Luận văn xây dựng quy trình xác định vi khuẩn verotoxigenic escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction

luận văn

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

-

LƯU THỊ HẢI YẾN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ðỊNH VI KHUẨN

VEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI TRONG THỊT

BẰNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2011

Tác giả

Lưu Thị Hải Yến

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, phải kể tới

sự giúp ñỡ về vật chất và tinh thần của các thầy, cô giáo, gia ñình và bạn bè của tôi

Trước hết, tôi xin ñược bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới TS ðỗ Ngọc Thúy – người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin ñược cảm ơn TS Nguyễn Bá Hiên, các thầy cô giáo trong

bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Cù Hữu Phú, các cán bộ nghiên cứu công tác tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia ñã giúp ñỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Cuối cùng, gia ñình và bạn bè tôi là một sự cổ vũ to lớn, là ñộng lực ñể tôi hoàn thành luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2011

Tác giả

Lưu Thị Hải Yến

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

A/E Attaching and Effacing (Bám dính và xâm nhập)

BHI Brain Heart Infusion

BPW Buffer Peptone Water

DNA Deoxyribonucleic Acid

E coli Escherichia coli

FDA Food and Drug Administration (Cơ quan thực phẩm và dược phẩm

Mỹ)

HC Hemorrhagic colitis (Viêm ruột xuất huyết)

HUS Hemolytic uremic syndrome (Hội chứng huyết niệu)

LB Luria Bertani

MR Methyl Red

m-TSB modified Trypticase Soy Broth

NB Nutrient Broth

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure (Ban xuất huyết giảm tiểu

VTEC Verotoxigenic Escherichia coli

WHO World Health Organisation (Tổ chức y tế thế giới)

DANH MỤC BẢNG

2.1 Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh các gen VT1, VT2 và eae 36

2.2 Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh

gen VT1, VT2 và eae 37

2.3 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh gen VT1, VT2 và eae 37

2.4a Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E coli ñối chứng dương 38

2.4b Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn ñối chứng âm 39

3.1 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR ñơn và ña mồi ñể phát hiện một số gen ñộc lực của VTEC 45

3.2 Kết quả xác ñịnh môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn ñể chiết tách DNA cho phản ứng PCR 47

3.3a Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức ñể phát hiện các chủng vi khuẩn ñối chứng dương 48

3.3b Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức với các chủng vi khuẩn ñối chứng âm 49

3.4 Kết quả ñếm số hai chủng vi khuẩn ñối chứng dương trên một số môi trường nuôi cấy 51

3.5 Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phản ứng PCR trên môi trường nuôi cấy 52

3.6 Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phản ứng PCR trong mẫu thịt sạch 55

3.7 Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập ñược 60

3.8 Kết quả kiểm tra các ñặc tính của vi khuẩn E coli phân lập ñược 61

3.9 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ các mẫu thịt 63

3.10 Khả năng sản sinh ñộc tố VT của các chủng VTEC phân lập ñược 69

3.11 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng VTEC phân lập ñược 70

DANH MỤC BIỂU, HÌNH

Hình 1.1: Cơ chế tác ñộng của ñộc tố VT 16

Hình 3.1: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn ñối chứng dương và âm sau quá trình ñiện di 48

Hình 3.2: Kết quả ñếm số chủng FD636 trên thạch máu 51

Hình 3.3: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các nồng ñộ pha loãng khác nhau từ môi trường LB ñã nuôi cấy chủng FD636 54

Hình 3.5: Xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm 60

Hình 3.6: Tính chất mọc của E coli trên môi trường MacConkey 62

Hình 3.7: Tính chất mọc của E coli trên môi trường thạch máu 62

Hình 3.8: Tính chất mọc của E coli trên môi trường EMB 62

Hình 3.9: Tính chất mọc của E coli trên môi trường CT-SMAC 62

Hình 3.10: Khả năng lên men sinh hơi một số loại ñường của E coli 62

Hình 3.11: Khả năng sinh Indol của E coli 62

Hình 3.12: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu thịt sau quá trình ñiện di64 Biểu ñồ 3.1: Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ các mẫu thịt 64

Hình 3.13: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của một số mẫu thịt sau quá trình ñiện di 66

Hình 3.14: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu phân và mẫu lau 67

thân thịt sau quá trình ñiện di 67

Hình 3.15: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của mẫu phân sau quá trình ñiện di 67

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC BIỂU, HÌNH iv

MỤC LỤC vi

MỞ ðẦU 1

PHẦN I - TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.2 Phân loại E coli 6

1.3 ðặc tính của vi khuẩn E coli 7

1.4 Verocytogenic Escherichia coli (VTEC) 12

PHẦN II - ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 34

2.2 Nội dung nghiên cứu 34

2.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 34

2.4 Phương pháp nghiên cứu 35

PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR 44

3.1.1 Lựa chọn giữa PCR ñơn và PCR phức 44

3.1.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp ñể tách chiết DNA mẫu 46

3.1.3 Kết quả thực hiện phản ứng với các chủng ñối chứng 47

3.2 Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh VTEC 49

3.2.1 Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh VTEC trong môi trường nhân tạo 50

3.2.2 Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp PCR

dùng ñể xác ñịnh VTEC trong mẫu thịt sạch 55

3.3 Quy trình xác ñịnh sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt57 3 4 Kết quả phân lập vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt 58

3.4.1 Kết quả áp dụng quy trình trong phân lập và xác ñịnh vi khuẩn VTEC có trong các mẫu thịt thu thập từ các chợ và lò mổ 59

3.4.2 Kết quả giám ñịnh các chủng vi khuẩn VTEC phân lập ñược 68

PHẦN IV - KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 71

4.1 Kết luận 71

4.2 ðề nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ ñộc thực phẩm (ðậu Ngọc Hào, 2011)

Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) có khoảng 8 triệu người bị ngộ ñộc thực phẩm mỗi năm, trong ñó phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ ñộc thực phẩm, làm hơn 5.000 người mắc và 42 trường hợp tử vong Thiệt hại kinh tế cho chi phí ñiều trị bệnh và nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011)

Các con số trên ñây cho thấy một thực trạng ñáng lo ngại về vấn ñề vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) VSATTP có vai trò rất quan trọng ñối với cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia

Trong những thập kỷ gần ñây, ô nhiễm vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc nhóm Verotoxygenic Escherichia coli (VTEC) sản sinh ñộc tố

Verotoxin (VT) trong thực phẩm ñã trở thành ñề tài nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn này gây ra ở người (Bergamini, 2007) Tuy nhiên, tại Việt Nam, có rất ít công trình nghiên cứu tương tự

ðộc tố VT có hai nhóm chính là VT1 và VT2 với nhiều biến thể khác nhau (Gyles và Fairbrother, 2004) ðộc tố này gây ra các loại bệnh như viêm ruột xuất huyết (HC – Hemorrhagic colitis), hội chứng huyết niệu (HUS – Haemolytic uremic syndrome), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP – Thrombotic Thrombocytopanic purpura), viêm ñường niệu (Urinary tract

infections), viêm màng não (meningitis) (XU Jian-Guo và cs, 1999; Lake và Cressey, 2002)

Vi khuẩn này cĩ thể lây nhiễm qua nhiều đường khác nhau, như sử dụng thực phẩm, rau xanh, nước uống bị nhiễm vi khuẩn, tiếp xúc trực tiếp với động vật mang trùng, … (Võ Thành Thìn và cs, 2008)

Việc xây dựng được một quy trình chuẩn để xác định vi khuẩn VTEC phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm tại Việt Nam, nhằm xác định nhanh

và chính xác thịt tươi bị nhiễm vi khuẩn VTEC sẽ là nền tảng quan trọng trong chẩn đốn và điều trị các trường hợp ngộ độc thực phẩm cũng như cho các nghiên cứu tiếp theo

Vì vậy, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình

xác định vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)”

Nghiên cứu này cho phép xác định nhanh và chính xác tiêu chuẩn vi sinh đối với vi khuẩn VTEC trong thực phẩm, loại bỏ hoặc tiêu hủy kịp thời thực phẩm cĩ nhiễm mầm bệnh này hoặc xác định nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm do VTEC

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được một quy trình thích hợp cĩ thể dùng để xác định chính xác thịt bị nhiễm vi khuẩn VTEC

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử nghiên cứu

Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người ðức Theodore Escherich ñã lần ñầu tiên mô tả một loài vi khuẩn phân lập ñược từ phân của

một bệnh nhi Ông ñặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và sau

nhiều lần ñổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này ñược gọi với một tên thống

nhất là Escherichia coli, viết tắt là E coli Từ ñó ñến nay, E coli ñược xác

ñịnh là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật ñường ruột của người và ñộng vật (Vũ Khắc Hùng, 2004)

E coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae

Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn, trong vi trường thường ñứng riêng hoặc thành ñôi, cho phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di ñộng nhờ lông roi (flagella) hoặc không di ñộng Hầu hết các chủng ñều lên men ñường Lactose, một số lên

men chậm và một số không sinh hơi Thông thường, E coli có phản ứng

Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges-Proskauer (VP) âm tính

và Indol dương tính E coli là vi khuẩn thường thấy trong ñường tiêu hóa của người và ñộng vật; từ ñó E coli ñược thải vào nước, ñất và ñồng cỏ, không

chỉ nhiễm lan trong ñàn mà có thể nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,

Từ ñầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E coli là tác

nhân gây một số bệnh ở trẻ em Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và

Beavan) (1989) gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, sau này ñược gọi là nhóm O111, thuộc lớp EPEC Từ ñó, những nhóm E coli khác ñược thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy Các vi khuẩn E coli gây bệnh

có ñộc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh nghiêm trọng

Một số chủng sản sinh ựộc tố tế bào gây phá hủy tế bào Vero và Hela, tương

tự như ựộc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra Những ựộc tố này

ựược gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc like toxin Trong báo cáo này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh ựộc tố này ựược gọi là

Shiga-Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC

Trong những năm gần ựây, các chủng E coli gây tiêu chảy ựược chia thành ắt nhất 5 nhóm đó là E coli gây ựộc ruột (ETEC Ờ Enterotoxigenic E coli) Ờ sản sinh ựộc tố ruột nhưng không xâm nhập, E coli xâm nhập ruột (EIEC Ờ Entero invasive E coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột,

E coli gây bệnh tắch ruột (EPEC Ờ Enteropathogenic E coli) có khả năng

bám dắnh vào tế bào biểu mô và gây bệnh tắch bám dắnh và xâm nhập

(Attaching and Effacing - A/E), E coli gây ngưng kết (EaggEC Ờ Enteroaggregative E coli) có khả năng bám dắnh vào tế bào biểu mô nhờ một

cơ quan giống lông nhung và khuyếch tán vào trong biểu mô ruột Nhóm cuối

cùng có tên là E coli có khả năng sản sinh ựộc tố VT (VTEC Ờ Verotoxigenic Escherichia coli) gây bệnh viêm ruột xuất huyết (HC Ờ Haemorrhagic colitis),

huyết niệu (HUS Ờ Haemolytic ureamic syndrome) và ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP Ờ Thrombotic thrombocytopenic purpura) ở người Trước ựây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả năng gây bệnh tắch A/E ở biểu mô ruột của ựộng vật cảm thụ, nhưng khi phát hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh ựộc tố VT ựể trợ giúp cho yếu tố bám dắnh này, chúng ựã ựược tách ra thành một nhóm riêng là VTEC

E coli O157:H7 hiện nay là chủng VTEC ựược báo cáo nhiều nhất gây

ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993), Canada (Waters và cs, 1994), Anh (Thomas và cs, 1996) và Nhật Bản (Bettelheim, 1997) Vi khuẩn này ựược xác ựịnh là một trong các tác nhân

gây ngộ ñộc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ ñộc thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (HUS) (Phạm Thị Tâm và cs, 2009, trích dẫn theo Griffin, 1995)

Vụ dịch ñầu tiên ñược báo cáo vào năm 1982, E coli O157:H7 ñược

xác ñịnh là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ Trong một thập kỷ sau ñó, vi khuẩn này ñã trở thành một vấn ñề lớn liên quan ñến sức khỏe cộng ñồng, ñược chính phủ nhiều nước quan tâm Vụ dịch lớn nhất ñược báo cáo xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7-8/1996, với 9578 ca bệnh ñược ghi nhận và

11 người chết, 90 bệnh nhân ñược xác ñịnh là bị HUS Vụ dịch lớn thứ hai xảy ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong ñó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP Mặc dù, serotyp O157:H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người Hơn nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng ñịa lý khác nhau Có hơn 100 serotyp VTEC ñược xác ñịnh dựa trên kháng nguyên O có khả năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP

Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường (Wachsmuth, 1994) Ví dụ, ở ðức, VTEC là tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy

thứ hai ở trẻ em sau Salmonella, ở Úc, ñứng thứ ba sau Salmonella và Campylobacter

VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần như không có triệu chứng gì, có hoặc không có triệu chứng ñau bụng nhẹ, ñến những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP ðối tượng thường bị nhiễm VTEC là trẻ

em dưới 5 tuổi hoặc người già Ở những người trưởng thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không xuất huyết Hiện tượng này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn Ở ñộng vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bò, chúng cũng có thể gây bệnh phù ñầu ở lợn (ðỗ Ngọc Thúy, 2004)

Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157:H7, có liên quan tới việc ăn thịt bò chưa nấu chín kỹ, một số thực phẩm tương tự hoặc sữa tươi Phương thức lây truyền chủ yếu của VTEC là qua thực phẩm Vật nuôi, ñặc biệt trâu bò, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin và cs, 1993) Trong quá trình giết mổ, ñộng vật mang trùng có thể truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia súc khác qua tay người giết mổ và dụng

cụ lò mổ Hiện nay, người ta vẫn chưa khẳng ñịnh ñược liệu tất cả các chủng VTEC phân lập ñược từ ñộng vật có gây bệnh cho người hay không

Tiêu chuẩn Việt Nam quy ñịnh: vi khuẩn này không ñược phép có mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp, rau quả muối, nước uống, sữa và các sản phẩm từ sữa

Ở Việt Nam, có rất ít thông tin về VTEC ở những ñộng vật mang trùng, thân thịt sau khi giết mổ và thực phẩm Hơn nữa, thực tế hiện nay không có 1

bộ kit phát hiện VTEC nào trên thị trường, ngoại trừ nhóm O157 Do ñó, các phương pháp phát hiện nhanh VTEC ở Việt Nam cần phải ñược phát triển ñể xác ñịnh ñược vai trò của vi khuẩn này ở ñộng vật mang trùng cũng như các sản phẩm từ ñộng vật

1.2 Phân loại E coli

E coli có thể ñược chia thành các nhóm dựa trên bệnh lý mà chúng gây

ra, vị trí các kháng nguyên, ñịnh typ phage, thông tin về plasmid và khả năng sản sinh yếu tố dung huyết Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học thường

ñược sử dụng nhất và có hiệu quả khi phân loại E coli (Hanna Evelina

Sidjabat-Tambunan, 1997)

Năm 1944, Kauffman là người ñầu tiên ñưa ra phương pháp phân loại

vi khuẩn E coli dựa trên ñặc ñiểm huyết thanh học, và với một số cải tiến, phương pháp này vẫn ñược áp dụng cho tới ngày nay Theo ñó, vi khuẩn E coli ñược phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm có kháng nguyên

thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar) và kháng nguyên giáp mô

K (Capsular) (Lior, 1994)

Mặc dù E coli ñược phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên này nhưng

kháng nguyên O và H thường ñược sử dụng nhiều hơn Do ñó, thuật ngữ serotyp chỉ ñược sử dụng khi hai kháng nguyên này ñã ñược xác ñịnh Khi chỉ

có kháng nguyên O ñược xác ñịnh, các vi khuẩn E coli ñược xếp thành nhóm kháng nguyên O (serogroup O) Hiện nay, nhóm E coli dựa trên kháng

nguyên O ñã ñược xác ñịnh ñược ñánh số từ O1 ñến O173 (trừ 7 nhóm ñã bị loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122) Cũng ñã có 103 kháng nguyên

K và 56 kháng nguyên H ñược xác ñịnh

1.3 ðặc tính của vi khuẩn E coli

1.3.1 ðặc tính hình thái

E coli là trực khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, có kích thước 2 – 3 x 0,6 µm

Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, ñứng riêng rẽ, ñôi khi xếp 2 – 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài Vi khuẩn không có giáp mô, không sinh nha bào và không bắt màu với các thuốc nhuộm axit Vi khuẩn có lông và có khả năng di ñộng (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) Khi quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử, một số chủng vi khuẩn nhất ñịnh có mang cấu trúc fimbriae hay còn gọi là yếu tố bám dính

1.3.2 ðặc tính nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện Nhiệt ñộ thích hợp

cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 370C, pH thích hợp là 7,4, nhưng vi khuẩn cũng có thể phát triển ñược ở môi trường có pH từ 5,5 – 8,0 (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001)

Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, một số chủng có thể phát triển ñược ở môi trường tổng hợp ñơn giản

- Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, ñường kính từ 2-3 mm Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M

- Môi trường nước thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, môi trường ñục ñều có lắng cặn màu tro nhạt dưới ñáy, ñôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối

- Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng gây dung huyết

- Môi trường Simmon citrate: Khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục

- Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu ñỏ

- Môi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím ñen

- Môi trường SS: Khuẩn lạc có màu ñỏ

1.3.3 ðặc tính sinh hóa

- ðặc tính lên men và sinh hơi các loại ñường:

Vi khuẩn E coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại ñường

như: Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose; lên men không chắc chắn với các loại ñường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin

Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi nhanh ñường Lactose, còn vi khuẩn Salmonella spp không có ñặc tính này ðây chính là ñặc ñiểm quan trọng ñể phân biệt vi khuẩn E coli và Salmonella

- Các ñặc tính khác:

+ Làm ñông vón sữa sau 24 – 72 giờ nuôi cấy ở 370C

+ Không làm tan chảy gelatin

+ Các phản ứng khác: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase,

VP, Urease, H2S âm tính Vi khuẩn E coli có khả năng khử nitrat thành nitrit,

khử cacboxyl trong môi trường lysine decacboxylase

1.3.4 Sức ñề kháng

Vi khuẩn E coli có sức ñề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt ñộ 550C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút, ñun sôi ở 1000C thì chết ngay Các chất sát trùng như axit phenic 3%, HgCl2 0,5%, formol 1-2% có thể tiêu diệt vi khuẩn nhanh trong 5 phút

Trong phân, chất ñộn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời, vi khuẩn

có thể tồn tại trên 2 tháng Vi khuẩn E coli có khả năng ñề kháng với sự sấy khô và hun khói Những chủng E coli trong phân có xu hướng ñề kháng với

nhiệt cao hơn những chủng phân lập ñược ở môi trường bên ngoài Ở môi

trường bên ngoài, các chủng E coli gây bệnh có thể tồn tại ñến 4 tháng

(Gross W G., 1994)

1.3.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli ñược chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc

kháng nguyên O, K, H và F Cho ñến nay, các nhà nghiên cứu ñã xác ñịnh ñược 166 loại kháng nguyên O, 103 loại kháng nguyên K, 56 loại kháng nguyên H và một số quyết ñịnh kháng nguyên F (Fairbrother và cs, 1992; Carter và cs, 1995)

1.3.5.1 Kháng nguyên O ( Somatic antigen)

Kháng nguyên O là yếu tố thể xoma của phospholipid – polysaccharide góp phần tạo nên màng ngoài lipopolysaccharide của vi khuẩn, rất ñộc, chỉ cần 1/20 mg kháng nguyên O cũng ñủ ñể giết chết chuột nhắt trắng sau 24 giờ Kháng nguyên O có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ, các chất cồn và axit HCl 1N

Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide của kháng nguyên O gồm 2 phần: phần polysaccharide nằm ngoài có nhóm hydro mang chức năng tạo ra tính ñặc trưng về serotyp, và phần polysaccharide ở bên trong không có nhóm hydro, có chức năng phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc Khi làm mất dần từng ñơn vị ñường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay ñổi vị trí ở các ñơn

vị này sẽ dẫn ñến thay ñổi ñộc lực của vi khuẩn Thành phần lipit trong kháng

nguyên có tác dụng quyết ñịnh ñộc tính của vi khuẩn E coli

Kháng nguyên O không phải là một kháng nguyên ñơn (single antigen)

mà gồm một số thành phần và thường ñược gọi là nhóm kháng nguyên O Các nhóm kháng nguyên O khác nhau có thể có một vài thành phần kháng nguyên chung, và do ñó có thể gây phản ứng chéo giữa các nhóm Phản ứng chéo với

các vi khuẩn khác cũng ñã ñược ghi nhận như với Shigella, Salmonella và Citrobacter (Winkle và cs, 1972)

1.3.5.2 Kháng nguyên H (Flagella antigen)

Các kháng nguyên H dựa trên các dạng khác nhau của lông roi - protein của cơ quan di chuyển Việc xác ñịnh kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả năng di ñộng của vi khuẩn ñược thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên môi trường bán cố thể Hầu hết các kháng nguyên H ñều có tính ñặc hiệu cao, ít hoặc không có phản ứng chéo Các chủng không di ñộng ñược ký hiệu

là NM (Non motile) hoặc H-

Kháng nguyên H là kháng nguyên có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O; kém chịu nhiệt, bị phá hủy trong cồn 50% và các enzyme tiêu hóa protein, không bị tác ñộng khi xử lý bằng formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông Do vậy, vi khuẩn có

khả năng di ñộng, khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không

di ñộng

Kháng nguyên H không có ñộc lực và cũng không có ý nghĩa trong ñáp ứng miễn dịch

1.3.5.3 Kháng nguyên K (Capsular antigen)

Thông thường, kháng nguyên K sử dụng ñể ñịnh typ E coli không gây

ngưng kết với kháng huyết thanh O tương ứng Việc xác ñịnh kháng nguyên

K dựa trên ñặc ñiểm hóa học của kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide Có 3 nhóm kháng nguyên K ñã ñược xác ñịnh là L, A và B; chúng khác nhau về ñặc tính kháng nguyên và khả năng kết hợp với kháng thể khi ở nhiệt ñộ khác nhau Kháng nguyên K nhóm B và L vô hoạt sau khi ñun ở 1000C trong 1 giờ, trong khi nhóm A sau 1 giờ nhưng ở 1210C Khả năng kết hợp với kháng thể của nhóm B không bị mất ñi sau khi ñun ở 1210 trong 1 giờ, trong khi nhóm L thì bị mất sau khi ở 1000C trong 1 giờ Việc xác ñịnh kháng nguyên K có thể tiến hành bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính hoặc trong ống nghiệm Nhưng hiện nay, kháng nguyên K ít ñược sử dụng, mà thường sử dụng kháng nguyên O:H

Một số nhà nghiên cứu cho rằng kháng nguyên K không có ý nghĩa về ñộc lực (Pourbakhsh và cs, 1997; McPeake và cs, 2005) Tuy nhiên, cũng ñã

có công trình nghiên cứu chứng minh kháng nguyên K có ý nghĩa về ñộc lực

vì chúng tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ Kháng nguyên K có tác dụng chống lại sự thực bào, gồm cả kháng bổ thể trong huyết thanh

Nói chung, các nghiên cứu ñều thống nhất về kháng nguyên K có hai chức năng sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết kháng nguyên O của vi khuẩn

+ Tạo ra hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại tác ñộng của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào cũng như các yếu tố phòng vệ khác của vật chủ

1.3.5.4 Kháng nguyên F (Fimbriae antigen)

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh ñều có khả năng sản sinh ra một

hoặc nhiều loại kháng nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính (Carter và cs, 1995) Kháng nguyên bám

dính giúp vi khuẩn E coli có thể bám vào các thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt tế

bào biểu mô ruột và lớp màng nhày, chống lại khả năng ñào thải vi khuẩn do

nhu ñộng ruột Kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli chính là các cấu

trúc pili (hay còn gọi là Fimbriae) có cấu trúc giống sợi lông, ngắn, thẳng, xuất phát từ một ñĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn Fimbriae có bản chất là protein, bao phủ trên bề mặt ngoài của tế bào vi khuẩn với số lượng từ 10 – 400/tế bào vi khuẩn

Trước khi cấu trúc hóa học của chúng ñược biết ñến, các kháng nguyên này ñược gọi là kháng nguyên K như K88 và K99 Tuy nhiên, ngày nay, chúng ñược gọi là những lông roi bám dính F4 và F5

1.4 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC)

Trong số E coli có khả năng gây tiêu chảy, VTEC ñược xem là một

nhóm quan trọng gây tiêu chảy có lẫn máu ở người (Levent Akkaya và cs, 2006)

1.4.1 Danh pháp

Mặc dù ñã ñược xác ñịnh là các chủng E coli có khả năng sản sinh ñộc

tố VT hoặc Shiga-like toxin và ñược phân loại là nhóm VTEC, nhưng danh pháp quốc tế của nhóm vi khuẩn này vẫn chưa ñược thống nhất SLTEC

(Shiga-like producing Escherichia coli) và STEC (Shiga producing Escherichia coli) là những tên gọi khác của VTEC

toxin-1.4.2 ðộc lực

Nhìn chung, ngoại ñộc tố VT ñược coi là yếu tố ñộc lực của VTEC Tuy nhiên, sự có mặt của riêng ñộc tố VT có thể không ñủ gây ra bệnh, những yếu tố ñược cho là ñộc lực khác có thể ñóng một vai trò nào ñó Người ta cho rằng một số yếu tố có liên quan ñến khả năng bám dính của VTEC với tế bào biểu mô ruột, gây nên bệnh tích A/E Trong những yếu tố này có plasmid 60-Mda, mã hóa cho lông roi bám dính – một loại protein màng ngoài (OMP – Outer membrane protein), có trọng lượng phân tử 94 kDa, có yếu tố intimin

do gen eae quy ñịnh tổng hợp

Trong số các yếu tố này, mới chỉ có VT ñược xác ñịnh rõ vai trò trong quá trình gây bệnh của VTEC

1.4.2.1 ðộc tố Verotoxin (VT)

Konowalchuk và cs (1977) ñã có một công trình nghiên cứu về ñộc tố

gây ñộc tế bào (cytotoxin) của E coli Các tác giả ñặt tên ñộc tố này là VT (Verotoxin) Vero là tế bào thận khỉ xanh châu Phi (Cercopithecus aethiops),

thường ñược dùng trong phòng thí nghiệm, ñặc biệt trong các nghiên cứu về virus học Theo Konowalchuk, có hai loại ñộc tố VT: VT1 và VT2 ðộc tố

VT1 giống ñộc tố của Shigella dysenteriae typ 1 về mọi phương diện, kể cả miễn dịch học Trong ñiều kiện in vitro, có thể dùng kháng ñộc tố Shiga ñể

trung hòa VT1 Vì thế, VT1 còn ñược gọi là ñộc tố giống ñộc tố Shiga like-toxin) ðộc tố VT2 không có liên quan gì về miễn dịch học với ñộc tố

(Shiga-của Shigella dysenteriae typ 1, nhưng cũng có khả năng gây ñộc tế bào như

VT1 Konowalchuk nhận thấy rằng một số chủng EPEC có khả năng tổng hợp ñộc tố VT1 và/hoặc VT2, vì những chủng này gây ñộc và làm biến dạng tế bào Vero ñơn lớp Tuy nhiên, phát hiện này chưa ñược chú ý ñến khi một vụ

dịch do E coli O157:H7 xảy ra ở Mỹ, và vi khuẩn này có khả năng sản sinh

VT

Trong một nghiên cứu ựộc lập khác, năm 1982, OỖBrien và cs phát hiện

một loại ựộc tố do E coli O26 sản sinh, gây ựộc cho tế bào Hela và bị trung

hòa bởi kháng huyết thanh kháng ựộc tố Shiga độc tố này ựược OỖBrien và

cs gọi là ựộc tố giống ựộc tố Shiga (Shiga Ờ like toxin, viết tắt là SLT) Nhóm

tác giả nhận thấy ựộc tố này giống ựộc tố E coli O157:H7 sản sinh Do ựó, cả

hai tên gọi SLT và VT ựều chỉ một loại ựộc tố

Tại hội nghị châu Á về bệnh tiêu chảy tại Bangkok năm 1985, các nhà

vi khuẩn học Sri Lanka khi trình bày kết quả nghiên cứu về các chủng EPEC

có nhận ựịnh rằng: Các chủng E coli có ựộc tố VT thường gây bệnh ở gia súc

(trâu, bò), nhưng không có vai trò gì quan trọng trong bệnh tiêu chảy ở người,

ắt nhất là ở vùng nhiệt ựới đông Nam Á

Trình tự nucleotit của gen chịu trách nhiệm sản sinh VT1 và trình tự axit amin ựã ựược xác ựịnh và so sánh với gen sản sinh ựộc tố Shiga Mặt khác, VT2 và các biến thể của nó có những ựặc ựiểm khác biệt với VT1 Mức

ựộ tương ựồng của trình tự nucleotit và axit amin của VT2 và VT1 khoảng 55 Ờ 60% Các loại VT2 hiện nay ựã xác ựịnh ựược gồm có VT2, VT2vha (VT2va), VT2vhb (VT2vb), VT2vp1 (VT2e) và VT2vp2

Schmidt và cs (1994) ựã mô tả gen tương tự VT2 ở Citrobacter freundii, ựược gọi là C freundii slt-IIcA và slt-IIcB Những gen này cũng ựã phân lập ựược từ Enterobacter cloacae Ờ vi khuẩn có liên quan ựến bệnh HUS

ở người Nhóm tác giả này cũng ựã báo cáo VT2 từ C freundii không ổn ựịnh

do ựộc tố mất hoạt tắnh, ựồng nghĩa với việc mất gen VT trong quá trình cấy

chuyển Các gen giống VT1 cũng ựã ựược phân lập từ Aeromonas spp từ

bệnh nhân bị tiêu chảy và từ môi trường, có khả năng gây ựộc ựối với tế bào Vero

Cấu trúc chung và cơ chế tác ựộng của các ựộc tố VT giống với ựộc tố Shiga Mỗi ựộc tố có cấu trúc gồm tiểu phần A Ờ B, 1 tiểu phần A (khoảng 33 kDa) và 5 tiểu phần B (khoảng 7,5 kDa) Tiểu phần A có hoạt tắnh của một enzyme, tác ựộng ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào, gồm có dung

giải protein và phá hủy liên kết disulfide Tiểu phần B mang vị trí tiếp xúc của phân tử ñộc tố với một receptor glycolipid trên màng tế bào

Stein và cs (1992) ñã xác ñịnh cấu trúc tinh thể của tiểu phần B của VT1 và nhận thấy nó giống với cấu trúc của tiểu phần B của ñộc tố LT ñược

sản sinh bởi hầu hết các chủng E coli VT là protein không chịu nhiệt, nhưng

khả năng chịu nhiệt của các loại VT khác nhau là khác nhau VT2e là kém chịu nhiệt nhất, mất hoạt tính hoàn toàn khi ở 650C trong 30 phút VT2d có khả năng chịu nhiệt cao nhất, không mất hoạt tính khi ở 750C trong 60 phút VT1 và VT2 là những ñộc tố có khả năng chịu nhiệt trung bình

Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), của VT2e là Globotetraosylceramide (Gb4) Gb3 là phức hợp trên màng tế bào nội mạc quản cầu thận Cấu trúc và số lượng những receptor ñặc hiệu ở những loài và

mô khác nhau tạo nên sự khác nhau về ñộ mẫn cảm của tế bào, mô hoặc cơ quan ñối với ñộc tố Tuy nhiên, nguyên nhân chính gây phá hủy thận trong bệnh tiêu chảy có liên quan ñến HUS vẫn chưa ñược làm rõ

Vì ái lực của VT1 ñối với Gb3 lớn hơn so với VT2, người ta cho rằng VT1 gắn với tế bào biểu mô ruột và gây phá hủy các tế bào này cũng như hệ thống mạch quản ở ruột, trong khi ñó, VT2 có ái lực nhỏ hơn với Gb3 do ñó khả năng vào ñược hệ thống tuần hoàn lớn hơn, theo máu ñến các cơ quan, có thể gây HUS hoặc TTP

Khi ñộc tố ñược gắn với receptor, tiểu phần A sẽ xâm nhập vào trong tế bào theo cơ chế ẩm bào, gây dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide,

từ ñó ức chế việc tổng hợp yếu tố kéo dài chuỗi gắn với ribosome của phân tử RNA vận chuyển Do ñó, về cơ bản, sự kéo dài chuỗi peptit bị ngừng lại, ức chế sự tổng hợp protein, dẫn tới giết chết tế bào ñích

Các nghiên cứu dịch tễ học trong thời gian gần ñây tại Mỹ và Anh ñều

ñã cho thấy việc nhiễm VTEC có thể sản sinh cả hai loại ñộc tố VT1 và VT2 hoặc chỉ VT2 gây ra các tình trạng bệnh phức tạp hơn so với khi nhiễm các chủng chỉ sản sinh VT1 Tesh và cs (1993) ñã so sánh khả năng gây ñộc của

những ñộc tố này trên chuột Họ phát hiện VT2 có liều LD50 thấp hơn gần 400 lần so với VT1 Hơn nữa, VT2 bền hơn với nhiệt ñộ và pH Hoạt tính sinh học

và khả năng gây ñộc thông thường của tất cả các ñộc tố VT (trừ khả năng gây ñộc tế bào Vero) ñều gây chết chuột và gây ñộc với tế bào ruột thỏ ðộc tính

của VT ñã ñược thí nghiệm trong ñiều kiện in vitro bằng phương pháp nhân

nhanh tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người Phương pháp sử dụng tế bào Vero ñể ño khả năng gây ñộc bằng cách tính toán số lượng tế bào bị diệt, rời

ra khỏi lớp tế bào ñơn lớp Một liều gây ñộc 50% tế bào ñòi hỏi khoảng 1 pg ñộc tố, gần tương ñương như giá trị CD50 của VT1 và VT2 ñối với tế bào Hela

Hình 1.1: Cơ chế tác ñộng của ñộc tố VT

Khả năng gây ñộc của từng loại VT cũng khác nhau Takeda (1995) ñã thống kê hoạt tính sinh học của các loại VT như sau:

Ghi chú : CD50 (ñơn vị tính): Liều gây ñộc 50% tế bào Vero

LD50 (ñơn vị tính): Liều gây chết 50% chuột thí nghiệm

1.4.2.2 Gen eae (giúp bám dính và xâm nhập)

Gen eae là một ñặc tính quan trọng của nhóm EPEC Gen này ñóng vai

trò quan trọng trong việc gắn tế bào vi khuẩn vào màng tế bào ruột, và gây nên bệnh tích ñặc trưng A/E (Attaching and Effacing – bám dính và xâm nhập) Một số vi khuẩn thuộc nhóm EHEC cũng gây ra bệnh tích này do

chúng có thể có gen eae Vị trí gắn của các tế bào vi khuẩn dẫn tới sự phá hủy

các lông rung và hệ xương của tế bào chủ Beebakhee và cs (1992) ñã giải

trình tự gen eae của serotyp O157:H7 và thấy có sự tương ñồng với gen này

của nhóm EPEC Các tác giả cũng khẳng ñịnh sự tương ñồng tới 50% với gen

eae của Yersinia pseudotuberculosis Tương tự, Yu và Kaper (1992) cho rằng gen eae có thể mã hóa cho một protein ngoài màng có trọng lượng phân tử 94 kDa (OMP) Tuy nhiên, Dytoc và cs (1993) khẳng ñịnh gen eae khác so với

gen mã hóa cho OMP (sử dụng phương pháp giải trình tự peptit và miễn dịch học) Các tác giả quan tâm ñến các yếu tố khác ñã xác ñịnh ñược ñộc tính hơn

là gen eae và plasmid 60 – Mda, như CL8 – 57JB, Cl8 – 106JB - là những

protein bị bất hoạt nếu có sự ñột biến của gen TnphoA Dytoc và cs (1993) ñã

có báo cáo về sự khác nhau của khả năng bám dính giữa serotyp O113:H21

(không có gen eae) và O157:H7 Allerberger và cs (1996) cũng ñã phân lập

ñược 2 chủng VTEC không thuộc nhóm O157:H7 và không mang gen eae từ

những trẻ em bị tiêu chảy xuất huyết Các tác giả cho rằng chúng có thể mang yếu tố bám dính khác mà chưa ñược xác ñịnh rõ

Một nghiên cứu về khả năng gây tiêu chảy của E coli O157:H7 sử

dụng lợn con làm ñộng vật gây nhiễm ñã ñược Donnenberg và cs tiến hành

năm 1993 Các tác giả cho rằng một sự ñột biến của gen eae ở chủng vi khuẩn này có thể hạn chế khả năng bám dính của vi khuẩn Hơn nữa, khi gen eae ở

các vi khuẩn thuộc nhóm EPEC hoặc EHEC ñược bộc lộ, khả năng bám dính

sẽ ñược phục hồi McKee và O’Brien (1996) ñã xác ñịnh ñược yếu tố intimin

– sản phẩm của gen eae Intimin là một protein ngoài màng, có trọng lượng phân tử 97 kDa, ñóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính của E coli

O157:H7 Kết luận này ñược khẳng ñịnh bằng phân tích cấu trúc – chức năng

của gen eae và bằng phương pháp chặn sự bám dính của vi khuẩn vào tế bào

HEp-2 sử dụng kháng huyết thanh ñặc hiệu của intimin

Louie và cs (1994) ñã tiến hành nghiên cứu gen eae ở VTEC phân lập

từ trâu bò bị tiêu chảy nặng và từ người bị HUS hoặc HC và ñã kết luận rằng

82% VTEC phân lập từ người và 59% phân lập từ trâu bò có mang gen eae Mainil và cs (1993) nhận thấy 75% các chủng E coli phân lập từ trâu bò bị tiêu chảy có mang gen eae là VTEC Sandhu và cs (1996) nghiên cứu về gen eae ở các chủng VTEC phân lập ñược từ trâu bò khỏe mạnh, kết quả cho thấy

35,2% số chủng VTEC có gen này và hầu hết ñều thuộc các nhóm kháng nguyên O chính Kết quả tương tự cũng ñược ghi nhận ở nghiên cứu của

Wieler và cs (1996) Cấu trúc gen eae ở E coli O157 ñược nghiên cứu bằng

phương pháp lai mẫu dò DNA Kết quả cho thấy tất cả các chủng VTEC

O157 ñều có phản ứng bắt cặp với mẫu dò gen eae Tuy nhiên, trong 129 E coli O157 không sản sinh VT, 10 chủng vẫn có phản ứng với mẫu dò gen eae

Beutin và cs (1994) ñã nghiên cứu các yếu tố ñộc lực của các chủng VTEC

phân lập ñược từ người Trong 54 chủng, 94% có gen eae Tuy nhiên, Schmidt và cs (1994) cho rằng không nên sử dụng mồi eae mà sử dụng mồi

VT ñể xác ñịnh VTEC Kết quả của nhóm tác giả này chỉ ra 2 trong 6 VTEC

không phản ứng với mồi eae, 3 trong 7 chủng E coli có gen eae không phản

ứng với mồi VT Các chủng VTEC phân lập ñược từ phân người và thực

phẩm có nguồn gốc ñộng vật ở Úc cũng có gen eae và kết quả này ñã ñược

công bố trong nghiên cứu của Paton và cs (1996) VTEC chủng O111:H- và O157:H- phân lập ñược từ bệnh nhân bị HUS và HC cũng dương tính với eae,

nhưng chủng O91, O123 và O128 phân lập ñược từ bệnh nhân HC cho kết

quả âm tính với eae Kết quả trên cho thấy vai trò của gen eae trong cơ chế

gây bệnh của vi khuẩn vẫn chưa ñược khẳng ñịnh một cách chắc chắn và cần thêm nhiều nghiên cứu nữa về yếu tố này

1.4.2.3 Plasmid 60 – Megadalton

Karch và cs (1987) là nhóm tác giả ñầu tiên quan sát và nghiên cứu về

plasmid 60 – Megadalton (Mda) ở E coli O157:H7 phân lập ñược từ bệnh

nhân bị HC và HUS Yếu tố ñộc lực này là một lông bám dính giúp vi khuẩn

gắn với tế bào ruột Henle 407 Mặc dù ñược phát hiện từ 13 trong 14 chủng E coli O157:H7 phân lập ñược nhưng vai trò của yếu tố này trong quá trình gây

bệnh chưa ñược làm rõ khi thí nghiệm với lợn con gây nhiễm Do ñó, mặc dù

có mặt ở các chủng E coli O157:H7, vai trò gây ñộc của yếu tố này vẫn chưa

ñược kết luận ñầy ñủ

1.4.2.4 ðộc tố gây xuất huyết ruột (Enterohaemolysin)

Một vài chủng có khả năng gây dung huyết ñã ñược xác ñịnh trong các

nhóm E coli khác nhau Gây xuất huyết ruột là một ñặc ñiểm ñiển hình của

nhóm EHEC Schmidt và cs (1994, 1995) cho biết hiện tượng xuất huyết ruột

là kết quả của sự có mặt của một loại protein – ñó là protein gây xuất huyết

ruột EHEC (EHEC Hly Ờ EHEC haemolysin protein) EHEC Ờ Hly ựược mã hóa bởi một plasmid lớn, liên quan tới dung huyết kiểu alpha

Schmidt và cs (1995) cũng ựã xây dựng phương pháp PCR ựể xác ựịnh EHEC Ờ hlyA Khoảng 90% VTEC có khả năng sản sinh ựộc tố này Hầu hết các chủng VTEC gây xuất huyết ruột (98,4%) phân lập ựược từ ựộng vật ựều

có trình tự DNA ựặc hiệu cho plasmid mã hóa ựộc tố xuất huyết ruột Có thể dùng thạch máu cừu có bổ sung canxi (WSBA-Ca: Wash sheep blood agar with Calcium) ựể xác ựịnh yếu tố này Sau 4 giờ nuôi cấy, nếu quan sát thấy hiện tượng dung huyết là dung huyết kiểu alpha; còn nếu ựể qua ựêm mới quan sát thấy hiện tượng dung huyết thì chỉ chứng tỏ sự có mặt của ựộc tố xuất huyết ruột Do có sự liên quan chặt chẽ giữa sự sản sinh VT và ựộc tố gây xuất huyết ruột nên sự biểu hiện của ựộc tố này là một ựặc ựiểm tốt cho việc xác ựịnh nhanh và ựơn giản các chủng VTEC Sự tồn tại của EHEC Ờ Hly ở EHEC là một ựặc ựiểm quan trọng vì nó có ở mọi chủng O157 phân lập ựược từ bệnh nhân HUS và từ mọi chủng VTEC phân lập ựược từ trẻ em bị

HC

1.4.3 Vai trò của VTEC không thuộc nhóm O157

Mặc dù các triệu chứng của các bệnh nghiêm trọng ở người như HC và HUS hầu hết ựều liên quan ựến các chủng O157 (Beutin và cs, 1994), nhưng vẫn có một số trường hợp bệnh lẻ tẻ do các chủng không thuộc nhóm O157 gây ra

Có hơn 30 nhóm kháng nguyên O hoặc 100 serotyp O:H khác nhau ựược cho là có liên quan tới một số ca bệnh HUS và HC ở người đó là các nhóm O1, O2, O4, O5, O6, O18, O22, O23, O25, O26, O38, O39, O45, O48, O50, O55, O73, O75, O82, O84, O91, O100, O103, O104, O111, O113, O114, O115, O117, O118, O119, O121, O125, O126, O128ab, O132, O145, O146, O153, O163, O165, O166 và một số chủng chưa ựược ựịnh typ khác

Các VTEC khác không thuộc nhóm O157 nên ñược chú ý hơn ở một số quốc gia Ví dụ nguyên nhân thường gặp của HUS là các chủng không thuộc nhóm O157 như O104:H2 ở Pháp, O111:H- ở Úc Trước ñây, ñã có một sự nhầm lẫn

khi cho rằng chỉ những chủng E coli O157 không lên men sorbitol mới thuộc

nhóm EHEC, do ñó ñã có rất nhiều chủng EHEC quan trọng bị bỏ qua Có rất nhiều chủng EHEC phân lập ñược từ các trẻ em bị HUS như O6:H31, O26:H11, O91:H10, O98:H-, O111:H-, O111:H12, O146:H8, O157:H-,… (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan, 1997)

Cũng ñã có một số báo cáo về các vụ dịch do VTEC không thuộc nhóm O157 gây ra Năm 1992, ở Italia, O111:H- ñã gây ra nhiều ca bệnh HUS Ở

Úc, báo cáo ca bệnh HUS ñầu tiên do VTEC gây ra là vào năm 1987 Kiểm

tra mẫu phân, các bác sỹ ñã phân lập ñược chủng E coli O111:H2 Năm

1990, Pryor và cs phân lập ñược O111 từ các bệnh nhân bị HUS, mà trong ñó không sử dụng phương pháp phân lập các chủng O157 không lên men sorbitol Năm 1996, ở Úc, Paton và cs kết luận chủng O111:H- là nguyên nhân gây ra một vụ dịch HUS ở Adelaide, Nam Úc, liên quan tới việc sử dụng sốt lên men Các chủng vi khuẩn này ñã gây chết một người, 23 trẻ em phải nhập viện và 18 trẻ em bị HUS Chủng vi khuẩn này ñã ñược phân lập từ mẫu phân của 18 trong số 23 bệnh nhân và từ 4 trong 5 mẫu sốt Do ñó, chủng O111 trở thành nguyên nhân gây HC và HUS chủ yếu ở Úc Ở ðức, chủng O111:H- là chủng không thuộc nhóm O157 thường gặp nhất liên quan tới HUS ở trẻ em

Có một số chủng E coli không thuộc nhóm O157, không lên men

ñường sorbitol, là nguyên nhân gây HUS, như O104:H21 ở Montana (Mỹ) Ở

ðức, từ 1988 – 1989, từ 91% bệnh nhân HUS ñã phân lập ñược E coli O157

Tuy nhiên, năm 1994, một số chủng khác phân lập ñược thường xuyên hơn chủng O157 ðiều này ñưa ra một gợi ý về sự dịch chuyển về dịch tễ học

hướng về các chủng khác hơn là O157 và có thể xảy ra ở các quốc gia khác nhau Ở Úc, tỷ lệ phân lập O157 và các chủng khác ở trẻ em là tương ñương nhau Các chủng O157:H- lên men sorbitol cũng ñã ñược phân lập từ 21 bệnh nhân HUS ở ðức năm 1988 Ngoài ra, kiểu gen và kiểu hình của chúng giống với các chủng O157:H7 lên men sorbitol Ở Canada, VTEC O26:H11 là chủng phổ biến thứ hai sau O157:H7 Serotyp này thường gặp ở trâu bò, bê bị tiêu chảy và ñã ñược báo cáo ở nhiều nước trên thế giới, nhưng không nhiều ở Nhật Bản, Anh, Argentina Ở người, VTEC O26:H11 gây một vài trường hợp bệnh riêng lẻ và một số ca bệnh tiêu chảy, HC và HUS (Laiking và cs, 2005) Nhiều chủng không thuộc nhóm O157 có nhiều yếu tố ñộc lực như sản

sinh ñộc tố VT, gen eae, plasmid EHEC và ñộc tố gây xuất huyết ruột, do

vậy, chúng ñược xếp vào nhóm EHEC Tuy nhiên, nhiều vi khuẩn thuộc nhóm EHEC thiếu một hoặc nhiều yếu tố ñộc lực nhưng vẫn gây HUS và HC Liều gây nhiễm của các chủng không thuộc nhóm O157 cũng tương ñương với chủng thuộc nhóm O157 Có thể chỉ với một số lượng rất nhỏ, dưới 10 vi khuẩn cũng có thể gây ra những bệnh trầm trọng ở người mẫn cảm Do ñó, các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 gây bệnh HUS và HC ở người cũng cần ñược chú ý như VTEC O157

1.4.4 VTEC ở ñộng vật

Carlton (2004) cho rằng tỷ lệ VTEC ở ñộng vật dao ñộng khoảng 6% - 100% Các nghiên cứu ñều cho thấy hầu hết các ñàn gia súc ñều có O157 cũng như các VTEC khác nhưng hiện có ít thông tin về các yếu tố ảnh hưởng tới sự thải VTEC ra ngoài môi trường của ñộng vật

1.4.4.1 VTEC O157 ở ñộng vật

Thông thường, E coli O157 có thể ñược tìm thấy trong ñường tiêu hóa

của một số loài như trâu bò, cừu, gia cầm, trong ñó trâu bò ñóng vai trò là nguồn tàng trữ chính (Levent Akkaya và cs, 2006)

Trên thế giới, ñặc biệt ở Mỹ, ñã có nhiều nghiên cứu về E coli

O157:H7 ở vật nuôi, thường trên trâu bò Hancock và cs (1994) thấy rằng chỉ

có 10 trong 3570 (0,28%) mẫu phân bò sữa và 10 trong 1412 (0,71%) mẫu

phân bò thịt có chứa E coli O157:H7 Zhao và cs (1995) ñã tiến hành xác ñịnh sự tồn tại của E coli O157:H7 trên bê ở các ñàn bò sữa Nhóm nghiên cứu ñã sử dụng các ñàn bò trước ñó ñã phân lập ñược E coli O157:H7 làm

ñàn thí nghiệm, ở các ñàn này tỷ lệ dương tính với vi khuẩn cao hơn so với ñàn ñối chứng (50% và 22%) Tương tự, tỷ lệ phân lập phụ thuộc vào lứa tuổi của ñộng vật Tuy nhiên, không có sự khác nhau về lứa tuổi giữa ñàn ñối

chứng và ñàn thí nghiệm Bê sau cai sữa 4 tháng thường bài thải E coli

O157:H7 theo phân, với tỷ lệ phân lập từ các mẫu phân ở ñàn thí nghiệm là

5,3% và 4,9% ở ñàn ñối chứng E coli O157:H7 phân lập ñược từ những bê

trong ñộ tuổi từ 24 giờ sau khi sinh ñến cai sữa là 1,5% ở ñàn ñối chứng và 2,9% ở ñàn thí nghiệm Một nghiên cứu bệnh chứng của Garber và cs (1995)

cũng cho kết quả tương tự Họ nhận thấy E coli O157:H7 phân lập ñược ở

các bê nuôi lấy sữa thường là những bê sau cai sữa (4,8%) hơn là trước cai sữa (1,4%) Trong một nghiên cứu khác, Faith và cs (1996) ñưa ra kết luận tỷ

lệ E coli O157:H7 ở ñàn bò sữa là 7% và ở các ñộng vật khác là 1,8% Hơn nữa, các tác giả này cũng kết luận rằng: bò cái tơ và trâu là nguồn tàng trữ E coli O157:H7 quan trọng giống như bê Ở Anh, Mechie và cs (1997) nghiên cứu tỷ lệ E coli O157:H7 ở một ñàn bò sữa ñã dương tính với vi khuẩn này

trước ñó trong một thời gian khoảng 15 tháng Tỷ lệ vi khuẩn này là 0% vào mùa ñông và ñạt cao nhất là 14% ở bò ñang tiết sữa, 40% ở bò cạn sữa, 56%

ở bê và 68% ở bò cái tơ vào ñầu mùa hè Kết quả tương tự cũng thu ñược khi

nghiên cứu trên cừu và trên bò thịt Kudva và cs (1997) thấy tỷ lệ E coli

O157:H7 ở cừu trong khoảng từ 0% (vào mùa ñông) ñến 30% (vào mùa hè)

Các kết quả trên cho thấy tỷ lệ E coli O157:H7 ở bò và cừu có ý nghĩa quan

trọng và phụ thuộc vào mùa trong năm

E coli O157:H7 không gây bệnh cho bê từ 3 tuần tuổi trở lên Tính gây

bệnh của vi khuẩn có liên quan ñến tuổi, bê ở giai ñoạn dưới 36 giờ sau khi

sinh bị gây nhiễm E coli O157:H7 ở giai ñoạn 18 giờ sau khi sinh thấy có

biểu hiện tiêu chảy, viêm ruột, có bệnh tích A/E ở cả ruột non và ruột già

Không có bằng chứng cho thấy E coli O157:H7 không gây bệnh ở bê ñã cai

sữa

Một số thí nghiệm khác cho thấy E coli O157:H7 không gây bệnh cho

bê Vi khuẩn không phát triển ở niêm mạc ñường tiêu hóa, nhưng có thể tồn tại trong chất chứa dạ cỏ và kết tràng, có thể phát hiện theo từng ñợt trong phân trong một thời gian dài Rasmussen và cs (1993) nhận thấy chất chứa dạ

cỏ ñặc biệt ở những trâu bò lớn nhanh là một nguồn chứa E coli O157:H7

Hơn nữa, vi khuẩn này có khả năng tồn tại một thời gian ngoài ñường tiêu hóa

có thể là một nguyên nhân gây ra các vụ dịch liên quan ñến sử dụng rau ñược bón phân trâu bò Tương tự, các hoạt ñộng sống của ñộng vật và việc sử dụng chung nước uống, thức ăn trong chuồng cũng có thể có tác ñộng làm lây lan

vi khuẩn trong ñàn Nước uống bị nhiễm vi khuẩn còn là một nguồn tàng trữ

và lan truyền E coli O157:H7

Khi nghiên cứu về E coli O157:H7 trên thịt gà ở Thổ Nhĩ Kỳ, Levent

Akkaya và cs (2006) cho rằng vi khuẩn này có trong ñường ruột của gà và

ñược thải ra ngoài theo phân trong vài tháng Sau ñó, từ những gà này, E coli

O157:H7 có thể nhiễm chéo sang các gà hoặc thịt gà trong quá trình vận chuyển và/hoặc quá trình giết mổ; bằng chứng là tỷ lệ dương tính 1,05% trong

số 190 mẫu thịt gà ñược kiểm tra trong nghiên cứu Việc phân lập ñược E coli O157:H7 trên thịt gà cho thấy gà nói riêng và gia cầm nói chung có thể là

một nguồn tàng trữ khác, dễ dàng lây nhiễm sang người nếu không có các biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt

1.4.4.2 VTEC không thuộc nhóm O157 ở ñộng vật

Có nhiều nghiên cứu về VTEC ở ñộng vật ñã ñược tiến hành Cray và

cs (1996) ñưa ra tỷ lệ 5,9% của 1305 chủng E coli phân lập ñược từ phân của

bò cái tơ là VTEC Ở ðức, Beutin và cs (1993) ñã nghiên cứu về VTEC ở 7 loài khác nhau VTEC phân lập ñược từ cừu (66,6%) cao hơn từ dê (56,1%)

và trâu bò (21,1%), thấp hơn nữa là ở lợn (7,5%), mèo (13,8%) và chó (4,8%) Không phân lập ñược chủng nào từ gà Ở Tây Ban Nha, phân lập ñược VTEC từ 35% bò khỏe mạnh và 37% bê khỏe mạnh Ở Canada, VTEC thường phân lập ñược ở bê nuôi lấy sữa (24,7%) hơn là từ bò sữa trưởng thành (9,5%) Ở Italia, VTEC phân lập ñược từ 18,3% bê nuôi lấy sữa và 7,8% lợn

Một nghiên cứu về tỷ lệ VTEC từ các chủng E coli phân lập ñược từ vật nuôi bị bệnh ở Mỹ chỉ ra rằng 2,8% các chủng E coli phân lập từ bò,

6,1% từ cừu, 4% từ lợn là VTEC Ở Tây Ban Nha, VTEC thường phân lập ñược từ bê bị tiêu chảy (20,5%) Nghiên cứu này cũng cho biết các chủng khác không thuộc nhóm O157 có tỷ lệ phân lập trội hơn ở cả trâu bò bị tiêu chảy và khỏe mạnh Hơn nữa, trong 126 chủng VTEC phân lập ñược có 27 nhóm kháng nguyên O khác nhau ñã ñược xác ñịnh; trong khi ñó con số này ở ðức là 16 nhóm (trong 28 chủng) Tuy nhiên, ở Mỹ, Cray và cs (1996) chỉ thấy 18 nhóm kháng nguyên O khác nhau trong 77 chủng VTEC phân lập từ phân bò cái tơ

60% các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 phân lập từ trâu bò có khả năng gây bệnh cho người, ñặc biệt các bệnh nặng như HC và HUS Montenegro và cs (1990) cho rằng tỷ lệ này chỉ khoảng 40% trong khi Blanco

và cs cho rằng tỷ lệ này thay ñổi từ 45% vào năm 1994 ñến 60% năm 1997

Beutin và cs (1993) thấy rằng 60% VTEC phân lập từ 7 loài vật nuôi khỏe mạnh có khả năng gây bệnh cho người Hiện nay, VTEC O26 thường phân lập ñược từ trâu bò và có các ñặc tính giống với các chủng phân lập ñược ở người (Wieler và cs, 1996), mặc dù, vẫn chưa có bằng chứng cụ thể rằng các chủng O26 có nguồn gốc từ trâu bò gây bệnh cho người (Jenkins và cs, 2003) Nhóm vi khuẩn này ñã ñược cảnh báo là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở người

và ñược cho có liên quan tới một vụ dịch lớn ở Ireland (McMaster và cs, 2001)

Một nghiên cứu về các yếu tố ñộc lực của VTEC trên ñộng vật cho thấy 57% VTEC có gen VT1, 28% có gen VT2 và 15% có cả 2 gen Blanco

và cs (1996) cho rằng 10% số VTEC phân lập ñược có mang gen gây bệnh tích A/E

1.4.5 VTEC trong thực phẩm

Có nhiều vụ dịch do VTEC ñã xảy ra ở một số quốc gia, trong ñó nguyên nhân chính là do sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm, chủ yếu là các thực phẩm có nguồn gốc từ bò Sử dụng bánh hamburger nhân thịt bò là nguyên nhân chính gây ra các vụ dịch ở Anh, Mỹ và Canada, ngoài ra, còn có một vài

vụ dịch liên quan ñến sữa và các sản phẩm từ sữa, như sữa tươi, sữa chua, nước táo chưa tiệt trùng EHEC ñã ñược khẳng ñịnh là nguyên nhân gây bệnh trong một vụ dịch có liên quan ñến nước uống Các vụ dịch thường xảy ra ở những nơi công cộng, trung tâm chăm sóc sức khỏe, trường học, Chế biến thực phẩm không ñúng cách như nhiệt ñộ nấu thức ăn chưa ñảm bảo, nhiễm

từ các dụng cụ sử dụng chế biến thực phẩm tươi và thực phẩm ñã nấu chín là

coli O157:H7 có trong 6% mẫu thịt bò, 4% thịt gà, 4% thịt cừu và 6% mẫu

sữa

Ở Mỹ, Willshaw và cs (1993) phát hiện 17% mẫu thịt bò tươi có VTEC VTEC cũng ñược phân lập ở Canada từ thịt bò (10,4%) và thịt lợn (3,8%) Samadpour và cs (1994) sử dụng mồi của gen VT ñể xác ñịnh sự có mặt của VTEC trong các thực phẩm bán trên thị trường ở Seattle, Washington Kết quả là 23% mẫu thịt bò, 18% mẫu thịt lợn, 48% mẫu thịt cừu, 12% mẫu thịt gà, 7% thịt gà tây, 10% cá, 5% sứa có kết quả dương tính, tuy nhiên, chỉ thu ñược VTEC từ 12 (23,5%) mẫu có phản ứng dương tính với gen VT

Mặt khác, liều gây nhiễm của VTEC O157 rất thấp Bolton và cs (1996) báo cáo rằng từ liều rất thấp như 0,3 ñến 2300 CFU/g ñã phân lập ñược từ các mẫu thực phẩm có liên quan tới các ca tiêu chảy ở người Chỉ cần

1 VTEC trong 10 g nước sốt lên men cũng có thể gây HUS Liều gây nhiễm thấp là một lợi thế vì chủng vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường axit

Benjamin và Datta (1995) ñã cho thấy E coli O157:H7 tồn tại trong môi

trường axit, pH 3,0 và 2,5 trong ít nhất 5 giờ ở 370C Khả năng kháng axit của

vi khuẩn này giống Shigella flexneri, Buchanan và Edelson (1996) cũng ñã

quan sát khả năng kháng axit của vi khuẩn này trong ñiều kiện có hoặc không

có glucose

Khả năng tồn tại của VTEC O157:H7 và ñộc tố trong thực phẩm ñã ñược nghiên cứu VT1 ñược vi khuẩn sản sinh trong thịt bò xay nhiều hơn trong sữa, hơn nữa, ñiều kiện bao gói, bảo quản thông thường dường như không ảnh hưởng tới việc sản sinh VT1

1.4.6 Nhiễm VTEC ở người

Kể từ khi ñược phân lập lần ñầu tiên trong một vụ dịch tiêu chảy lớn ở

người vào năm 1982, E coli O157:H7 ñã ñược tìm thấy trong hàng trăm ca

bệnh riêng lẻ cũng như trong các vụ dịch lớn ở hơn 30 quốc gia trên thế giới

Do vi khuẩn này có liều gây nhiễm thấp, cộng với khả năng gây các trường

hợp bệnh nguy hiểm và phức tạp, E coli O157:H7 ñược xem như một vấn ñề

ảnh hưởng nghiêm trọng ñối với sức khỏe cộng ñồng Hầu hết các vụ dịch ở người ñều có liên quan tới thức ăn và/hoặc nước uống (Levent Akkaya và cs, 2006); tuy cũng có một số bằng chứng cho thấy một số trường hợp truyền từ người sang người, và truyền từ ñộng vật sang người (Hanna Eveline Sidjabat-Tambunan, 1997)

VTEC, ñặc biệt chủng O157:H7 ñược khẳng ñịnh có khả năng gây một

số bệnh nghiêm trọng ở người, thường gây chết Trẻ em, người già và người suy giảm miễn dịch là những ñối tượng dễ bị nhiễm nhất

ðặc biệt, hầu hết các trường hợp nhiễm VTEC ñều xảy ra vào mùa hè :

64 – 81,7% trường hợp nhiễm VTEC vào mùa hè ở Alberta, Canada và Scotland Tương tự, ở Italia, giai ñoạn từ tháng 3 ñến tháng 10 năm 1993,

Tozzi và cs (1994) ñã ghi nhận một vụ dịch HUS xảy ra trên 14 trẻ em do E coli O157 và/hoặc O111 Ở Úc, trong 49 ca HUS ñược báo cáo trong năm

1994 – 1995 có 38 ca xảy ra vào những tháng hè (tháng 12/1994 ñến tháng 2/1995), nhưng chỉ có 5 trong 14 mẫu phân ñược kiểm tra dương tính với VTEC

Ở Anh, các chủng VTEC O157:H7 và O157:H- (không di ñộng) là các chủng thường gặp nhất trong số các trường hợp bệnh ở người (Willshaw và

cs, 2001) Số bệnh nhân bị HUS chiếm 12% các ca nhiễm VTEC và tỷ lệ chết

là 4%

Ở Mỹ, tỷ lệ người bị tiêu chảy lẫn máu, sau ñó tiến triển thành HUS

hoặc TTP là 3,6%; tỷ lệ chết là 1,9% Trong một vụ dịch do E coli O157:H7

ở Nhật Bản, 33% trẻ em bị nhiễm tiến triển thành HUS, 50% trẻ em bị tiêu

chảy và không có biểu hiện triệu chứng khác Trong một nghiên cứu ở Tây

Úc, tỷ lệ người bị suy thận mãn và chết lần lượt là 20% và 9,7%

Nhiễm các chủng VTEC thuộc các nhóm kháng nguyên O khác như O26, O103, O111 và O145 ngày càng ñược phát hiện nhiều hơn ở các quốc gia khác nhau (Jenkins và cs, 2003) Cũng trong nghiên cứu này, các tác giả nhận thấy VTEC O145 ñược tìm thấy nhiều nhất ở nhóm các bệnh nhân bị HUS Và ở nhóm bệnh nhân bị tiêu chảy nhưng không bị tiến triển thành HUS thì O26 là nhóm ñược tìm thấy nhiều hơn cả (trừ nhóm O157)

Gần ñây nhất, tháng 6 năm 2011, một ñợt dịch do E coli ñã bùng phát

tại ðức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác WHO cho biết, trên phạm vi toàn thế giới có hơn 1270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở ðức và 1 ở Thụy ðiển Nguyên nhân của ñợt dịch ñược xác ñịnh là do rau quả bị nhiễm

E coli O104 Vụ dịch này ñã gây tổn thất nặng nề tới các nền kinh tế thuộc

liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại ñây thất thu

200 triệu euro (tương ñương 290 triệu USD) Cũng trong thời gian này, tại

Nhật Bản, ít nhất 20 người ñã bị nhiễm vi khuẩn E.coli sau khi ăn tại một nhà

hàng ñồ nướng kiểu Hàn Quốc tại thủ ñô Tokyo Trong ñó 15 người bị nhiễm

E coli O157 Nguyên nhân của các ca bệnh này là do họ ñã sử dụng ñũa nấu

thịt sống ñể ăn

1.4.7 Phương pháp phát hiện VTEC trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm

Có thể chia các phương pháp phát hiện VTEC thành 3 nhóm :

- Phương pháp vi sinh vật

- Phương pháp miễn dịch học

- Phương pháp sinh học phân tử

1.4.7.1 Phương pháp vi sinh vật

Phương pháp phân lập trực tiếp VTEC thông qua nuôi cấy mẫu bệnh phẩm hoặc thực phẩm vẫn chưa ñược thiết lập, ngoại trừ nhóm O157 vì nó có những ñặc ñiểm sinh hóa riêng, phân biệt với các chủng khác Các môi trường thạch chọn lọc, dựa trên hiện tượng không lên men sorbitol của O157 hoặc không có beta-glucuronidase hoạt hóa Môi trường chọn lọc là môi trường ñược bổ sung thêm Cefixime và Rhamnose Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy trực tiếp nhằm phân lập nhanh VTEC dựa trên hiện tượng dung huyết ñã ñược báo cáo Phương pháp này có ñộ chính xác cao vì 90% VTEC ñược kiểm tra ñều gây dung huyết

Hiện nay, ñã có một số loại môi trường bồi dưỡng cho phép VTEC nhân lên ñạt tới số lượng có thể phát hiện ñược như m-TSB (modified Trypticase Soy Broth) có bổ sung thêm Novobiocin hoặc Acriflavine ñể làm giảm sự phát triển của các vi sinh vật Gram âm khác ñã ñược sử dụng tốt Một môi trường khác là BPW (Buffered Pepton Water) có bổ sung Vancomycin,

Cefsulodin và Cefixime giúp hạn chế sự phát triển của Aeromonas spp

Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp sốc nhiệt hoặc sốc lạnh thì phân lập ñược nhiều VTEC O157:H7 từ môi trường thạch TSA thông thường hơn

là từ môi trường SMAC (Sorbitol MacConkey agar) (Hanna Evelina Tambunan, 1997)

Sidjabat-Nhiệt ñộ nuôi cấy cũng có vai trò ñáng kể vì VTEC O157 trong môi trường TSB phát triển nhanh ở nhiệt ñộ từ 30 – 420C, mọc kém ở 44 – 450C, không mọc ở 100C hoặc 45,50C trong 48 giờ Do ñó, nuôi cấy mẫu phân bằng các phương pháp thông thường ở 44,50C sẽ không phân lập ñược E coli

O157:H7 Quá trình bồi dưỡng có thể sử dụng phương pháp miễn dịch hoặc sinh học phân tử ñể xác ñịnh VTEC

1.4.7.2 Phương pháp miễn dịch học

đã có một số phương pháp miễn dịch ựể phân lập VTEC như ELISA, kháng thể ựơn dòng, miễn dịch huỳnh quang,Ầ Trên thị trường cũng ựã có bán các bộ kit như EHEC-Tek dựa trên hệ thống enzyme miễn dịch, ELISA

test kit cho phương pháp ELISA, Dynabeads ant-E coli O157,Ầ

độ nhạy và ựặc hiệu của phương pháp ELISA dựa trên kháng thể ựơn dòng sử dụng trong xác ựịnh VTEC ở phân gia súc lần lượt là 80,5% và 91,2% Phương pháp ELISA cũng ựược sử dụng ựể xác ựịnh và tách ựộc tố

VT Acheson và cs (1990) sử dụng dịch nang sán Echinococcus granulosus

trên 1 con cừu bị nhiễm ựể thu ựộc tố độc tố VT gắn với α-galp (1-4) galp có thành phần glycolipid Chất này có trong các nang sán giống như glycoprotein (P1gp) với 1 ựầu α-D-galp (1-4)D-galp disaccharide Phương pháp này có thể xác ựịnh ựược ựộc tố VT1 với lượng tối thiểu 80 pg/giếng và

D-132 pg/giếng ựối với VT2

1.4.7.3 Phương pháp sinh học phân tử

Có nhiều phương pháp ựã ựược nghiên cứu và thắ nghiệm thành công, trong phạm vi báo cáo này, chúng tôi chỉ ựề cập tới kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)

Sự ra ựời của kỹ thuật PCR ựã ựưa lại một cuộc cách mạng trong việc nghiên cứu, phân tắch gen và hệ gen Trước ựây, khó khăn lớn nhất trong việc phân tắch gen nằm ở chỗ chúng là những ựơn vị rất nhỏ, số lượng ắt trong hệ gen phức tạp và khổng lồ Kỹ thuật PCR ra ựời ựã thay ựổi tất cả, giúp chúng

ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một ựoạn DNA mong muốn Một trong những ứng dụng của kỹ thuật PCR là có thể dùng ựể ựịnh danh chắnh xác vi khuẩn đây là phương pháp nhanh, ựặc hiệu, nhạy và tự ựộng trong việc xác ựịnh các mầm bệnh là vi sinh vật

Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào, trong ñó DNA ñược nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Thành phần của PCR là: ñoạn DNA ñích, cặp mồi có trình tự bổ sung với DNA ñích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA-polymerase phù hợp

Quá trình khuyếch ñại là một sự lặp lại các chu kỳ của tăng và giảm nhiệt ñộ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: dãn xoắn sợi DNA kép, các mồi bắt cặp với từng sợi DNA ñơn, tổng hợp sợi DNA mới nhờ DNA-polymerase Theo

ñó, số lượng DNA tạo ra tăng lên 2n với n là số chu kỳ

Kỹ thuật PCR ban ñầu sử dụng ñoạn Klenow nhạy cảm với nhiệt ñộ

của Escherichia coli DNA polymerase Saiki và cs (1987) là những người ñầu

tiên sử dụng DNA polymerase bền với nhiệt ñộ có nguồn gốc từ vi khuẩn

Thermus aquaticus (Taq) do enzyme này không bị phân hủy ở 950C Sự cải tiến này không chỉ ñơn giản hóa phương pháp mà còn cho phép nó hoạt ñộng

tự ñộng và giảm nguy cơ tạp nhiễm Sản phẩm của PCR có thể kiểm tra dễ dàng bằng phương pháp ñiện di và nhuộm Ethidium bromide (EtBr)

Nhiều tác giả ñã sử dụng thành công phương pháp này trong xác ñịnh gen VT của VTEC Trong một số trường hợp, các phương pháp như xác ñịnh ñộc tố trong mẫu phân sử dụng tế bào Vero hoặc ELISA không sử dụng ñược

do số lượng VTEC trong các mẫu rất thấp và gen VT thường bị mất ñi trong quá trình xử lý mẫu Phương pháp PCR xác ñịnh gen VT có thể phát hiện ñược dưới 10 VTEC trong tổng 109 coliform và là một phương pháp phù hợp

ñể phát hiện VTEC trong mẫu phân hoặc mẫu thực phẩm nghi ngờ

Theo nguyên lý ban ñầu, mỗi phản ứng PCR sẽ ñược thực hiện với sự tham gia của một cặp mồi ñặc hiệu Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, việc tiến hành nhiều phản ứng PCR sẽ mất khá nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ gây tốn kém (Lê Thị Tuyết Trinh, 2007) ðể giảm số lượng phản ứng PCR

cần thiết và sàng lọc gen ñộc tố của các loại E coli, nhiều tác giả ñã cải tiến