SEMINAR sắc ký lớp MỎNG ppt _ DƯỢC LIỆU

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide dược liệu ppt dành cho sinh viên chuyên ngành dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn dược liệu bậc cao đẳng đại học chuyên ngành dược

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất” ;

https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916

1 Đặt vấn đề

2 Nội dung chính

 Các bước chuẩn bị & tiến hành sắc ký

 Các yêu cầu cho từng nội dung sắc ký lớp mỏng

 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sắc ký

Trong phân tích dược liệu, SKLM là phương pháp được sử dụng rộng rãi bởi khả năng phân tách tốt, linh động, dễ thực hiện và tính kinh tế cao

 Phân tích thành phần các dược liệu

 Định tính các chất trong dược liệu, cao chiết bằng cách so với chất chuẩn, hay điểm chỉ

 Theo dõi quá trình chiết xuất

 Thăm dò điều kiện sắc ký cho sắc ký cột

 Bán định lượng

 Chế hóa

Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

 Phương pháp tách, phân ly các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh

 Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, )

 Các phân tử pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh

 Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

 Các bước chuẩn bị & tiến hành sắc ký

 Các yêu cầu cho từng nội dung sắc ký lớp mỏng

 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sắc ký

 Những sự cố thường gặp & khắc phục

 Những cải tiến & xu hướng phát triển của săc ký lớp mỏng

 Tráng sẵn: không cần hoạt hóa, độ phân tách tốt hơn

 Loại này cũng được làm thủ công như làm lớp mỏng phân tích nhưng lớp silicagel được tráng dày hơn,

độ dày 0,5 - 2 mm (hoặc có thể dày đến 10 mm)

 Hiện nay cũng đã có dạng lớp mỏng chế hóa loại tráng sẵn với độ dày khác nhau

• Chuẩn bị pha động

– Chọn pha động phụ thuộc:

 Độ phân cực của chất phân tách

 Cơ chế sắc ký của pha tĩnh

 Độ bay hơi, độ nhớt, sự phân lớp và độ tinh khiết của hỗn hợp dung môi

 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 – 0,8 đạt

độ phân giải cực trị

• Chuẩn bị pha động

– Chọn pha động phụ thuộc:

 Sự hấp phụ của một số nhóm chức theo thứ tự tăng dần: –CH=CH < –OCH3 < –COOR

< –C=O < –CHO < –SH < –NH2 < –OH < –COOH

 Để tăng cường sức rửa giải của pha động: cần kết hợp ít nhất 2 dung môi → Kinh nghiệm

• Chuẩn bị pha động

• Chuẩn bị bình sắc ký

– Gồm các bình đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật có kích thước khác nhau và có nắp đậy kín – Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình – Rót từng dung môi một lượng vừa đủ vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi (lượng dung môi sử dụng sao cho đủ thấm đều giấy lọc và đủ để chạy hết bản mỏng) Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC

• Chuẩn bị dung dịch mẫu

– Mẫu thử đã sơ bộ loại tạp (bằng phương pháp chiết) được hòa tan trong một dung môi thích hợp (dung môi này phải hòa tan tốt mẫu thử và dễ bay hơi như diclorometan, cloroform, methanol, ).

– Dung dịch mẫu thử này không nên có nồng độ quá cao hay quá loãng Nồng độ quá cao hay quá loãng đều ảnh hưởng đến vết chấm mẫu và quá trình chạy mẫu.

• Chấm mẫu thử

– Sử dụng mao quản định mức chính xác nếu phân tích bán định lượng, micropipet hay mao quản thường nếu chỉ nhằm để phân tách.

• Khai triển sắc ký

– Khai triển sắc ký lớp mỏng có thể sử dụng các kĩ thuật sau:

• Khai triển một lần hoặc nhiều lần trên cùng một hướng với mọt hay nhiều hệ dung môi Nếu muốn khai triển lần 2 phải làm bay hơi hết dung môi đã khai triển lần 1

• Khai triển sắc ký

– Khai triển sắc ký lớp mỏng có thể sử dụng các kĩ thuật sau:

• Kỹ thuật sắc ký 2 chiều: Khi phân tích mẫu có nhiều chất nếu kỹ thuật tách bằng sắc ký một chiều không

đủ độ tin cậy Tiến hành: cho triển khai chiều thứ nhất với hệ dung môi S1, sau đó để khô dung môi, quay bản mỏng 90o, và cho triển khai với hệ dung môi S2

Quay 90o

Thuốc thử Màu của vết Áp dụng

Thuốc thử chung

Thuốc thử chọn lọc

• Bình sắc ký

– Vật liệu làm bình sắc ký phải trơ với dung môi, tránh xảy ra phản ứng với dung môi

– Bình sắc ký phải kín để ổn định bão hòa dung môi trong bình sắc ký, tránh gây xáo trộn luồng không khí bão hòa

– Bình sắc ký phải dễ quan sát quá trình khai triển sắc ký, quan sát được rõ mực dung môi và

sự di chuyển của dung môi.

• Bản sắc ký

– Đối với bản tráng sẵn

• Chọn những bản sắc ký có kích thước phù hợp với mục đích, bảo quản trong bình hút ẩm

• Bản silica gel tráng sẵn không cần hoạt hóa, bản mỏng Alumia (nhôm oxyd) phải được hoạt hóa ở 120oC x 2h

• Bản sắc ký

– Đối với bản mỏng được làm từ dạng bột rời

• Bản mỏng phải được tráng đồng đều

• Sau khi tráng bản mỏng phải được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, rồi đem sấy để hoạt hóa:

– Đối với lớp mỏng silica gel phân tích dày 0,10 - 0,25 mm: thường sấy ở nhiệt độ 100 - 105oC x 2h

– Đối với lớp mỏng alumina phân tích dày 0,10 - 0,25 mm: thường sấy ở nhiệt độ 120oC x2h– Bản mỏng chế hóa: yêu cầu tương tự với bản mỏng sắc ký

• Dung môi

– Hòa tan tốt mẫu thử

– Không phản ứng với mẫu thử

– Linh động, độ nhớt thấp

– Nhiệt độ sôi không quá thấp, không quá cao

– Không có mùi khó chịu

– An toàn, không độc hại

– Rẻ tiền, dễ kiếm

– Thân thiện với môi trường.

• Dung môi

– Lưu ý:

• Dung môi được chọn phải phù hợp với pha tĩnh sử dụng và tính chất của nhóm chất cần phân tích (theo quy tắc “Stahl”)

• Lượng dung môi khai triển phải đủ dùng, bảo quản kín ở nhiệt độ cố định để kết quả dễ lặp lại

• Khi khai triển, dung môi phải đặt trong bình sắc ký kín, có lót giấy bão hòa và đặt bình sắc ký tại nơi có nhiệt độ ổn định

• Không tái sử dụng dung môi nhiều lần vì thành phần dễ bay hơi trong hệ sẽ giảm đi, làm thay đổi độ phân cực của dung môi khiến kết quả không ổn định

• Mẫu thử

– Mẫu thử phải được loại tạp sơ bộ, tránh để mẫu thử quá nhiều tạp gây ảnh hưởng kết quả sắc ký.

– Mẫu thử nên được hòa trong dung môi:

• Hòa tan tốt mẫu thử

• Dễ bay hơi (thường dùng benzene, dichloromethane, chloroform, methanol)– Nồng độ mẫu thử vừa phải, không quá loãng/ đặc

– Giữa các lần chấm phải đợi lần chấm trước khô rồi mới chấm lần tiếp theo, tránh trường hợp chấm ngay sau

đó có thể gây ướt, tróc lớp silica gel ở vị trí chấm Có thể chấm sắc ký dưới nguồn nhiệt thích hợp hoặc dùng dụng cụ làm khô vết sắc ký

– Chọn mao quản phù hợp: nếu để phân tích thì có thể dùng các mao quản thông thường, nếu để bán định lượng, nên dùng vi mao quản có thể tích xác định

• Triển khai sắc ký

– Chọn cách khai triển phù hợp với mục đích phân tích

– Phải bão hòa bình sắc ký một thời gian ổn định trước khi cho bản mỏng vào khai triển

– Đặt bình sắc ký tại nơi có nhiệt độ ổn định Trong quá trình khai triển, tuyệt đối không di chuyển hay làm rung động bình sắc ký

• Quan sát & hiện màu sắc ký đồ

– Sau khi triển khai sắc ký xong, phải để bản mỏng khô dung môi ở nhiệt độ phòng trước khi quan sát dưới đèn UV

– Chọn thuốc thử thích hợp để hiện màu sắc đồ Khi phun thuốc thử thì phun đều bản mỏng, hạt phun phải mịn, đều Lượng dịch phun phải thấm ướt hoàn toàn bản mỏng, không phun dư thuốc thử Nếu nhúng thuốc thử thì thao tác phải nhanh, loại bỏ thuốc thử dư để tránh làm loang vết sắc ký

– Chỉ sấy nóng hay hơ nóng khi bản mỏng đã thật khô để tránh phồng rộp bản mỏng Chú ý chọn nhiệt độ và thời gian sấy phù hợp

• Bản mỏng

– Silicagel là chất trải bản thông dụng nhất

– Trên thị trường có rất nhiều loại silicagel khác nhau và chúng cũng thể hiện khả năng tách không giống nhau.– Ngoài ra còn có các loại chất trải bản khác như cellulose, nhôm,

– Vật liệu làm bản mỏng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến kỹ thuật làm sắc ký Vì vậy phải chọn loại bản mỏng phù hợp với mục đích sử dụng

• Cách cắt bản mỏng

– Việc chia nhỏ bản mỏng không tốt có thể dẫn đến bản mỏng không đạt chất lượng, chất tráng bản mỏng bị bong Nếu cắt không khéo có thể tạo thành vết nứt mao quản giữa lớp tráng bản và bản mỏng, gây hiệu ứng bờ (dung môi di chuyển ngoài rìa nhanh hơn ở giữa và còn di chuyển theo phương ngang vào giữa bản mỏng)

– Cắt bản mỏng với kéo lớn (càng ít nhát cắt càng tốt) Cắt theo phương 30º

so với trục vuông góc bản mỏng

• Độ ẩm của bản mỏng

– Bản mỏng hấp phụ trao đổi ẩm rất nhanh với môi trường nên hàm ẩm của nó thường tương đương với môi trường

– Nhà sản xuất thường đóng gói bản mỏng ở độ ẩm trung bình (khoảng 40 - 60%)

– Độ ẩm không ảnh hưởng nhiều lắm đến hiệu năng của bản mỏng nhưng khi độ ẩm tương đối vượt quá 60% thì có những sự thay đổi rất lớn

– Độ ẩm tương đối ảnh hưởng nhiều thông số của TLC như Rf, mức độ chọn lọc, khả năng tách, tốc độ di chuyển của pha động

• Mẫu thử

– Khi chiết tách cần lưu tâm đến dung môi và phương pháp tách vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng những chất có mặt trong mẫu.

• Chấm sắc ký

– Thông thường ta chấm vết có đường kính khoảng 1 mm hoặc nhỏ hơn để giảm hiện tượng méo vết sắc ký.– Lượng mẫu thử đưa lên bản mỏng nếu quá ít sẽ không thể hiển thị nhưng nếu quá nhiều thì lại gây quá tải bản mỏng Do đó cần khảo sát sơ bộ với nhiều nồng độ trước khi tiến hành Thông thường đối với điểm là 1-2 µg

và 2-10 µg đối với băng 10 mm

– Kỹ thuật chấm sắc ký cũng rất quan trọng Cần sử dụng ống mao quản phù hợp, cố gắng chấm vết nhỏ và tránh làm bong tróc lớp sắc ký Lưu ý tránh làm nhiễm tạp lên bản mỏng Hiện nay có máy chấm sắc ký tự động giúp chuẩn hóa quá trình này

– Môi trường trong bình sắc ký cần được bão hòa để sự tác động ảnh hưởng đồng đều lên tất cả các điểm của bản mỏng

1 Vết trải dài không tách

– NN: Chọn hệ dung môi sắc kí chưa tốt, dung môi chiết không chuyên biệt

– KP: Thăm dò lại hệ dung môi sắc ký, chọn dung môi chiết xuất mẫu chuyên biệt hơn

3 Vết quá đậm hoặc quá mờ

– NN: Lượng mẫu quá nhiều hoặc quá ít,

– KP: Chấm vừa phải (kiểm tra bằng đèn UV)

4 Vết di chuyển xéo

– NN: Lớp mỏng tráng không đều, hở bình sắc ký

– KP: Thay bản mỏng khác, đậy kín hoặc thay bình sắc ký khác

5 Bản mỏng bị loang màu ở dưới

– NN: Nơi đặt bản mỏng bị ướt do phun quá nhiều thuốc thử

– KP: Kê bản mỏng cách xa nền (dùng que thủy tiinh hoặc kẹp treo)

6 Vết di chuyển không hoàn toàn

– NN: Mẫu còn nhiều tạp phân cực

– KP: Loại tạp kĩ hơn trước khi chấm lên bản

7 Vết hình ngọn lửa nhiều đầu

9 Nhiều đốm màu loang lổ

– NN: Bộ phun hạt không mịn, phun thuốc thử không đủ

– KP: Chọn bộ phun hạt mịn hơn, phun nhiều thuốc thử hơn

10 Tuyến dung môi bị lệch

– NN: Lớp mỏng tráng không đều, nắp bình sắc kí bị hở hoặc bình bị hở – KP: Thay bản mỏng khác, thay nắp bình, thay bình sắc kí khác

11 Màu các vết đen như nhau, khó phân biệt

– NN: Sấy hoặc hơ nóng bản mỏng quá lâu, nhiệt độ quá cao (đặc biệt đối với thuốc thử có acid sulfuric)

– KP: Điều chỉnh nhiệt độ và thời gian sấy, khi vết bắt đầu chuyển màu thì lấy bản mỏng ran gay

12 Bản bị phồng rộp

– NN: Sấy nóng bản mỏng khi bản chưa khô (còn dung môi hay thuốc thử)

– KP: Chờ bản khô dung môi, hoặc thật khô thuốc thử hiện màu

• Thiết bị có thể lưu lại chính xác thời gian phát triển sắc phổ.

• Thiết bị có thể lưu 10 phương pháp phát triển sắc đồ riêng biệt trong 1 bộ nhớ đệm.

• Quá trình sắc ký diễn ra trong 1 buồng tối và áp suất chân không Hơi dung môi được đẩy ra ngoài nhờ quạt sau khi quá trình kết thúc.

• Bình sắc ký

– Bình sắc ký ngang khai triển trung tâm: bản mỏng được đặt ngang trong bình sắc ký, dung môi được khai triển

từ 2 phía đối diện của bản mỏng

Máy sắc ký khai triển ngang (hãng CAMAG)

• Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

– Kích thước hạt silica gel làm pha tĩnh được giảm xuống, nhờ đó cải thiện khả năng tách, giúp rút ngắn thời gian, ngoài ra còn ít làm tiêu tốn mãu, dễ tự động hóa và có thể bán định lượng bằng máy quét vết (máy CAMAG TLC Scanner 3)

Bán định lượng

• Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

– Một trong những xu hướng phát triển của sắc ký lớp mỏng hiện nay là giảm kích thước của hạt Silicagel để tăng diện tích bề mặt riêng làm tăng khả năng phân tách của pha tĩnh

– Kích thước hạt Silicagel trung bình là 6µm so với sắc ký lớp mỏng thông thường là 15µm

– Khi đó quãng đường và thời gian sắc ký có thể rút ngắn còn ½ so với sắc ký lớp mỏng thông thường mà vẫn

có kết quả tách tốt hơn

– Các bản sắc ký như vậy gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

– Chiều dài bản mỏng thường là 5-6cm

Kỹ thuật Tự động hóa/dụng cụ Bằng tay

Kích thước hạt pha tĩnh 5–6 μm 10–12 μm

Độ dày lớp mỏng 100 μm 250 μm

Độ dày giá mang 12 μm 30 μm

Hiệu năng Cao, tùy thuộc kích cỡ càng nhỏ của hạt pha tĩnh Thấp

Chiều dài quãng đường sắc ký 3–5 cm 10–15 cm

Thời gian phân tích Nhanh, 3-20 phút Chậm hơn, 20-200 phút

Loại hạt pha tĩnh Silica gel pha thuận hoặc pha đảo Silica gel, oxyd nhôm, Kieselguhr

Bình triển khai sắc ký Thiết kế với lượng dung môi sử dụng ít hơn Sử dụng nhiều dung môi hơn

Chấm mẫu Tự động Bằng tay

Thể tích mẫu chấm 0.1–0.5 μm 1–5 μm

Quét phô Có thể dùng để định tính và định lượng Không áp dụng

Giới hạn phát hiện (huỳnh quang) 5–10 pg 50–100 pg

• Máy chấm sắc ký & phần mềm đánh giá kết quả

– Người ta cũng đã cải tiến quá trình chấm sắc ký, thay vì chấm thủ công thì nay đã được điều khiển bằng máy.– Cho kết quả hình ảnh đẹp hơn, rõ hơn, hạn chế được các hiện tượng kéo vệt

– Số vết, lượng dịch sẽ chấm trên bản mỏng được xác lập trên máy vi tính

– Quá trình chấm dịch chiết được thực hiện với sự hỗ trợ của máy nén khí hoặc bình khí nén N

– Sau khi triển khai, sắc ký đồ được chụp ảnh qua buồng chụp (Reprostar 3) và kết quả được đánh giá bằng phần mềm VideoScan

Máy chấm sắc ký LINOMAT 5 (Hãng CAMAG)

• TLC/ HPTLC “lai”

– Ghép SKLM với các bộ phận phát hiện có khả năng định danh hợp chất như:

• Khối phổ (TLC/MS): chất phân tách được cạo từ bản mỏng, giải hấp phụ và được đưa vào MS để định danh hợp chất Ví dụ máy TLC – MS Interface (Camag)

Máy TLC-MS INTERFACE

• Trong phân tích dược liệu, SKLM là phương pháp đựợc sử dụng rộng rãi nhất bởi khả năng phân tách tốt, linh động, dễ thực hiện và tính kinh tế cao.

• Sắc ký lớp mỏng được sử dụng trong phân tích thành phần các dược liệu, định tính các chất trong dược liệu, cao chiết bằng cách so với chất chuẩn, hay điểm chỉ, theo dõi quá trình chiết xuất, thăm dò điều kiện sắc ký cho sắc ký cột

• Việc nắm rõ bản chất của các kĩ thuật thực hiện SKLM, các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sắc

ký sẽ giúp phòng tránh được những tác động xấu lên kết quả phân tích, tìm hiểu được bản chất của những nguyên nhân và xử lý kịp thời những tình huống xảy ra trong sắc ký nhằm mục đích đảm bảo chất lượng kết quả thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng.

• Những các cải tiến và xu hướng phát triển của sắc ký lớp mỏng ngày nay sẽ góp phần tối ưu hóa những ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích.

1. Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Giáo trình Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2012, trang 72-78.

2. Nguyễn Đức Tuấn, Sắc ký lớp mỏng, Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, 2011, trang 205-220.

Tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài

3. Peter E Wall, Thin-layer Chromatography: A Modern Pratical Apporoach

4. Rashmin B Patel, Mrunali R Patel, and Bharat G Batel Experimental Aspects and Implementation of HPTLC In: High – Performance Thin – Layer Chromatography

(HPTLC) ,Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 43 (2011).

5. Andrew Fong, Gary M Hieftje Near–IR Spectroscopic Examination of Thin–Layer Chromatography Plates in the Diffuse Transmittance Mode Applied Spectroscopy, 48 (3),

394-399 (1994).

Tài liệu tham khảo từ internet

6. Phương pháp sắc ký dược liệu, http://www.duoclieu.org/2012/07/phuong-phap-sac-ky-duoc-lieu.html , truy cập ngày 01/12/2012.

7. Phương pháp Sắc ký lớp mỏng, http://duoclieu.net/dlieuhoc/tools/phuongphap/SKLM

8. Desaga TLC – MAT, http://banchung.vn/p/694/sac-ky-ban-mong-desaga-tlc-mat , truy cập ngày 30/11/2012.

9. TLC, http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html , truy cập ngày 25/11/2012.