên cứu này cũng cho thấy độ nhậy của thuốc

khác nhau theo từng khu vực địa lý [50] [82]

1.1.3.3 P malariae và P ovale kháng thuốc.

Chỉ có một nghiên cứu đơn lẻ duy nhất của Maguire và cs năm 2002

báo cáo về tình trạng P malariae và P ovale kháng lại CQ tại Indonesia Tuy nhiên cơ chế kháng cha đợc làm rõ, cho tới nay CQ vẫn tác dụng tốt với P malariae, P ovale và cả P knowlesi ở Malaysia [80].

1.1.3.4 Các yếu tố ảnh hởng đến quá trình kháng thuốc

Một số yếu tố thờng đợc nhắc tới liên quan đến quá trình phát sinh, phát triểnkháng thuốc là:

- Uống thuốc không đủ liều, không đúng quy trình

- Thuốc không đảm bảo chất lợng, hết hạn sử dụng, thuốc giả

- Việc sử dụng nhiều loại thuốc có tác dụng đối kháng

- Đáp ứng tự nhiên của cơ thể (hấp thu, chuyển hoá, thải trừ)

Sự phát triển của khoa học Di truyền học, Hoá-dợc, Sinh học phân tử đã bổxung các yếu tố ảnh hởng tới sự lan truyền kháng thuốc nh sau [112]

- Tỷ lệ những biến đổi mang tính di truyền xảy ra trong nội bộ cộng

đồng dân c một khu vực địa lí

- Số lợng KST bị phơi nhiễm bởi thuốc

- Nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm KST bị phơi nhiễm

- Diễn biến dợc lực và dợc động học của thuốc sốt rét

- Đặc điểm cá nhân (Liều, thời gian sử dụng, sự dung nạp), tính cộng

đồng (chất lợng thuốc, dễ tìm, sự phân phối) của mô hình sử dụng thuốc

- Tính miễn dịch của cộng đồng và từng cá nhân trong cộng đồng

- Cờng độ của sự lan truyền kháng thuốc

Nh vậy để loại trừ các yếu tố ảnh hởng tới kết quả các nghiên cứu về hiệu lực

điều trị của các thuốc SR với mục tiêu nhằm phát hiện sớm tình trạng khángthuốc thì việc khẳng định tính kháng thuốc bằng các kĩ thuật hiện đại nh PCR

là một trong những yếu tố quyết định Thêm vào đó, để phát hiện sự giảmnhậy cảm của một thuốc cũng cần đa vào thiết kế các nghiên cứu về dợc độnghọc của thuốc dang sử dụng

Trong suốt một thời gian dài từ những năm 60 của thế kỉ trớc P falciparum luôn là tác nhân chính kháng lại nhiều loại thuốc SR Hiện nay

KST này cũng đang là nguy cơ kháng lại ART và dẫn chất, một nhóm thuốc

đợc u tiên sử dụng (first line) trong công tác điều trị sốt rét hiện nay Mộtnguy cơ khác đang xuất hiện làm tình hình bệnh SR thêm phức tạp là sự kháng

lại CQ của P.vivax Nghiên cứu Borneo và cs năm 1999 tại Thái Lan và Indonesia đã đa ra những bằng chứng có giá trị về việc P vivax kháng lại CQ

[51] Chính vì vậy việc giám sát thờng xuyên hiệu lực điều trị của thuốc để đa

ra các chiến lợc sử dụng thuốc phù hợp là vấn đề quan trọng cho mọi Quốc gia[52]

1.2-Tình hình Sốt rét kháng thuốc khu vực tiểu vùng sông Mekong và chiến lợc phòng chống

1.2.1 Tình hình Sốt rét kháng thuốc tại khu vực tiểu vùng sông Mekong (GMS)

Khu vực tiểu vùng sông Mêkông bao gồm các quốc gia và vùng lãnhthổ sau: Vân Nam (Trung Quốc), Myanmar, Thái Lan, Lào, Camphuchia vàViệt Nam Với nhiều điểm giống nhau về môi trờng, khí hậu, tình trạng vector

và tình hình SR cùng với các đặc điểm kinh tế xã hội.[117]

Theo số liệu của Tổ chức y tế thế giới, tại Đông nam á có tới 88% dân

số sống trong vùng có SR lu hành Bệnh thực sự trầm trọng không chi donhững yếu tố tự nhiên nh khí hậu nhiệt đới ma nhiều, diện tích đợc bao phủbởi rừng lớn, ngèo nàn, dân trí thấp mà còn do sự xuất hiện và lan rộng cácchủng KST kháng lại nhiều loại thuốc SR [12], Ngoài việc kháng lại cácthuốc SR kinh điển theo phác đồ đơn độc trớc đây, KSTSR còn kháng lạinhiều phác đồ kết hợp thuốc, ngay cả một số kết hợp kiểu ACTs cũng đã códấu hiệu giảm nhậy cảm [17], [103]

1.2.1.1 Kháng các phác đồ đơn trị liệu

Kháng chloroquine.

Tại khu vực Đông-Nam á P falciparum kháng CQ có tỷ lệ cao, nhất

là ở các nớc thuộc GMS Tình trạng kháng CQ đã đợc thông báo trong cácnghiên cứu năm 2002 ở Thái Lan (>90%), Campuchia (97%), Lào (78%) Đặc

biệt là khu vực biên giới Thái Lan đã xuất hiện tình trang P vivax kháng CQ

với bằng chứng mang tính khẳng định của sinh học phân tử (xem 1.1.3.2)

Đáng chú ý là sau một thời gian dài không sử dụng, CQ dờng nh có sự nhạy

cảm trở lại với P falciparum Những nghiên cứu về di truyền (Wilson 2005) cho thấy sự giảm đáng kế của số lợng đột biến tại điểm 76 trên gen Pfcrt [57], [107]

ở Việt Nam, phát hiện P falciparum kháng CQ đầu tiên đợc ghi nhậntại Nha Trang năm 1961 [28] rồi nhanh chóng lan rộng lên khu vực TâyNguyên và biên giới Tây-Nam có thời điểm (1982) tỷ lệ kháng lên tới 100%.Các nghiên cứu in vitro tại 23 điểm trên cả nớc thấy tỷ lệ kháng CQ là 74,3%năm 1990 đã tăng lên 86,5% chủ yếu tập chung ở khu vực Tây Nguyên, NinhThuận (Triệu Nguyên Trung và cs 2000) ở miền Bắc chủ yếu thấy ở khu vựcVĩnh Linh, Quảng Bình (68,5%) Từ 1996 trở lại đây CQ có xu hớng nhậycảm trở lại ở một số tỉnh nh ở Đức Cơ tỉnh Gia Lai giảm xuống còn 7,7% năm

1999, ở Ninh Thuận giảm xuống còn 23% năm 2000 [1], [5], [15], [37]

Mặc dù CQ có xu hớng nhạy cảm trở lại với P falciparum, song WHO

vẫn cho là còn quá sớm để quay trở lại sử dụng CQ ở tuyến đầu, [107], [110]

Kháng sulfadoxine – pyrimethamine.

Tỷ lệ kháng cao và mức độ khác nhau ở từng nớc thuộc GMS nh tạiMyanmar, Lào tỷ lệ kháng SP là 23% năm 2003, Campuchia là 100% ở ViệtNam tỷ lệ kháng thuốc này đang giảm từ 73,6% năm 1990 xuống còn 24,4%năm 2000 [24], [109], [111],

Kháng quinin.

Mặc dù P falciparum kháng quinin đợc phát hiện từ năm 1910 ở

Brazil Hiện nay quinin vẫn có hiệu lực điều trị cao dới dạng kết hợp vớidoxycyclin hoặc clindamycin và cả với AS Khoảng từ 2002-2007 có nhiều

báo cáo về tỷ lệ tái phát cao ở Thái Lan (30%) với phác đồ 7 ngày ở liều25mg/kg/ngày Tại Campuchia hiệu quả điều trị là 100% Tại Việt Nam, năm

2000 ở Phú Riềng tỉnh Bình Phớc tỷ lệ P falciparum kháng quinin là 27,7%

[11], [61], [117]

Kháng mefloquin

Mefloquin (MEF) bị P falcipảum kháng lại lần đầu tiên đợc phát hiện

năm 1982 tại biên giới Thái Lan-Campuchia ở liều điều trị 15mg/kg sau mộtthời gian ngắn đa vào sử dụng Là thuốc vẫn có hiệu lực điều trị trên thế giới

nhng tại các nớc thuộc khu vực GMS, MEF lại bị P falciparum kháng với tỷ

lệ cao Với phác đồ đơn trị liệu Theo số liệu của WHO năm 2004 tỷ lệkháng với MEF tại Myanmar và Việt Nam là 40% ở liều 15mg/kg (Huong et

al 2001) [68] Sau khi sử dụng phác đồ kết hợp MEF + AS hiệu quả điều trị cótăng lên nhng chỉ đợc một thời gian ngắn Có ý kiến cho rằng liều điều trị thấpliên quan tới nồng độ thuốc trong huyết tơng làm tăng khả năng kháng MEFcủa KST Nghiên cứu của Dondorp và Imwong từ 2005-2007 cho thấy khi

tăng liều điều trị lên 25mg/kg thì số lợng phiên bản copy cua gene Pfmdr-1

giảm đi và tỷ lệ thất bại điều trị của thuốc này cũng giảm theo (< 5%) [71],[89]

Kháng artemisinin và dẫn chất:

Khu vực biên giới Thái Lan-Campuchia là nơi đầu tien ghi nhận bằng

chứng của P falciparum kháng lại ART và dẫn chất [40] Đã có hơn 20 TES

đợc tiến hành với các thuốc artemether, AS, DHA ở 5 nớc trong đó có ViệtNam Kết quả là với liều điều trị qui định, tỷ lệ thất bại khi dùng phác đồ 3ngày là 48%, 5 ngày là 17% và 7 ngày là 3-10% [92], [113] Tạ Thị Tĩnh và

cs thực hiện TES tại Đak ơ và Đak Nhau thuộc tỉnh Bình Phớc cho thấy EC50của DHA từ 1,7mol/l năm 2008 đã tăng lên 2,6mol/l năm 2010 [38]

Năm 2005 Noedl đã đa tiêu chuẩn xác định rõ tình trạng khángartemisinin và dẫn chất Một trong số đó là sự tồn tại của KST trong máu ngờibệnh ở ngày D3 [81]

- KST vẫn tồn tại sau 7 ngày điều trị hoặc xuất hiện lại trong vòng 28ngày sau một đợt dùng ART đờng uống với liều quy định

- Tình trạng trên xảy ra trong khi nồng độ DHA huyết tong vẫn duytrì ở mức bình thờng

- Giảm nhạy cảm trên in vitro với DHA

Năm 2009 Dondorp bổ sung về thời gian sạch KST nh sau [58]

Nghi ngờ kháng ART khi:

- Thời gian sạch KST kéo dài, với sự tồn tại KST ở ngày D3 Nh vậyngày D3 đợc xem nh một mốc quan trọng về thời gian trong nghiêncứu giám sát hiệu lực thuốc SR.

Hình 1.5 Tỷ lệ P falciparum (+) ngày D3 sau điều trị AS liều

2-4mg/kg/ngày tại các nớc thuộc GMS WHO 2010

1.2.1.2 Giảm nhậy cảm với các ACT s

Trớc những thông tin đáng lo ngại về sự giảm nhạy cảm của KSTSRvới ART và dẫn chất Năm 2001, WHO khuyến cáo các nớc có SR lu hành sửdụng các phác đồ kết hợp thuốc thay vì sử dụng các phác đồ một thuốc đơn

độc nh trớc đây trong khi điều trị những trờng hợp SR do P falciparum cha

biến chứng, trong đó thành phần chính là ART hoặc một dẫn chất của ARTgọi tắt là ACT (Artemisinin based Combination Therapy) Dới đây là một sốACT thông dụng [53], [57]

artemisinin-doxycycline, artemisinin-proguanin

artesunat- mefloquin artesunate-amodiaquine

artesunate-chloroquine artemether - lumefantrin (Coartem)artesunate-sulfadoxine/pyrimethamine

dihydroartemisinin-piperaquin (Arterakin)

dihydroartemisinin- piperaquin - primaquin - trimethoprim (CV8)

Các phối hợp thuốc này đều nhằm khắc phục tình trạng P falciparum kháng thuốc Sau một thời gian sử dụng, một số phối hợp kiểu ACT đã xuất hiện

giảm nhạy cảm (artemether-lumefantrin, artesunat-amodiaquin) và các phác

đồ kết hợp với sulfadoxine/pyrimethamine [75], [90], [108]

Artesunat-amodiaquin:

Những TES đợc thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới cho thấy tỷ lệ thấtbại điều trị của artesunat-amodiaquin theo dõi 28 ngày là ≥ 10% gặp ởBurkina Faso, Gabon, Khu vực GMS có Việt Nam và Myanmar [76]

Artesunat-mefloquin:

Kết hợp AS-MEF tỏ ra có hiệu lực cao ở hầu hết các nớc đang sử dụngtrừ Campuchia và Thái Lan có tỷ lệ thất bại điều trị cao ≥ 10% theo dõi 28ngày, thậm chí ≥ 20% theo dõi 42 ngày

Tại Palin (biên giới Campuchia-Thái Lan) sau một thời gian thay thếbằng dihydroartemisinin-piperaquin, tỷ lệ thất bại điều trị của AS-MEF giảm

từ 9,9 - 14,3% năm 2002 - 2004 xuống còn 0-5% năm 2007-2008 Kèm theo

đó là sự nhạy cảm trở lại của MEF Đièu này cho thấy hiệu lực của một ACTkhông chỉ phụ thuộc sự nhạy-kháng của KST đối với ART và dẫn chất mà cònphụ thuộc vào sự nhạy-kháng của KST với các thuốc thành phần phối hợp Do

thời gian bán huỷ dài của MEF, WHO đã khuyến cáo nên theo dõi hiệu lựcphác đồ này ít nhất là 42 ngày [89], [114].

Bảng 1.1 Tỷ lệ thất bại của AS + MEF tại khu vực GMS (WHO 2010 )

Artemether – lumefantrin. lumefantrin.

Với artemether - lumefantrin, trong khi các nghiên cứu ở châu Phi tỷ lệthất bại điều trị thấp ≤ 5% thì khu vực GMS lại cao Trong số 28 nghiên cứuthì các nghiên cứu thực hiện tại Campuchia và Myanmar có tỷ lệ thất bại caotới 26,1% (2001) và 28,9% (2002) bằng theo dõi 28 ngày [108]

Các TES cũng cho thấy khi nồng độ lumefantrin đạt 860ng/ml thì tỷ lệ

đáp ứng điều trị cao hơn so với khi dùng liêu 510ng/ml Theo Price (2006),thuốc có hiệu lực nhất khi nồng độ thuốc nằm ở diện tích dới đờng cong [89],[90]

Dihydroartemisinin-piperaquin (Arterakin)

Arterakin là thuốc có hiệu lực cao và là 1 ACT đợc WHO khuyến cáo sửdụng Các nghiên cứu về kết hợp này cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị đều < 10% trừRwanda có tỷ lệ > 10% ở Việt Nam hiệu lực của Arterakin vẫn cao, tuy nhiên

đã băt đầu xuât hiện những nghiên cứu cho thấy sự giảm nhạy cảm của P falciparum với ART, thành phần chính của Arterakin [39], [97], [99].

1.2.2 Chiến lợc phòng chống KSTSR Kháng ART và giảm nhạy với các act tại tiểu vùng sông mekong.

Trớc những bằng chứng về tình trạng kháng ART và dẫn chất cùng với

sự giảm nhạy cảm của ACT Khu vực biên giới Myanmar-Thái Lan,

Campuchia-Việt Nam là những khu vực thuộc GMS đang trở thành một điểmnóng về KST kháng thuốc của thế giới [110], [116].

Chiến lợc của WHO năm 2008 có mục tiêu là tăng cờng khống chếVector và quản lý ca bệnh có hiệu quả Lấy khu vực biên giới Thái Lan-Campuchia làm mặt trận chính với hơn 500.000 màn tẩm mới cho khu vực 1

và 200000 màn tẩm lại cho khu vực 2 [86], [110]

- Khu vực 1, nơi mà P falciparum kháng ART đã đợc khẳng định gồm

4 tỉnh của Campuchia (khoảng 270.000 dân) và 2 tỉnh thuộc Thái Lan(khoảng 110.000 dân)

- Khu vực 2, là khu vực bao quanh khu vực 1, nơi mà những ngời dânsống ở đó có nguy cơ lây nhiễm KSTSR kháng ART từ khu vực 1 gồm 9 tỉnhcủa Campuchia với 4 triệu dân và 7 tỉnh của Thái lan với 7 triệu dân

Các nhân viên y tế thôn bản sẽ đợc đào tạo lại để nâng cao khả năngphát hiện và điều trị ca bệnh có hiệu quả Một dịch vụ cung cấp thuốc miễn phícho ngời dân sẽ đợc thiết lập Mở các phòng khám lu động ở khu vực biên giớiThái Lan-Campuchia Một hệ thống phơng tiện giáo dục, truyền rhông bằng cảhai thứ tiếng Thai-Campuchia cho ngời dân vùng biên giới [62]

Loại trừ KST kháng ART bằng cách phát hiện mọi ca bệnh sốt rét trongkhu vực và đảm bảo điều trị có hiệu quả kể cả với gametocyte Các mục tiêucủa chiến lợc đợc mô tả tóm tắt dới đây

1- Giảm áp lực chọn lọc của thuốc lên KST kháng ART bao gồm cả việc

đa vào luật cấm sử dụng phác đồ đơn trị liệu (monotherapy)

2- Ngăn chặn sự lan truyền rộng KST kháng ART bằng cách khống chếtốt muỗi truyền bệnh, khuyến khích ngời dân tự bảo vệ

3- Hạn chế sự bùng phát KST kháng ART bằng cách kiểm soát tốt sự dibiến động dân số và dân nhập c

4- Hỗ trợ cho chơng trình ngăn chặn và loại trừ KST kháng ART bằnggiáo dục, truyền thông nhằm thay đổi một cách toàn diện hành vi, sựnăng động của cộng đồng cũng nh sự ủng hộ của pháp luật

5- Chuẩn bị sẵn sàng nghiên cứu, khắc phục những thiếu hụt, đảm bảomột cách chắc chắn rằng chiến lợc đã áp dụng là chính xác

6- Cung cấp dịch vụ để việc điều trị có hiệu quả cao, theo dõi, giám sátquá trình thực hiện chiến lợc trên nhanh và với chất lợng cao

Một số khuyến cáo của WHO khi thực hiện các TES: [115], [116].

- Sự tồn tại KST > 72h là mốc xác định sự giảm nhậy cảm của thuốc

- Tỷ lệ thất bại điều trị > 10% là dấu hiệu giảm nhậy của một thuốc

- Tiếp tục giám sát tình trạng đề kháng của P falciprum với CQ, MF,

ART, AS7 và các thuốc thành phần của ACTs

1.3- Arterakin và hiệu quả trong điều trị sốt rét do

1.3.1- Những thông tin về piperaquin

Năm 1966 Viện nghiên cứu hóa học Thợng Hải tổng hợp đợc một chất

có cấu trúc hóa học tơng tự nh chất 13228RP do hãng Rhone- poulence củaPháp tổng hợp trớc đó và có khả năng diệt KSTSR Chất này chính làpiperaquin (PQ) Ngời ta ớc tính đã có khoảng hơn 200 tấn bột PQ đợc sử

dụng từ năm 1978 đến năm 1992 sau đó PQ nhanh chóng bị P falciparum

kháng lại (Taylor 2003) Gần đây cũng nh CQ, ngời ta thấy PQ có xu hớngnhậy cảm trở lại trong thành phần của các kết hợp thuốc dạng ACT [32], [97]

có nhiệt độ nóng chảy là 212-213º C Chất này hầu nh không tan trong nớc ngaycả khi đã đợc ion hóa hoàn toàn (Hung et al 2003) [32], [43]

Dạng base của piperaquin có công thức hoá học là C29H32CL2N6 : 4,4(1,3-propaneiyldi-4,1-piperazinediyl) bis(7-chloro) quinoline có trọng lợngphân tử là 535,51 đây là một chất dạng tinh thể không hoà tan trong nớc.Dạng muối tetra photphat (PQP) có công thức C29H32CL2N6 :,4H3PO4 có trọnglơng phân tử là 927,48 tan trong lipid, màu vàng, đắng [97]

-Nghiên cứu của Cheng., Nguyễn Thị Minh Thu và cs trên chuột thựcnghiệm có găn C14 cho thấy thuốc đợc hấp thụ vào máu tới 80-90%, chuyểnhoá ở gan sau đó đào thải qua phân và nớc tiểu Dới kính hiển vi điện tử, PQ làmtổn thơng màng không bào tiêu hoá, ty lạp thể KST giống nh của CQ [32], đặc biệt

là thời gian bán thải rất dài 543h ở ngời lớn và 324h ở trẻ em [43], [97] Nghiêncứu về độc tính cấp và trờng diễn trên súc vật của Sheng và cs thấy PQ an toàn hơn

CQ gấp 5 lần[97] độc tính cấp trên tim, để làm hạ huyết áp xuống 40mmHg vớiPQP là 42 mg/kg còn với CQ là 16mg/kg [41], [96]

1.3.2- Sự tơng đồng giữa hai thuốc Chloroquin và Piperaquine

 Sự tơng đồng về cấu trúc giữa piperaquin và chloroquin

Cấu trúc đợc đóng khung là nhóm chức 7-chloro-4 aminoquinolein,nhóm này có trong cấu trúc phân tử của cả CQ lẫn PQ và PQP Đây là cấu trúc

có ý nghĩa quyết định đối với hoạt tính diệt KST của hai thuốc này (Krugliak

et al 2002)[59], [97]

Hinh 1.7 Cấu trúc 7-chloro-4 aminoquinolein của phân tử PQ

Hình 1.8 Cấu trúc 7-chloro-4 aminoquinolein của phân tử CQ

 Sự tơng đồng về cơ chế tác động giữa piperaquin và chloroquin

Cả CQ và PQ đều ngăn cản quá trinh polyme hóa hematin bằng cáchtạo phức hợp CQ-hematin , PQ-hematin Phức hợp này tích tụ trong hốc thựcbào gây đứt gẫy ở vách các không bào tiêu hóa và ngăn chặn sự hoạt động của

hệ Enzyme trong KST và làm tổn thơng ty lạp thể (Fisch et al 1982; Sugioka

et al, 1987; Surolia and Padmanaban, 1991) [59], [96]

 Sự kháng chéo giữa piperaquin và chloroquin

Việc sử dụng PQ đơn thuần một cách rộng rãi đã làm xuất hiện tìnhtrạng kháng thuốc này ở Trung Quốc Dựa vào so sánh EC50 ngời ta thấyEC50 của PQ tăng lên ở những địa phơng khác nhau nh: ở Tỉnh YunnanTrung Quốc là 240 nmol/l trong khi đó ở đảo Hải Nam là 1720nmol/l , ở Lào

là 167 nmol/l [97]

Nghiên cứu của Yang và cs ở 2 tỉnh Yunnan và Hải nam Trung Quốc

công bố có tới 95% P falciparum đã kháng CQ thì cũng kháng với PQ [97].

Các TES cho thấy có sự tăng lên của EC50 của PQ giữa P falciparum kháng với CQ và ngợc lại ở Campuchia, EC50 của P falciparum nhạy với

CQ là 8,3 nmol/l trong khi đó với P falciparum kháng CQ là 16 nmol/l Cũng

tơng tự nh vậy ở Madagasca trị số này là 36 nmol/l và 42 nmol/l [32], [97]

1.3.3- Hiệu lực của thuốc kết hợp Arterakin trong điều trị sốt rét do P.

falciparum cha biến chứng

Viên nén Arterakin bao gồm DHA (40 mg) + PQ (320 mg) đợc thửnghiệm và đánh giá tính an toàn và hiệu lực điều trị từ năm 2001 Theo số liệucủa WHO năm 2010, Arterakin có tính an toàn, hiệu lực cao trên thế giới

Các nghiên cứu tiến hành ở Thái Lan trên trẻ em mắc SR thờng do P falciparum cho kết quả cao tới > 95% [18], [27], [117].

Các nghiên cứu trên cho thấy, bệnh nhân nhiễm P vivax và P falciparum ở trẻ 3 tuổi trở lên thấy thời gian sạch KST trung bình là 1,3 ± 0,5 ngày với P falciparum, và 1 ± 0,2 ngày đối với P vivax ngắn hơn so với thời

gian sạch KST của ART dùng đơn độc (trung bình 3 ngày) Các nghiên cứutại Viện SR-KSR-CTTƯ và Viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cho thấy

tỷ lệ khỏi bệnh từ 90,4% đến 98,3% [10], [16], [19]

Tuy nhiên sau một thời gian sử dụng, các ACT bắt đầu bộc lộ nhữngdấu hiệu cho thấy sự giảm hiệu lực điều trị Riêng với Arterakin, theo số liệucủa WHO năm 2010 diễn biến nh sau:

Bảng 1.2 Hiệu lực của Arerakin trên thế giới (WHO 2010)

Tỷ lệ % thất bại điều trị

1.4 kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu kháng thuốc

1.4.1 Nguyên lý của kĩ thuật khuyếch đại gen - PCR

Phơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) đợc Karry Mullis- nhàhoá sinh học ngời Mỹ và cs đề xuất vào năm 1985 và đợc trao giải Nobel năm

1993 Mục đích của phơng pháp này nhằm nhân lên nhiều lần một đoạn ADNcần nghiên cứu trong ống nghiệm Đoạn ADN cần nghiên cứu sẽ đợc nhân lêntheo hàm số mũ 2n Nhờ có kĩ thuật PCR, ngời ta đã xác định đợc một cáchchính xác các loài KSTSR khác nhau dựa vào việc xác định đợc cấu trúc gen

đặc thù của loài cùng nhiều ứng dụng quan trọng khác[8]

Điều kiện cần thiết để thực hiện đợc một phản ứng PCR:

- Phân tử ADN cần nhân lên

- Hai ADN mồi (primers), mỗi mồi có khoảng 20 đôi base, hai mồi nàygắn ở hai đầu của phân tử ADN cần nhân lên: mồi ngợc và mồi xuôi

- 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

- Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao, enzymnày đợc tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus[39]

Các giai đoạn của mỗi chu kỳ nhân lên khi chạy PCR (3 giai đoạn):

- Giai đoạn biến tính: Để tách ADN thành 2 sợi đơn ADN đợc ủ ở 940 C

- Giai đoạn lai ghép: ADN mồi đợc lai ghép với từng sợi đơn củaADN cần nhân lên ở vị trí 5'', 3' Nhiệt độ tối u cho giai đoạn này là50-520C

- Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếpcác nucleotid vào sau ADN mồi theo trình tự bổ sung dựa vàokhuôn ADN cần nhân lên Thực hiện ở nhiệt độ 70-720C

Sau mỗi chu kỳ từ một phân tử ADN ban đầu tạo hai phân tử ADN,Sau 30 chu kỳ từ một phân tử ADN ban đầu sẽ có 230 phân tử đợc tạo thành[7], [29]

Enzym giới hạn - Phân đoạn ADN

Để phân đoạn ADN ngời ta dùng các enzym cắt hay còn gọi enzym giớihạn (Restriction enzyme) Enzym giới hạn có đặc điểm là cắt ADN ở những vịtrí xác định Các loại enzym giới hạn có các đặc điểm sau[39]

- Cắt ADN ở các vị trí xác định

- Đợc phân lập từ vi khuẩn, tên enzym cắt là tên viết tắt của vi khuẩn

- Vị trí cắt thờng có 4-8 nucleotid sợi đơn tạo thành đầu kết dính

- Sau khi bị cắt ADN có các đầu kết dính ở các sợi đơn Khi bị cắt các

đầu kết dính của phân tử ADN có các nucleotid bổ sung cho nhau

1.4.2 ứng dụng kỹ thuât PCR trong nghiên cứu sốt rét

Kỹ thuật PCR trong phân biệt tái phát và tái nhiễm

Nếu phát hiện KST ở các thời điểm đợc coi là một tiêu chuẩn của thất bại

điều trị thì vấn đề đặt ra là: KST này là do nhiễm mới hay do tái phát Kĩthuật nhuộm giêm sa không thể phân biệt đợc tái nhiễm và tái phát Bằng kỹthuật sinh học phân tử, chúng ta đã có thể nhận biết đợc tái phát hay táinhiễm nhờ xác định kiểu gen ở 3 locus MSP1, MSP2, GLURP của KST [9]

Kỹ thuật PCR trong phát hiện KST kháng thuốc

Hai phơng pháp đã và đang sử dụng trong nghiên cứu kháng thuốc là

kỹ thuật in vivo và in vitro thử nghiệm in vivo bị ảnh hởng bởi mức độ miễn dịch của bệnh nhân Kỹ thuật in vitro cho những thông tin trực tiếp từ sự nhạy

cảm của KST, Những thử nghiệm này chậm , phải thực hiện với số lợng lớncác mẫu và đòi hỏi mẫu máu nuôi cấy phải tơi [7], [29], [35]

Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát hiện các điểm đột biến liên

quan đến kháng thuốc Nhờ sử dụng PCR ngời ta đã xác định đợc P falciparum kháng với CQ là do các đột biến gen Các tác giả cho rằng đột biến

có tính quyết định đến kháng CQ là gen Pfcrt trên nhiễm sắc thể số 7 Nh vậy, bên cạnh thử nghiệm in vivo, in vitro, cần ứng dụng các kĩ thuật hiện đại

nh kĩ thuật sinh học phân tử để đánh giá tính nhạy cảm của thuốc sốt rét đãbiết rõ cơ chế tác dụng

Chơng 2

đối tợng và Phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng, tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

2.1.1 Đối tợng nghiên cứu.

Đối tợng nghiên cứu cho cả thử nghiệm lâm sàng và đánh giá kháng

chloroquin là tất cả các bệnh nhân đợc chẩn đoán Sốt rét do P falciparum cha có biến chứng tại địa điểm nghiên cứu với các tiêu chuẩn lâm

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ :

- Trẻ dới 6 tháng tuổi hoăc ngời lớn trên 60 tuổi

- Có các dấu hiệu của SR nặng, biến chứng (Phụ lục 1)

- Nhiễm phối hợp hoặc nhiễm đơn các loài Plasmodium khác

- Mật độ KST trong máu < 500KST/mm3 hoặc > 200.000KST/mm3

- Đang có thai hoặc đang cho con bú

- Trẻ suy dinh dỡng nặng

- Đang sốt do mắc các bệnh cấp tính (Viêm nhiễm cấp tính do vi khuẩn,Sốt xuất huyết, Sôt phát ban)

- Mắc bệnh mãn tính, HIV

- Có tiền sử mẫn cảm với 1 trong hai thành phần của Arterakin

- Bệnh nhân cũng sẽ bị loại khi trớc đó hoặc trong quá trình nghiên cứudùng các thuốc chống SR khác bằng thử nớc tiểu (Phụ lục 8)

Trong trờng hợp xuất hiện các triệu chứng nặng của SRAT trong quátrình nghiên cứu thì đợc phép dùng AS đờng tiêm tĩnh mạch theo quy định của

Bộ Y tế và loại khỏi nghiên cứu

2.1.4 Thòi gian, địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài:

Nghiên cứu đợc tiến hành trong 3 năm 2008-2010 với 2 giai đoạn:Giai doạn giám sát hiệu lực thuốc trên thực địa theo qui trình 28 ngay vàgiai đoạn nghiên cứu trong labo

Địa điểm thực hiện đề tài:

- Giám sát hiệu lực thuốc và theo dõi tại thực địa theo quy trình 28ngàyđợc tiến hành tại 2 khu vực có SR lu hành là Miền Trung và Tây

Nguyên Tại 2 tỉnh có tỷ lệ P.falciparum kháng CQ cao là Quảng Trị giáp

với Lào và Đăk Nông giáp với Campuchia

o Tỉnh Quảng Trị - Huyện Hớng Hoá

o Tỉnh Đăk Nông - Huyện Dakmil, Dak Song, Czut

- Thực hiện kĩ thuật PCR trong đánh giá kháng CQ và phân biệt táiphat, tái nhiễm tại Khoa Sinh học phân tử Viện SR - KST - CT TƯ

H×nh 2.1 §iÓm nghiªn cøu t¹i MiÒn trung vµ T©y nguyªn

Hinh 2.2 §iÓm nghiªn cøu t¹i tØnh Qu¶ng TrÞ

Hinh 2.3 §iÓm nghiªn cøu t¹i tØnh §¨k N«ng

2.1.5 Vân đề đạo đức trong nghiên cứu

Sự tự nguyện.

- Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều đợc giải thích rõ về mục

đích nghiên cứu, và quy trình theo dõi và tự nguyện tham gia

- Đợc kí cam kết tự nguyện tham gia

- Nếu là trẻ em dới 16 tuổi cần có sự đồng ý của bố, mẹ hoặc ngờibảo trợ ( Phụ lục 10 )

- Đối với các bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn lựa chọn nhng cóKSTSR trong máu thì vẫn đợc điều trị miễn phí bằng thuốc SR theo quy

định hiện hành của Bộ Y tế

- Các bệnh nhân đợc phát hiện những vấn đề về sức khoẻ trong qúatrình sàng lọc mặc dù không liên quan đến SR sẽ đợc t vấn đi khám, chữabệnh ở những cơ sở y tế phù hợp

- Những vấn đề sức khoẻ là những bí mật cá nhân dợc phát hiện quakhám lâm sàng, xét nghiệm nh mắc các bệnh xã hội, viêm gan, HIV v.v sẽ

đợc giữ kín và đợc t vấn về bệnh tật, cũng nh giới thiệu tới những cơ sở y

tế phù hợp

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1- Thiết kế nghiên cứu.

Đây là một nghiên cứu mô tả, cắt ngang theo kiểu thử nghiệm lâmsàng mở, không đối chứng (one arm) Một trong các phơng pháp giám sáthiệu lực điều trị của thuốc sốt rét của WHO 2005, gồm 2 phần

- Giám sát hiệu lực điều trị của Arterakin trên bệnh nhân SR do P falciparum cha biến chứng theo qui trình 28 ngày của WHO Có sử dụng kĩ

thuật PCR để xác định tái phát-tái nhiễm

- Đánh giá tình trạng kháng CQ của P fanciprum trên invitro từ các mẫu

máu của bệnh nhân trong phần giám sát hiệu lực thuốc bằng PCR để xác định

đột biến điểm 76 trên gen Pfcrt, điểm quyết định tính kháng CQ.

2.2.2- Phơng pháp chọn mẫu.

Đối với đánh giá hiệu lc của Arterakin trên lâm sàng:

Chọn các bệnh nhân có sốt tại các điểm trên, nếu có đủ các tiêu chuẩntrong mục 2.1.2 và 2.1.3 sẽ đợc da vào nghiên cứu

Đối với đánh giá kháng chloroquin trên invitro:

Là tất cả các mẫu máu tơng ứng với các bệnh nhân đã đợc lựa chọn vàonghiên cứu hiệu lực của Arterakin nói trên

Cỡ mẫu :

Qua các nghiên cứu của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung

ơng cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị trong các nghiên cứu với phối hợp thuốcdihydroartemisinin - piperaquin khoảng < 5% Với độ tin cậy là 95% (p =0,05), độ chính xác d là 10% thì cỡ mẫu cho nghiên cứu loại này đợc tínhtheo bảng qui định cỡ mẫu năm 1987 dới đây

Bảng 2.1 Tính cỡ mẫu theo quy định của WHO

Tỷ lệ quần thể (P) cho trước, mức độ tin cậy 95%

Cỡ mẫu này cũng đồng thời sử dụng cho đánh giá kháng chloroquinbằng PCR Nh vậy tổng số mẫu máu sẽ là ≥ 100 mẫu cho nghiên cứu pháthiện đột biến kháng CQ

2.2.3.Thuốc và phác đồ dùng cho nghiên cứu

Thuốc Arterakin:

Viờn Arterakin chứa 40 mg dihydroartemisinin (DHA) và 320 mgpiperaquin (PIP) do xớ nghiệp dược phẩm trung ương I sản xuất Tất cả cỏcđiểm sẽ cựng sử dụng 1 lụ do XNDP Trung uong 1 sản xuất, Số lô Botch.N0,ngày sản xuất 03/11/2008, hạn sử dụng tháng 11/2011 và được kiểm tra chấtlượng tại Viện kiểm nghiệm Quốc gia

Các thuốc khác dùng cho điều trị triệu chứng:

- Pracetamol dạng viên dùng khi trẻ dới 7 tuổi sốt > 3805

- Gói ORS,

Các thuốc dùng khi có biến chứng:

- Dịch truyền đẳng trơng (Glucoza 5%, Natriclorid 0,9%, Ringerlactat)trong trờng hợp xuất hiện những dấu hiệu biến chứng nặng

- Viên seduxen 10mg/ống (khi bệnh nhân co giật ở trẻ < 7 tuổi)

- Thuốc artesunat dạng tiêm tĩnh mạch 60 mg/lọ (khi bệnh nhân nôn

nhiều hoặc chuyển sang SRAT)

- Các thuốc chống dị ứng (khi có phát ban, mẩn ngứa)

Phác đồ điều trị:

Bảng 2.2 Liều Arterakin tính theo nhóm tuổi

(Bộ Y Tế 2008)

Nhóm tuổi Số lượng viờn (Arterakin™) trong ngày) trong ng yày

2.2.4 Quy trình tiến hành nghiên cứu và theo dõi.

2.2.4.1 Quy trình đánh giá hiệu lực Arterakin trên lâm sàng

Nghiên cứu đợc tiến hành theo qui trình 28 ngày của Tổ chức y tế thếgiới - WHO/MAL/96.1077 (Phụ lục 5)

Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn sẽ đợc lập danh sách nghiên cứu KST vànhiệt độ đợc theo dõi ngày 1 lần cho đến khi hết sốt và sạch KST trong 2 ngàyliên tiếp Ghi đầy đủ trong bệnh án các thông số theo dõi, các dấu hiệu lâmsàng, các chỉ số xét nghiệm và các triệu chứng phụ Sau đó hàng tuần bệnh

nhân đợc kiểm tra lại nhiệt độ, KSTSR vào các ngày D 7, D 14 D ,21 D ,28

- Lam máu đựoc soi tìm KST Đếm số lợng KST từ 2 ngời độc lập, sau đó

đợc mã hoá theo địa điểm và ngày lấy lam máu từ D0 - D28

- Làm PCR mẫu máu ngày D0 để loại trừ đồng nhiễm P vivax

- Nếu ngày D3 cha sạch ký sinh trùng phải lấy thêm mẫu máu vào các

ngày D 4 , D 5…( chỉ dừng khi 2 ngày liên tiếp âm tính)

- Nếu có sốt lại trong bất kì ngày nào từ D 7 - D ,28 thì ngời bệnh sẽ đợckhám và lấy máu tìm KST và làm PCR lại nh ngày D0

- Nếu có KST sẽ đợc điều trị lại và lấy máu làm PCR để phân biệt táiphát, tái nhiễm theo qui trình

Thử nớc tiểu phát hiện có thai với phụ nữ từ 15 tuổi trở lên

- Ký cam kết tham gia một cách tự nguyện

- Uống thuốc theo liều lợng, thời gian quy định

Ngày D 1

- Đo thân nhiệt.

- Khám, phát hiện, xử trí các tác dụng phụ nếu có

- Lấy máu làm xét nghiệm: Xác định mật độ KSTSR

- Cho uống thuốc theo phác đồ

Ngày D 2

- Đo thân nhiệt

- Khám, xử trí cấc tác dung phụ

- Lấy máu làm xét nghiệm: tìm mật độ KST

- Cho uống thuốc theo phác đồ

Ngày D 3

- Đo thân nhiệt

- Khám, xử trí cấc tác dung phụ

- Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST

Ngày D 4

- Đo thân nhiệt

- Khám, xử trí cấc tác dung phụ

- Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST

Ngày D 7, D 14 D ,21 D ,28

- Đo thân nhiệt

- Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST (riêng D28 lây máu làm PCR)

Bảng 2.3 Tóm tắt quy trình theo dõi từ D 0 - D ,2

Ngày D0 D1 D2 D3 D4 D7 D14 D21 D28

Ngàybất kỳ