Đề tài phân lập và tuyển chọn nấm mốc phân giải cellulose

Trong đó, nấm mốc được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: sản xuất rượu, tương, nước chấm, các kháng sinh như: penicillin… Đặc biệt, nhiều nấm mốc có khả năng tạo ra các enzyme

LỜI MỞ ĐẦU

Các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men… có rất nhiều ích lợi đối với con người Trong đó, nấm mốc được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: sản xuất rượu, tương, nước chấm, các kháng sinh (như: penicillin)… Đặc biệt, nhiều nấm mốc có khả năng tạo ra các enzyme để phân hủy các cơ chất trong tự nhiên, là đối tượng để nghiên cứu sản xuất các enzyme như: cellulase, amylase, protease…

Trong tự nhiên, nấm mốc hiện diện ở rất nhiều nơi, chúng phát triển rất nhanh trong điều kiện khí hậu nóng ẩm ở nước ta Trên các thực vật bị mục nát như: gỗ mục, rơm mục… chứa rất nhiều chủng nấm mốc có khả năng tạo

ra enzyme cellulase để phân hủy cellulose Đề tài nghiên cứu này tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân hủy cellulose

từ các mẫu gỗ mục và rơm mục thu được trong tự nhiên, nhằm ứng dụng thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và trong nhiều lĩnh vực khác phục vụ đời sống con người

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm của nấm mốc: [1]

Nấm mốc còn gọi là nấm sợi Chúng thường hiện diện trên thực phẩm, quần áo, giày dép, sách vở… Nấm mốc phát triển rất nhanh trên nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm Nấm mốc cũng phát triển trên các thiết bị làm bằng vật liệu vô cơ như: thấu kính ở ống nhòm, máy ảnh, kính hiển vi…

Một số nấm mốc có khả năng sống ký sinh trên người, động vật và thực vật và gây ra các bệnh về nấm khá nguy hiểm Ngoài ra, một số nấm sợi có thể sản sinh các độc tố nấm có khả năng gây bệnh ung thư và các bệnh khác

Trong tự nhiên, nấm mốc phân bố rất rộng rãi Chúng tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân hủy các chất hữu cơ

và hình thành chất mùn

1.1.1 Hình thái và cấu trúc của sợi nấm:

Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp hình nón, không tăng trưởng và có tác dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nấm Trong sợi nấm chứa chất nguyên sinh, nhân, các bào quan, các enzyme…

Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty Khuẩn ty có vách ngăn hay không có vách ngăn Ở một số loài nấm mốc, khuẩn ty không có vách ngăn, tế bào sợi nấm thường chứa nhiều nhân, được gọi là các tế bào đa nhân Đối với các nấm mốc có vách ngăn ở khuẩn ty, người ta thường thấy tế bào sợi nấm chứa 1 nhân, 2 nhân, nhiều nhân hoặc chẳng có nhân nào do sự di chuyển của nhân trong khuẩn ty

Khi bào tử nấm mốc rơi vào điều kiện môi trường thích hợp, chúng sẽ nảy mầm thành hệ sợi nấm Trong hệ sợi nấm có 2 loại khuẩn ty: khuẩn ty dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất) và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty dinh dưỡng cắm sâu vào môi trường dinh dưỡng, còn khuẩn ty khí sinh phát triển tự do trong không khí

Hệ sợi nấm có thể biến hóa để thích nghi với các điều kiện sống khác nhau thành các dạng đặc biệt sau:

ƒ Rễ giả: giống như một chùm rễ phân nhánh, có tác dụng giúp nấm

bám chặt vào cơ chất và hấp thụ chất dinh dưỡng từ cơ chất

ƒ Sợi hút: có ở nấm mốc sống ký sinh bắt buộc, chúng mọc ra từ

khuẩn ty, phân nhánh và mọc xuyên sâu vào tế bào chủ, ở đó chúng

có thể có hình cầu hoặc hình sợi Nấm mốc sử dụng sợi hút để hút chất dinh dưỡng từ cơ thể của sinh vật chủ

ƒ Sợi áp: hiện diện ở nấm mốc ký sinh trên thực vật Phần sợi nấm

tiếp xúc với sinh vật chủ sẽ phồng to lên để tăng diện tích tiếp xúc với sinh vật chủ Phần này thường có hình đĩa, có nhiều nhân tế bào, áp chặt vào sinh vật chủ Các mô của sinh vật chủ dưới tác dụng của enzyme do nấm tiết ra sẽ bị phá hủy từng phần hay bị phân hủy hoàn toàn Qua các mô bị phá hủy này, các sợi nấm sẽ lấn sâu vào bên trong sinh vật chủ và tiếp tục sinh enzyme để phân hủy sinh vật chủ Khác với sợi hút, sợi áp không phát triển thành các nhánh đâm sâu vào tế bào còn sống của sinh vật chủ

ƒ Sợi bò (thân bò): là đoạn sợi nấm khí sinh không phân nhánh, phát

sinh từ các sợi nấm dinh dưỡng, có hình thẳng hoặc hình cung Đầu mút của các sợi bò chạm vào cơ chất, phát triển thành các rễ giả để

bám chắc vào cơ chất Sợi bò lan dần ra mọi phía, kể cả trên thành thủy tinh của ống nghiệm, của nắp hộp petri Sợi bò và rễ giả

thường gặp ở bộ Mucorales

ƒ Vòng nấm và mạng nấm: là những biến đổi ở các loài nấm có khả

năng bẫy các loài động vật nhỏ trong đất Vòng nấm có thể có dạng bọng dính, mọc ra từ những cuống ngắn xếp thẳng góc với sợi nấm chính Đỉnh của các cuống này phình to thành bọng hình cầu Bọng này tiết ra một chất dính trên khắp bề mặt Khi con mồi chạm vào chất dính này sẽ bị giữ chặt lại và bị các nhánh sợi nấm đâm xuyên qua vỏ ngoài Các nhánh này lại phồng lên thành một bọng nhỏ bên trong cơ thể con vật và tiếp tục phân nhánh thành các sợi hút

Vòng nấm có dạng sợi thòng lọng có khuyên tròn dọc sợi nấm Mỗi khuyên cấu tạo bởi 3 tế bào xếp nối tiếp nhau và nối vào sợi nấm chính bằng một đoạn ngắn Khi mặt trong của 3 tế bào này tiếp xúc với con mồi thì lập tức các không bào sẽ phồng to lên và căng mạnh vào phía trong, thắt chặt con mồi lại Sau đó, các sợi nhánh mọc xuyên sâu vào cơ thể con mồi và tiếp tục phát triển ra các sợi hút

Mạng nấm hay còn gọi là lưới dính, là một mạng sợi dính với nhau như tấm lưới nhỏ Các côn trùng chạm vào sẽ bị giữ chặt lấy Sau

đó, một tế bào của mạng nấm sẽ phát triển thành một bọng nhỏ và các sợi hút để tiêu hóa cơ thể con mồi

1.1.2 Sinh sản ở nấm mốc:

Từ khuẩn ty khí sinh của nấm mốc có thể mọc ra những sợi sinh sản vô tính hoặc sinh sản hữu tính như sau:

ƒ Đầu bào tử trần: các cơ quan sinh sản vô tính có thể có cấu tạo

chứa các bào tử vô tính

ƒ Nang bào tử kín: mỗi nang bào tử kín có một nang trụ nối tiếp với

cuống nang Nang bào tử kín chứa các bào tử kín

ƒ Đảm: là cơ quan sinh sản hữu tính tạo thành do tế bào song nhân ở

đỉnh sợi phình to ra Trong đảm, hai nhân sẽ phối hợp với nhau để hình thành một nhân lưỡng bội Sau đó, đảm phát triển tạo thành

các bào tử đảm

ƒ Túi giá: có dạng hình cầu hoặc hình chai với vỏ được cấu tạo bởi

các lớp sợi nấm quấn chặt lại với nhau Thành trong của vỏ mang

các cuống bào tử trần Các bào tử trần sinh ra từ các cuống này

ƒ Cụm giá: cấu tạo bởi các cuống bào tử trần ngắn xếp liền với nhau

tạo thành một khối khá dày Bào tử trần sinh ra trên đỉnh cuống, tạo

thành một cái đệm gồm nhiều cuống dính với nhau

ƒ Đĩa giá: gặp ở nấm ký sinh trên thực vật Đĩa giá gồm một đĩa

phẳng cấu tạo bởi các sợi nấm quấn chặt lấy nhau, trên đó có các

cuống bào tử trần mọc thẳng đứng

ƒ Bó giá: gồm nhiều cuống bào tử trần dài, xếp song song với nhau ở

phần gốc hoặc suốt dọc cuống, mang bào tử trần ở phần ngọn hoặc

suốt dọc thân

ƒ Hạch nấm: là một khối sợi nấm rắn chắc, thường có tiết diện tròn,

không mang các cơ quan sinh sản Hạch nấm chỉ có ở các nấm mốc

có sợi nấm ngăn vách Đây là dạng sống nghỉ của nấm để bảo vệ nấm trải qua các điều kiện bất lợi của môi trường sống Hạch nấm

thường có kích thước 100 μm đến 1 mm, thường có cấu tạo 2 lớp: bên ngoài là lớp vỏ rắn, cấu tạo bởi nhu mô giả, có thành dày, phủ cutin, chứa sắc tố; lớp trong thường mềm hơn, cấu tạo bởi mô của các tế bào hình thoi, gồm các sợi nấm bình thường hoặc được gelatin hóa, không có màu, chứa nhiều chất dự trữ như

carbohydrate và lipid

ƒ Thể đệm: là một khối sợi nấm có thành tế bào dính liền nhau theo

nhiều hướng Bên trên hoặc bên trong thể đệm có mang các cơ quan sinh sản Các tế bào trong đệm nấm chưa được tạo thành mô thật như ở động vật và thực vật, mà chỉ là các mô giả Có 2 loại mô giả:

mô của tế bào hình thoi và nhu mô giả Mô của tế bào hình thoi có cấu tạo xốp, các sợi xốp song song với nhau và vẫn có thể phân biệt được từng sợi riêng biệt Nhu mô giả có các tế bào hình đa giác hay

hình tròn, dính chặt với nhau, không tách rời được thành từng sợi

ƒ Quả túi: là loại thể đệm gặp ở nấm túi Quả túi có dạng hình cầu,

hình chai hoặc hình đĩa

1.1.3 Phân loại nấm mốc:

Nấm mốc được phân loại theo nhiều hệ thống phân loại khác nhau Sau đây là tóm tắt hệ thống phân loại nấm của Ainsworth (1973):

Giới nấm

a Tồn tại nguyên chất đoàn (plasmodium) hoặc dạng nguyên chất đoàn giả

(pseudoplasmodium) ngành nấm nhày (Myxomycota)

aa Không có dạng nguyên chất đoàn hoặc giả nguyên chất đoàn, giai đoạn

dinh dưỡng là hệ sợi nấm (khuẩn ty thể) điển hình ngành nấm thật (Eumycota)

b Có bào tử động, bào tử hữu tính là bào tử noãn

ngành phụ Mastigomycotina

bb Không có bào tử động xem c

c Có giai đoạn hữu tính xem d

cc Không có giai đoạn hữu tính ngành phụ Deuteromycotina

d Bào tử hữu tính là bào tử tiếp hợp (zygospores) ngành phụ Zygomycotina

dd Không có bào tử tiếp hợp xem e

e Bào tử hữu tính là bào tử túi ngành phụ Ascomycotina

ee Bào tử hữu tính là bào tử đảm ngành phụ Basidiomycotina

Nấm mốc được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sau:

- Chế biến thực phẩm như: sản xuất tương, nước chấm, rượu, citric acid…

- Sản xuất enzyme như: cellulase, amylase, protease, pectinase…

- Sản xuất dược phẩm như: penicillin, cephalosporin, steroid…

Ngoài ra, nấm mốc còn được ứng dụng để sản xuất các thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố tăng trưởng cho thực vật, làm tăng độ phì nhiêu của đất, sản xuất sinh khối nấm sợi phục vụ cho ngành chăn nuôi, sử dụng nấm mốc để xử lý ô nhiễm môi trường…

1.3 Thu nhận enzyme từ vi sinh vật: [2]

Enzyme là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật Enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở tế bào, phần lớn các phản ứng trao đổi chất trong tế bào có sự xúc tác của enzyme Enzyme không chỉ xúc tác cho các phản ứng bên trong tế bào mà còn xúc tác cho các phản ứng bên ngoài tế bào Do đó, enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp và đời sống

Enzyme có thể được thu nhận từ động vật (như: pepsin từ dạ dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (như: amylase từ thóc nảy mầm, bromelin

từ trái thơm, papain từ trái đu đủ…) và từ các vi sinh vật (như: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men…)

Enzyme thu từ nguồn vi sinh vật có một số ưu điểm so với enzyme thu

từ nguồn động vật và thực vật như sau:

- Hoạt tính enzyme từ vi sinh vật rất cao, chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn

- Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó một số enzyme động vật và thực vật không tổng hợp được

- Vi sinh vật sinh sản, phát triển và tổng hợp enzyme với tốc độ cực

kỳ nhanh, trên môi trường nuôi cấy khá đơn giản, rẻ tiền… Do đó, rút ngắn thời gian thu nhận enzyme và làm giảm giá thành sản xuất enzyme

- Vi sinh vật chịu ảnh hưởng lớn của thành phần môi trường dinh dưỡng và các tác nhân lý hóa của môi trường Do đó, người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy hoặc các tác nhân lý hóa của môi trường, nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật sản xuất ra enzyme với hàm lượng lớn và có hoạt tính xúc tác cao

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở qui mô công nghiệp Hàng năm, người ta sản xuất ra hàng nghìn tấn/ năm các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô cho chăn nuôi và cho nhiều ngành công nghiệp khác như: dệt, da…; hoặc ở dạng tinh khiết cho thực phẩm, y học, dược học Ở Nhật, có rất nhiều công ty sản xuất các chế phẩm enzyme từ

vi sinh vật hàng năm, Nhật sản xuất khoảng 9850 tấn Amylase, 8906 tấn protease, 100 tấn Lipase… Các nước phát triển khác như: Anh, Pháp, Đan Mạch… cũng phát triển ngành công nghiệp sản xuất enzyme từ vi sinh vật khá mạnh

Các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme thường được phân lập từ các mẫu đất, nước, thực phẩm… Người ta thấy rằng các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase thường hiện diện trên các mẫu giàu cellulose như: rơm rạ, thực vật chết… còn các vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme amylase thường được phân lập từ các mẫu giàu tinh bột… Trong một số trường hợp, các chủng vi sinh vật phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp được một lượng nhỏ enzyme, các chủng này có thể được gây đột biến để tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp lượng lớn enzyme

1.4 Đặc điểm của enzyme cellulase từ vi sinh vật: [2, 3]

Enzyme cellulase là enzyme thủy phân Cellulose, cắt liên kết 1,4 – β –

glycosidic trong cellulose Cellulase bao gồm Exo – β – 1,4 glucanase và Endo – β – 1,4 glucanase

Hệ vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase khá phong phú Năm 1875, Popov là người đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose của vi sinh vật

kỵ khí Năm 1903, Van Iterson đã phát hiện ra khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn hiếu khí Sau đó, các công trình nghiên cứu về cellulase của vi sinh vật phát triển không ngừng Ngày nay, nhiều nước đã sản xuất chế phẩm cellulase vi sinh vật trong công nghiệp ở qui mô lớn và đã ứng dụng cellulase trong nhiều lĩnh vực

Từ lâu, người ta đã khám phá ra các vi sinh vật có khả năng cellulose trong dạ cỏ của những động vật nhai lại (như: trâu, bò, ngựa, cừu…) Các vi sinh vật này phân giải cellulose trong rơm, rạ, cỏ ở dạ cỏ của động vật nhai lại thành các chất dinh dưỡng dễ hấp thu Các vi sinh vật này có thể là kỵ khí bắt buộc hoặc kỵ khí không bắt buộc Người ta đã phân tích thấy có đến 15 – 20 tỉ

vi khuẩn/ 1cm3 chất có trong dạ cỏ các động vật nhai lại Các vi sinh vật có

khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ cỏ là: Ruminococcus albus,

Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus parum, Bacteroides amylophilus, Bacteroides succinogenes, Clostridium butyricum, Clostridium cellobronarum…

Ngoài ra, nhiều vi sinh vật trong đất, nước, không khí, cây cỏ, thực vật chết, phân động vật có khả năng phân giải cellulose Các vi khuẩn có khả

năng phân giải cellulose khá mạnh như: Pseudomonas fluorescens var

cellulose, Acetobacter xylinum, Cellvibrio gilvus, Cellvibrio fulvus… Nhiều

loài nấm có khả năng tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao như: Aspergillus

flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus amstelodamy, Aspergillus fumigatus; Mucor pusillus; Penicillium notatum, Penicillium variabite, Penicillium pusillum; Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma viride… Người ta thấy các nấm mốc

thường sản sinh enzyme cellulase với nồng độ cao hơn là vi khuẩn

1.5 Ứng dụng của enzyme cellulase: [2]

Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Cellulase phá vỡ vách tế bào thực vật giúp ly trích các chất từ tế bào thực vật được dễ dàng, đặc biệt là ly trích các dược chất từ các cây thuốc

Cellulose được áp dụng trong quá trình sản xuất glucose, mật đường từ nguyên liệu giàu cellulose như: rơm rạ, mạt cưa, gỗ vụn, dăm bào… dùng làm thực phẩm cho người và động vật

Hình 1.1 Aspergillus niger

Người ta có thể sử dụng cellulase để chuyển hóa các phế liệu giàu cellulose thành glucose, sau đó tiến hành lên men để tạo thành ethanol Ethanol có thể được pha trộn với xăng để làm giảm chi phí nhiên liệu cho các loại phương tiện giao thông

Trong chăn nuôi, thức ăn giàu celllose (như cỏ) có thể được trộn thêm cellulase để tăng thêm sự tiêu hóa thức ăn đối với các động vật, đặc biệt động vật còn non, giúp cho các động vật này tăng trưởng nhanh…

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Stt Ký hiệu mẫu Loại mẫu Địa điểm lấy mẫu

2.1.3 Môi trường và hóa chất:

ƒ Môi trường PGA (Potato Glucose Agar):