CHUYÊN ĐỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Phương pháp sắc ký - Năm 1906, nhà bác học người NgaMikhail Tswett 1872-1919 đã cho dung dịch các sắc tổ thực vật Clorophyl và Xanthophyl trong ete dầu hỏa lên cột nhồi bột mịn Calci ca

Chuyên đề:

SẮC KÝ LỚP MỎNG

I Phương pháp sắc ký

- Năm 1906, nhà bác học người NgaMikhail Tswett (1872-1919) đã cho dung dịch các sắc tổ thực vật (Clorophyl và Xanthophyl ) trong ete dầu hỏa lên cột nhồi bột mịn Calci carbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ trên đầu cột

- Khi cho dung môi nguyên chất (ete dầu hỏa) lên cột, các sắc tố di

chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ

mà Tsvet gọi sắc đồ Ông đặt tên cho phương pháptách này là sắc ký (chromato-graphy)

- KN : Sắc ký(Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.

II Sắc ký lớp mỏng

1.Lịch sử hình thành

 1938,Izmailov và Schraiber:(bản thủy tinh để phân tách dịch chiết alcaloid thực vật).

 1958, Stahl đã hoàn thiện và chuẩn hóa phương pháp SKLM (silicagel, CaS,0.25mm).

 1965, hãng Merck chuẩn hoá bảng mỏng sắc ký

2.Khái niệm

Sắc ký lớp mỏng ( TLC: Thin Layer Chromatography) là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách

3 Nguyên tắc

Dựa vào cơ chế hấp phụ là chính trong đó:

- Pha động là dung môi (hỗn hợp các dung môi).

- Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền

phẳng như tấm kính, nhựa hay kim loại

a) Pha động

Hệ dung môi gồm 2 hay 3 thành phần.

- Dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần :

“Kém phân cực – Phân cực TB – Phân cực mạnh”

VD: Chloroform : Methanol : Nước (65:35:7)

b) Pha tĩnh

Yếu tố quyết định đến quá trình tách sắc ký

- Khả năng phân tách của pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào mức độ

tiếp xúc của pha tĩnh với mẫu thử của pha động

-Yếu tố này liên quan nhiều tới diện tích bề mặt riêng và mật độ

của pha tĩnh Mật độ của pha tĩnh cao, khả năng tạo cân bằng

pha càng lớn, hệ càng phân tách tốt.

- Pha tĩnh Thông dụng nhất dùng trong sắc ký hấp phụ hiện nay

là Silica gel.

Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Phân tích

Silicagel G Hấp phụ A.amin, vitamin

Dẫn chất siloxan Phân bố Chất ít phân cực

Cellulose Phân bố A.amin, carbohydrat Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, lipid Cát biển Phân bố Đường, acid béo

Cellulose trao đổi

ion

Trao đổi ion Ion KL, halogenid Gel sephadex Loại cỡ Protein, polymer

Vd: để phân tách a.amin trong mẫu dd ta cần lựa chọn pha tĩnh là Silica

gel G, để tách hydrocacbon cần dùng Alumina

Tủ hút

Bình triển khai

Bộ sắc ký

Những dụng cụ

cần thiết

Tủ sấy

Đèn tử ngoại

02

03

04

05

B CÁC BƯỚC CHUẨN BI

CHUẨN BỊ BẢN MỎNG

ĐIỀU CHẾ VỮA

CHUẨN BI BÌNH KHAI TRIỂN

CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH

TRIỂN KHAI SẮC KÝ

1 Chuẩn bị bản mỏng

- Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ được trộn thêm 5 – 15% chất kết dính (thạch cao, tinh bột, dextrin)

- Bản mỏng không dính chắc.

2 Điều chế vữa của chất hấp phụ

Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel, cellulose, nhôm oxyd… (silicagel được dùng thông dụng nhất).

Hoạt hóa:

Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy ở 105 – 110/30 phút Ðể nguội rồi bảo quản trong bình hút

ẩm

3 Chuẩn bị bình khai triển

- Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín

- Lưu ý: chọn bình phù hợp với lượng dung môi pha động theo nhu cầu và lượng dung môi trong bình không vượt quá vạch dưới bảng mỏng ( vạch chấm chất phân tích)

4 Chấm chất phân tích lên bản mỏng

- Dùng pipet hoặc ống nhỏ giọt đưa mẫu lên bản.

- Lượng mẫu đưa lên bản phải phù hợp.

- Đối với dung dịch phân tích quá loãng, có thể thêm mẫu.

5 Triển khai sắc ký

 Là quá trình tách cấu tử trên bản mỏng

Thông số đặc trưng của pp

Hệ số lưu giữ R f

- Thông số này thể hiện cho khả năng di chuyển của những chất cần tách

0: chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm tại điểm xuất phát.

1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc dung môi.

: khoảng cách di chuyển được của chất cần tách.

: khoảng cách di chuyển được của dung môi.

v: vận tốc di chuyển của chất cần tách.

: vận tốc di chuyển dung môi.

Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf

 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ

 Chiều dài của lớp mỏng, quãng đường của sắc ký,

lượng chất chấm

 Vị trí và số lượng chất cần tách trên bảng mỏng

 Thành phần và độ tinh khiết của pha động

 Phương pháp triển khai sắc ký

 Ảnh hưởng của các cấu tử khác trong phần hỗn hợp cần tách

 Độ ẩm , nhiệt độ, pH

 Độ bão hòa của dung môi ( hiện tượng “bờ” )

D ỨNG DỤNG VÀ CÔNG DỤNG

SKLM

1 Định tính và thử độ tinh khiết:

- Để nhận biết sự có mặt của chất cần tách trong dd mẫu, ngoài ra còn nhận biết được 1 số tạp trong dd mẫu để đánh giá độ tinh khiết dd mẫu

� Ưu điểm

- Nhanh

- Tách riêng từng chất

- Dễ thực hiện

� Nhược điểm

- Thành phần pha động dễ thay đổi

- Các vết sau khi khai triển thường bị kéo đuôi

- Chỉ sử dụng khi hỗn hợp cần tách số lượng ít

2 Bán định lượng – định lượng

2 pp: tách chiết bằng dung môi và định lương trực tiếp trên bảng mỏng

- Tách chiết chất phân tích trong sắc ký bằng dung môi : (làm sạch dịch chiết định lượng)

-) mất nhiều thời gian nên ít sử dụng

- Định lương trên bảng mỏng : đo điện tích hay cường độ vết sắc ký

có 2 kĩ thuật

+ Dùng máy đo mật độ quang Densitometer : chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp phụ hoặc huỳnh

quang

+ Xử lý ảnh với camera kĩ thuật số độ phân giải cao: quét bảng mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính

vết bị kéo đuôi

Xác định sắc tố trong tế bào thực vật

Nhận biết những hợp chất trong 1 chất có sẵn

Giám sát Phản ứng hữu cơ

Xét nghiệm độ tinh khiết của chất phóng xạ

Xác định sắc tố trong TBTV

E CÁC HIỆN TƯỢNG NGOÀI Ý VÀ

CÁCH KHẮC PHỤC

Vết di chuyển không

hoàn toàn Mẫu còn nhiều tạp phân cực

Loại tạp kĩ hơn trước khi chấm

lên bản

Vết hình móng ngựa Vết chấm hình tròn quá lớn Chấm nhỏ hơn với nồng độ caohơn hoặc chấm vạch

Các vết lân cận trùng

vào nhau Chấm các vết quá gần

Chấm khoảng cách vết theo

đúng quy định

Vết hình ngọn lửa nhiều

đầu

Chấm vết không trùng nhau Chấm kỹ lại trên bản mỏng khác

Tuyến dung môi bị lệch

Bản mỏng bị mẻ ở hai bờ, thành bản mỏng tiếp xúc dung môi, hở bình sắc ký

Thay bản mỏng khác hoặc thay nắp bình, thay bình SK

Vết trải dài không tách

Chọn DM sắc ký chưa tốt hoặc DM chiết không chuyên

biệt

Thăm dò lại hệ DM SK hoặc chọn

DM chiết xuất mẫu riêng biệt

Vết di chuyển xéo Bản mỏng bị mẻ ở hai bờ,

thành bản mỏng tiếp xúc DM

Thay bản mỏng khác, thay bình

SK khác

Vết loang Vết khuếch tán do bay hơi vì

để lâu hoặc nhúng thuốc thử

quá lâu

Vẽ chụp hình ngay khi hiện màu xong hoặc nhúng nhanh, loại bỏ

thuốc thử dư

Bản mỏng bị loang màu

ở dưới

Bản mỏng đặt sát nền Kê bản mỏng cách xa nền (dùng

que thủy tinh hoặc kẹp treo)

vd

vd

Ưu và nhược điểm của TLC

-Đơn giản, dễ thực hiện

-Tiết kiệm thời gian

-Có thể phát hiện tất cả các

chất kể cả những chất

không di chuyển theo pha

động

-Tách dễ dàng các mẫu có

nhiều thành phần

-Phạm vi ứng dụng rộng rãi

-Chỉ số Rf có độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi trong lúc triển khai sắc ký

-Tăng giãn rộng vết do khuết tán

vì tốc độ dòng pha động thấp