Xây dựng phương pháp xác định một số chất ức chế men phosphodiesterase 5 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng bắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ raman tăng cường bề mặt

Hiện nay tại Việt Nam phương pháp phổ biến dùng để phát hiện sildenafilSIL, tadalafilTAD, vardenafilVAR và các hợp chất ức chế PDE- 5 tương tự là HPLC – DAD, đặc biệt là LC – MS và LC –

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

PHỔ RAMAN TĂNG CƯỜNG BỀ MẶT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Thanh

Hà, người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên

cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Vũ – trung tâm Khoa học vật liệu,

khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã đóng góp ý kiến giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh - giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội và NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên khoa Dược

trường Đại học Y-Dược Huế đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học, , các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2018

Học viên

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Tổng quan về thực trạng trộn trái phép chất ức chế PDE – 5 trong các chế phẩm đông dược trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.1.1.Trên thế giới 3

1.1.2.Tại Việt nam 5

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 6

1.2.1 Chất ức chế PDE – 5 6

1.2.2 Sildenafil 8

1.2.3 Tadalafil 9

1.2.4 Vardenafil 10

1.3 Tổng quan về phương pháp phân tích 11

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 11

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 12

1.3.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt 14

1.4 Một số phương pháp định tính, định lượng chất ức chế PDE - 5 trộn trong các chế phẩm nguồn gốc từ dược liệu 20

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 24

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng sildenafil, tadalafil, vardenafil trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC 25

2.2.2 Thẩm định phương pháp 27

2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 28

2.2.4 Xây dựng quy trình định tính sildenafil trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 28

2.2.5 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 30

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 30

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC 31

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC 31

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 33

3.1.3 Thẩm định phương pháp 35

3.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 41

3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính sildenafil bằng TLC – SERS 46

3.2.1 Khảo sát các điều kiện SERS 46

3,2,2, Đánh giá phương pháp 51

3.2.3 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 52

PHẦN 4: BÀN LUẬN 55

4.1 Phương pháp HPTLC 55

4.1.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 55

4.1.2 Lựa chọn xử lý mẫu 56

4.1.3 Thẩm định phương pháp 56

4.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 57

4.2 Phương pháp TLC-SERS 58

4.2.1 Lựa chọn phương pháp 58

4.2.2 Xây dựng quy trình định tính sildenafil bằng TLC – SERS 58

4.2.3 Đánh giá phương pháp 59

4.2.4 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of Official

Analytical Chemists) DAD Detector mảng diod (Diode-array detector)

ESI Ion hóa tia điện (electrospray ionization)

ICH Hội đồng hòa hợp quốc tế (International Council for Harmonisation) HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer chromatography)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MS Phổ khối (Mass spectrometry)

MS/MS Khối phổ hai lần (tandem mass spectrometry)

NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

DANH MỤC HÌNH

Hình1.1 Biểu đồ tỉ lệ các loại thuốc trộn trái phép trong thực phẩm chức năng tại

Mỹ 5

Hình1 2 Sơ đồ biểu diễn cơ chế tác dụng của chất ức chế PDE-5 7

Hình1 3 Cấu trúc hóa học của Sildenafil citrat 8

Hình1 4 Cấu trúc hóa học của tadalafil 9

Hình1 5 Cấu trúc hóa học của vardenafil dihydroclorid 10

Hình1 6 Sơ đồ nguyên lý của SERS 15

Hình 1 7 Quy trình phân tích mẫu theo phương pháp TLC-SERS 19

Hình 3 1 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động 31

Hình 3 2 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động 32

Hình 3 3 Kết quả phổ UV của các chất phân tích 33

Hình 3 4 Sơ đồ xử lý mẫu phân tích 35

Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC 36

Hình 3 6 Sắc ký đồ analog đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 36

Hình 3.7 Sắc ký đồ analog xác định LOD 41

Hình 3 8 Sắc kí đồ phân tích các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường 42

Hình3 9 Kết quả chồng phổ mẫu dương tính sildenafil 43

Hình 3 10 Kết quả chồng phổ UV mẫu âm tính với sildenafil 43

Hình3 11 Kết quả chồng phổ UV các mẫu dương tính với tadalafil 43

Hình3 12 Kết quả chồng phổ UV các mẫu dương tính với vardenafil 44

Hình 3 13 Hình ảnh đo TEM của hỗn dịch keo bạc M5 trong nước 46

Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV – VIS của hỗn dịch keo bạc M5 trong nước 47

Hình 3 15 Kết quả khảo sát nồng độ keo bạc 47

Hình 3 16 Kết quả khảo sát thể tích nhỏ kheo bạc ……….…………48

Hình 3 17 Kết quả khảo sát vị trí chiếu tia laser 49

Hình 3 18 Hình ảnh phổ SERS của sildenafil trong methanol ở các nồng độ khác nhau 49

Hình 3 19 Hình ảnh phổ SERS đánh giá độ chọn lọc 51

Hình 3 20 Phổ SERS các mẫu nghi ngờ có chứa sildenafil……… ……… 54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Một số nghiên cứu phát hiện chất ức chế PDE – 5 trộn trái phép trong các

chế phẩm đông dược 20

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 3 chất phân tích trên 3 dạng nền mẫu 33

Bảng 3 2 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp HPTLC 37

Bảng 3 3 Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính của 3 chất phân tích 38

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày của phương pháp 39

Bảng 3 5 Kết quả khảo sát LOD, LOQ của 3 chất phân tích 41

Bảng3 6 Kết quả định lượng 3 chất trên mẫu thực 44

Bảng 3 7 Các đỉnh đặc trưng và tỷ lệ cường độ SERS ở các đỉnh của sildenafil 50

Bảng 3 8 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của sildenafil 52

Bảng 3 9 Bảng các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ SERS ở các đỉnh của các mẫu dương tính sildenafil 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội thảo Quốc tế chuyên đề "Cập nhật tiến bộ mới trong điều trị Rối loạn cương dương" do bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội tổ chức ngày 21/05/2017 đã đưa ra các số liệu trong cuộc khảo sát thực hiện năm 2017: Có trên 50% nam giới bị rối loạn cương dương ở độ tuổi từ 40 - 70 Theo ước tính đến năm

2025, số lượng nam giới mắc rối loạn cương dương cán mốc 320 triệu người Phần lớn nam giới khi mắc bệnh đều rất e ngại, ngại đi khám, ngại chia sẻ nên thường tự

đi mua thuốc về uống Hiện nay 4 loại thuốc tổng hợp thường dùng để điều trị rối loạn cương dương là sildenafil (Viagra), tadalafil (Cialis), vardenafil (Levitra), avanafil (Stendra)

Tuy nhiên, từ xa xưa con người đã có những bài thuốc dân gian dùng để điều trị cho đàn ông yếu sinh lý Do vậy trên thị trường cũng đã tồn tại rất nhiều loại thuốc đông dược và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu dùng để điều trị rối loạn cương dương Bên cạnh những ưu điểm về giá cả hợp lý, an toàn do nguồn gốc từ thiên nhiên, thì tình trạng chế phẩm đông dược gồm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng bị trộn trái phép thuốc tân dược đã và đang diễn ra Việc này không những đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng mà còn ảnh hưởng đến

uy tín của các cơ sở sản xuất đông dược Bởi vì, việc chỉ định các loại thuốc trên để điều trị rối loạn cương dương cho bệnh nhân cần có sự theo dõi chặt chẽ của bác sỹ

về liều dùng và thời gian sử dụng Do đó, một nhu cầu cấp thiết được đặt ra là phát triển các phương pháp nhanh chóng, có tính đặc hiệu cao để sàng lọc các chế phẩm đông dược bị trộn lẫn các thuốc tổng hợp hoá học này

Hiện nay tại Việt Nam phương pháp phổ biến dùng để phát hiện sildenafil(SIL), tadalafil(TAD), vardenafil(VAR) và các hợp chất ức chế PDE-

5 tương tự là HPLC – DAD, đặc biệt là LC – MS và LC – MS/MS [6], có độ đặc hiệu cao, phù hợp với việc phân tích các mẫu có thành phần phức tạp như các chế phẩm đông dược Trong những năm gần đây, quang phổ Raman đang là

phương pháp nhận được sự quan tâm và được ứng dụng trong phát hiện thuốc giả [5], nhờ có độ đặc hiệu cao (cao hơn nhiều so với quang phổ UV – VIS) Tuy nhiên, nền mẫu chế phẩm đông dược với các thành phần dược liệu phức tạp, phát huỳnh quang mạnh và ít bền với nhiệt của tia laser là thách thức đối với Raman Do đó, phương pháp TLC-SERS đã sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) để khắc phục nhược điểm này, và kết hợp với tán xạ Raman tăng cường

bề mặt (SERS) giúp cho phát hiện nhanh và đặc hiệu các chất phân tích với độ nhạy cao

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn trái phép

trong các chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài:“Xây dựng phương

pháp xác định một số chất ức chế men phosphodiesterase -5 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ Raman tăng cường bề mặt’’

Với mục tiêu :

1 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng sildenafil, tadalafil và vardenafil trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao; ứng dụng để phân tích một số mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường

2 Xây dựng quy trình định tính sildenafil trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với tán xạ Raman tăng cường bề mặt (TLC- SERS); ứng dụng để phân tích một số mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường

Ở Hàn Quốc, một nghiên cứu tiến hành trong 4 năm (2009-2012) trên 164 mẫu thực phẩm chức năng được quảng cáo tăng cường sinh lý nam giới cho thấy

77 mẫu phát hiện có chứa chất ức chế PDE-5 gồm có 55 mẫu phát hiện tadalafil,

36 mẫu phát hiện sildenafil, 17 mẫu phát hiện đồng phân của tadalafil (aminotadalafil, chloropretadalafil, octylnortadalafil), 17 mẫu phát hiện đồng phân sildenafil (dimethylsildenafil, dimethylthiosildenafil, hydroxyhomosildenafil…) một số mẫu phát hiện vardenafil cùng đồng phân (hydroxyvardenafil) và Icariin [33]

Tại pháp Véronique Gilard và cộng sự[27] tiến hành nghiên cứu bằng phương pháp 1H NMR để định tính, định danh và định lượng 150 thực phẩm chức năng trên thị trường để tăng cường khả năng sinh lý Kết quả có 61% mẫu đã pha trộn với các chất ức chế phosphodiesterase-5(27% với thuốc nhóm ức chế PDE-5 gồm sildenafil, tadalafil, vardenafil và 34% với các dẫn chất của chúng) Trong số mẫu pha trộn đó, 64% chỉ chứa 1 thuốc nhóm PDE-5 và 36% mẫu có chứa hai, ba và thậm chí bốn thuốc hoặc dẫn chất nhóm PDE-5 Số lượng thuốc PDE-5 cao hơn liều khuyến cáo tối đa ở 25% mẫu khảo sát bị nhiễm các loại thuốc này

Eung-Sun Lee và các cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp LC – ESI - MS/MS để phân tích 52 mẫu bao gồm các sản phẩm sản xuất bất hợp pháp, thực phẩm chức năng, thuốc không có số đăng ký và dược liệu được thu mua ở phía nam Hàn quốc và thu mua qua mạng internet Kết quả thu được cho thấy 87% số mẫu thực phẩm chức năng kiểm tra có chứa thành phần chất nghiên cứu trong đó có 34%

số mẫu có chứa sildenafil trong khoảng 0,01 - 77,48 mg/liều và 81% có chứa tadalafil với nồng độ khoảng 0,3 – 52,65mg/liều Đối với các sản phẩm thuốc không

có số đăng ký, sildenafil được phát hiện trong 73% số mẫu với nồng độ trong khoảng 63,75 – 316,61 mg/liều

Năm 2015, Tiên T.K Do và cộng sự [45] sử dụng HPTLC để phát hiện 3 chất

ức chế PDE -5 (sildenafil, vardenafil, and tadalafil) và 8 chất tương tự chúng Kết quả thu được cho thấy trong 45 mẫu được khảo sát (gồm viên nén, viên nang, cafe, kẹo chewing) thì có 31 mẫu có chứa ít nhất 1 trong các chất sildenafil, tadalafil, propoxyphenyl, dimethylsildenafil hydroxyhomosildenafil

Nur Baizura Bujang và cộng sự [41] đã tiến hành kiểm tra 62 sản phẩm sử dụng

để tăng cường sinh lực nam giới được bán tại thị trường Malaysia Mẫu được lấy từ tháng 4 năm 2014 đến tháng 4 năm 2016 bao gồm 39 sảm phẩm không có số đăng

ký, 9 sản phẩm được gửi đến Cục quản lý Dược kiểm tra trước khi đăng ký, 14 sản phẩm được cơ quan quản lý thị trường thu Các sản phẩm kiểm tra được so sánh đối chiếu với thư viện phổ gồm 61 chất ức chế PDE – 5 và các chất tương tự chúng Kết quả kiểm tra cho thấy có 32 sản phẩm không có số đăng ký (chiếm 82%) và 2 sản phẩm có số đăng ký được trộn lẫn ít nhất một trong các chất ức chế PDE -5 hoặc các chất tương tự chúng

Tại Mỹ, từ năm 2007 đến năm 2017 Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm đã phát hiện ra 407 sản phẩm thực phẩm chức năng có chứa các chất ức chế PDE – 5 trong tổng số 850 sản phẩm thực phẩm chức năng bất hợp pháp [26]

Hình1.1 Biểu đồ tỉ lệ các loại thuốc trộn trái phép trong thực phẩm chức

năng tại Mỹ (từ năm 2007 – 2017)

Như vậy, tình trạng trộn trái phép các chất ức chế PDE – 5 vẫn đang diễn ra ở nhiều nơi, điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người tiêu dùng Do

đó, cần phải phát triển các phương pháp phân tích nhanh và đặc hiệu để phát hiện tân dược trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược trên thị trường

1.1.2 Tại Việt nam

Tại Việt Nam thị trường thực phẩm chức năng ngày càng phát triển, từ chỗ chỉ

có vài sản phẩm cuối thế kỉ XX đến nay số lượng thực phẩm chức năng trên thị trường đã đạt trên 7.000 với sự tham gia của khoảng 3.500 doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh thực phẩm chức năng Sự bùng nổ của thị trường thực phẩm chức năng sẽ dẫn đến nguy cơ xuất hiện các sản phẩm giả mạo mà điển hình nhất đó

là các chế phẩm đông dược được trộn lẫn tân dược nhằm tăng hiệu quả tức thì, tăng lợi nhuận Điều này rất nguy hại đến sức khỏe của người tiêu dùng vì dùng thuốc tân dược phải theo chỉ định của bác sỹ, sử dụng theo liều lượng nhất định Việc trộn tân dược vào đông dược có thể sẽ gây nên quá liều Năm 2009, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã phân tích kiểm tra 2 mẫu Supai 99 Tongkat Ali Plus do Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm gửi và một số nơi khác, kết quả 7 trong số 12 mẫu thử có trộn trái phép chất chống rối loạn cương dương nhóm ức chế phosphodiestarase-5 [6]

Năm 2010, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phát hiện chế phẩm đông dược “Viên Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng, dùng để bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lý, có trộn trái phép sildenafil (một chất ức chế men

Phosphodiestarase -5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới 98 mg/ viên Năm 2013, Cục An toàn thực phẩm (ATTP) Bộ Y tế có Quyết định số160⁄QĐ-ATTP thu hồi hiệu lực giấy chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số16047⁄2010⁄YT⁄CNTC ngày 15.12.2010 cấp cho sản phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Khải Việt Hương cảng Canh Công Phu” Nguyên nhân là vì sản phẩm này

có chứa hoạt chất sildenafil hàm lượng 4 mg/g, dù được quảng cáo trên mạng là

“100% từ thảo dược” Năm 2014, Cục An toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và tiêu hủy toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo 1 New của Công ty TNHH Thương mại dược phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên) và sildenafil (123 mg/viên) Gần đây, sản phẩm “Avena plus” của công

ty TNHH MTV đầu tư và thương mại xuất nhập khẩu Việt Nam Canoves và sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Uy Mãnh Nang của Công ty TNHH Xuất Nhập khẩu Thiết bị Y tế Minh Bang Việt Nam đã bị Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia phát hiện có chứa sildenafil và cục An toàn thực phẩm đã có quyết định tạm dừng lưu thông, thu hồi lô 2 sản phẩm trên

Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược rất khó phát hiện, vì trong đông dược có rất nhiều thành phần, các phương pháp phát hiện đều đòi hỏi máy móc thiết

bị hiện đại mới chiết tách được thành phần và tốn chi phí nhiều Do vậy, cần có một

hệ thống các phương pháp phát hiện nhanh chóng, hiệu quả cao tại các trung tâm kiểm nghiệm trên toàn quốc

1.2 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu

1.2.1 Chất ức chế PDE – 5

Chất ức chế PDE - 5 dùng trong điều trị rối lọan cương dương là chất ức chế cạnh tranh, chọn lọc trên PDE-5 (là men có nhiều ở thể hang dương vật) Khi có kích thích tình dục, nitric oxid từ các dây thần kinh, tế bào nội mô mạch máu, sẽ phóng thích vào thể hang làm giãn các mạch máu và thể hang dương vật gây hiện tương cương dương Chất ức chế PDE-5 sẽ ngăn chặn quá trình phân hủy cGMP, từ

đó làm tăng cường tác dụng giãn mạch của nitric oxid và khôi phục khả năng cương của dương vật ở những bệnh nhân bị rối lọan cương dương.[20]

Cơ chế hoạt động của nhóm thuốc ức chế PDE-5[20]:

Sau giai đoạn kích thích tình dục, nitric oxid (NO) được tăng sản sinh từ tế bào thần kinh hoặc tế bào nội mô mạch máu Điều này làm tăng quá trình chuyển hóa guanosine triphosphate (GTP) thành cyclic guanosine monophosphate (cGMP), làm giãn các mạch máu ở thể hang tạo điều kiện cho quá trình cương cứng PDE-5

là một enzyme phân hủy cGMP, vì vậy các chất ức chế PDE-5 sẽ ngăn cản quá trình thủy phân cGMP, làm tăng tác dụng giãn mạch của NO, làm tăng cường khả năng cương dương cho các bệnh nhân bị rối loạn cương dương

Hình1 2 Sơ đồ biểu diễn cơ chế tác dụng của chất ức chế PDE-5

Sildenafil, tadalafil và vardenafil là 3 hoạt chất có khả năng ức chế PDE-5 nên được sử dụng để điều trị rối loạn cương dương Ngoài ra, sildenafil và tadalafil còn được sử dụng để cải thiện khả năng vận động ở người trưởng thành khi có triệu chứng tăng huyết áp động mạch phổi (pulmonary arterial hypertension – PAH: áp lực máu cao trong mạch máu đến phổi là gây ra khó thở, chóng mặt, mệt mỏi) Sildenafil và tadalafil điều trị chứng PAH bằng cách giãn mạch phổi và giúp máu lưu thông dễ dàng hơn

Dù ba chất này có cùng cơ chế hoạt động, nhưng do sự khác biệt về cấu trúc phân tử (sildenafil và vardenafil có cấu hóa học tương đối giống nhau nhưng tadalafil lại rất khác) dẫn đến sự khác nhau về dược động học và hiệu quả lâm sàng Tadalafil có thời gian tác dụng kéo dài hơn, ít tác dụng phụ hơn và quá trình hấp thu không bị ảnh hưởng bởi thức ăn

Tế bào thần kinh hoặc nội

mô mạch máu

Ba chất này thuộc chung nhóm chất gọi là nhóm chất ức chế phosphodiesterase 5(PDE – 5), có nhiều tác dụng phụ và là những thuốc phải kê đơn và khi sử dụng phải được sự giám sát chặt chẽ của bác sĩ điều trị

1.2.2 Sildenafil

Hình1 3 Cấu trúc hóa học của Sildenafil citrat

Công thức: C22H30N6O4S.C6H807

Phân tử lượng: 666,7g/mol

Tên khoa học: 1-[4-ethoxy-3-(6, 7 dihydro-1-methyl-7-oxo-3-propyl-1H-pyrazolo [4, 3-d][30] pyrimidin-5-yl) phenylsulfonyl]-4-methylpiperazine citrate

 Tính chất: Bột kết tinh trắng đến trắng xám nhạt, không mùi, vị đắng, không

tan trong nước và ethanol, tồn tại dưới dạng muối với acid citric[31]

 Chỉ định: Rối loạn cương dương và tăng huyết áp động mạch phổi

 Liều dùng: đối với người lớn

- Rối loạn chức năng cương dương: đường uống 50 mg/ngày x uống trước 1 giờ (dao động từ 30 phút đến 4 giờ) khi có nhu cầu tình dục Liều dao động từ 25 -

giảm hoặc mất thính giác đột ngột, chóng mặt, đầu lâng lâng, ngất xỉu, tức ngực, khó thở, dương vật cương cứng, đau đớn kéo dài hơn 4 giờ, ngứa hoặc nóng rát khi tiểu, phát ban [44]

Phân tử lượng: 389,4 g/mol

Tên khoa học: methyl-pyrazino [1’,2’:1,6] pyridol[3,4-b]indole-1,4-dione

(6R-12αR)-6-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2,3,6,7,12,12α-hexahydro-2- Tính chất

Bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong nước, tan không đáng kể trong

methanol aceton và ethanol [31]

 Chỉ định

- Rối loạn cương dương

- Tăng huyết áp động mạch phổi

Các tác dụng phụ thường gặp là: đau đầu; khó tiêu hoặc ợ nóng; buồn nôn; tiêu chảy; đau ở bụng, lưng, cơ bắp, tay và chân; ho Ngoài ra có thể gặp một số tác dụng phụ nghiêm trọng khác như: giảm đột ngột hoặc mất thị lực; mờ mắt; mắt không phân biệt được màu (mù màu); giảm đột ngột hoặc mất thính lực; ù tai; cương cứng kéo dài hơn 4 giờ; chóng mặt; tức ngực; nổi mề đay; phát ban; khó thở hoặc nuốt; sưng mặt, cổ họng, lưỡi, môi, mắt, tay, chân, mắt cá chân, hoặc cẳng chân; phồng rộp hoặc bong tróc da [44]

1.2.4 Vardenafil

Hình1 5 Cấu trúc hóa học của vardenafil dihydroclorid

Công thức: C23H32N6O4S·2HCl

Phân tử lượng: 561.52g/mol

Tên khoa học: propyl-1H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-one;dihydrochloride

2-[2-ethoxy-5-(4-ethylpiperazin-1-yl)sulfonylphenyl]-5-methyl-7- Tính chất

Bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong nước, tan không đáng kể trong

methanol, acetone và ethanol[31]

 Chỉ định

- Rối loạn cương dương

- Tăng huyết áp động mạch phổi

Nhức đầu, đỏ bừng mặt, xung huyết mũi, khó tiêu, thay đổi thị giác, nhìn mờ Trong một số trường hợp gây cứng cơ và cương kéo dài hoặc cương đau[44]

 Một số biệt dược

Cialis 20mg, Cialis 10mg, Cialis 5mg, Adcirca…

1.3 Tổng quan về phương pháp phân tích

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật cho phép tách được hỗn hợp nhiều cấu tử với độ nhạy cao, tốc độ phân tích nhanh (có thể phân tích hàng loạt mẫu) Chính vì vậy mà hiện nay TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ khác nhau

TLC là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [2]

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxyd

Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2-3 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân

tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng có vị trí khác nhau trên bản mỏng[2] Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị

số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động[2],[1]

Rf = dR /dM

dR :Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát), thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn, phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả [2]

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến của TLC HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng

và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán

tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ

do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình

khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy scan và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [18]

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC [18]

Ưu điểm của HPTLC:

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng, do UV scanner có thể ghi lại phổ hấp thụ của chất, nên định tính đặc hiệu hơn so với TLC thông thường, và định lượng chính xác hơn so với chụp ảnh và đo mật độ màu của vết

- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ

ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu

Nhược điểm của HPTLC:

- Nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa dạng ,các thành phần trong dược liệu có thể xuất hiện tại vị trí phát hiện chất phân tích nên có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả khi phương pháp sử dụng không đáp ứng về

độ nhạy

1.3.3Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt

1.3.3.1 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman

Khi chiếu photon có tần số ν0 tới một phân tử, photon bị tán xạ theo tất cả các hướng Tán xạ này xảy ra do va chạm giữa các photon có tần số ν0 và các phân tử Tán xạ có thể là đàn hồi hoặc không đàn hồi Trong trường hợp tán xạ đàn hồi, các photon bị tán xạ có cùng tần số ν0 với photon tới (trường hợp này được gọi là tán xạ Rayleigh), xác suất xảy ra quá trình này là lớn Một số lượng nhỏ của photon tới tương tác với liên kết của phân tử Các tương tác này là không đàn hồi, sau va chạm

có trao đổi năng lượng giữa photon và liên kết làm thay đổi trạng thái dao động liên kết Các tán xạ này gọi chung là tán xạ Raman Nếu phân tử nhận năng lượng từ photon tới thì tần số của photon tán xạ là ν0 - ν (tán xạ này gọi tán xạ Stokes) Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng từ phân tử thì tần số của photon tán xạ là

ν0 + ν (tán xạ này gọi là tán xạ đối Stokes)

Tán xạ Stokes xảy ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với phân tử ở trạng thái kích thích Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái cơ bản nên tán xạ Stokes dễ xảy ra và chiếm đa số Vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes.[8]

1.3.3.2 Phổ Raman tăng cường bề mặt SERS (Surface enhanced Raman spectroscopy)

Quang phổ học Raman đã được phát triển từ thế kỷ XIX và trở thành một công

cụ quan trọng trong các phòng thí nghiệm phân tích hóa học, khoa học vật liệu, y- dược, sinh học…Đối với mỗi một chất, phổ Raman là đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau Vì vậy, phổ Raman được xem là phổ vân tay để xác định chất phân tích Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tín hiệu yếu và có hiện tượng phát huỳnh quang khi mẫu đo được kích thích bởi nguồn có bước sóng phù hợp, gây khó khăn khi phân tích mẫu ở nồng độ thấp Hiệu ứng tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) được phát hiện vào năm 1970 nhờ đó tín hiệu Raman được tăng lên nhiều

lần (106 -108 lần) Từ đó đến nay SERS đã được nghiên cứu cả về lý thuyết và thực nghiệm để trở thành một phương pháp quang phổ học mới Hiện nay, quang phổ Raman tăng cường bề mặt SERS đang được nghiên cứu, phát triển mạnh mẽ ở các phòng thí nghiệm tiên tiến trên thế giới Lý do là bên cạnh việc tìm hiểu cơ chế của hiệu ứng SERS còn nhiều tranh luận cần làm sáng tỏ, SERS có khả năng ứng dụng như là một cảm biến Raman cực nhạy để phân tích định tính, định lượng các phân

tử hữu cơ, vô cơ trong các lĩnh vực hóa học, địa chất, y-sinh…[12],[13], [28] Sự khác biệt chính giữa kỹ thuật đo phổ Raman và SERS là sự bổ sung của một lớp kim loại có kích thước nano, cho phép tăng cường cường độ tán xạ đến 106, do đó cải thiện được về độ nhạy Phổ đồ của một hợp chất là duy nhất, do đó phương pháp này được sử dụng như một kỹ thuật để định tính phân biệt, nhận dạng

SERS đã được quan sát đối với các phân tử bám trên bề mặt thô ráp của một số kim loại với các môi trường vật lý và hình thái khác nhau Sự tăng cường mạnh nhất quan sát được trên bề mặt kim loại có độ nhám vào cỡ thang nano (10 – 100nm) và phụ thuộc vào hình dạng hạt (hình 1.6)

Hình1 6 Sơ đồ nguyên lý của SERS

Hai cơ chế được cho là tạo ra sự tăng cường trong tín hiệu Raman đó là cơ chế tăng cường điện từ và cơ chế hoá học [32]

SERS sử dụng một bề mặt kim loại gồ ghề thường được làm bằng Ag, Au, Cu (các phân tử Ag … như là các phân tử keo dính) Các phân tử của mẫu cần đo được hấp phụ trên bề mặt kim loại này Dưới sự kích thích của ánh sáng tới, các điện tử

tự do trên bề mặt kim loại sẽ bị kích thích và dao động tập thể với các lõi ion kim loại Tập hợp tất cả các dao động này sẽ phát ra một trường lưỡng cực Khi các

trường lưỡng cực này cộng hưởng với tần số của ánh sáng tới sẽ gây ra sự tăng cường trường điện từ cục bộ trên bề mặt kim loại và trường này nhanh chóng thoát

ra khỏi bề mặt kim loại Do đó, tín hiệu Raman của các chất phân tích hấp phụ trên

bề mặt kim loại hoặc nằm gần các bề mặt này cũng sẽ được tăng cường Như vậy cơ chế tăng cường điện từ liên quan đến độ nhám bề mặt kim loại và khoảng cách giữa các chất phân tích với bề mặt kim loại [22],[24]

Gây ra do sự tương tác giữa các phân tử chất hấp phụ và các kim loại, thường liên quan đến hiệu ứng điện tử như sự truyền điện tích Những hiệu ứng này có thể dẫn đến tăng cường phổ Raman cộng hưởng nếu sự hấp phụ của phân tử tới bề mặt thay đổi sự hấp thu quang học tối đa gần hơn với tia laser tới Trong khi sự tăng cường điện từ áp dụng cho tất cả các chất phân tích thì sự tăng cường hóa học lại phụ thuộc vào chất phân tích và yêu cầu một số loại liên kết với bề mặt kim loại [22]

Do việc tăng cường hóa học và tăng cường điện từ trường rất nhạy với một số biến bao gồm cả chất dùng làm đế (đế SERS), kích thước, hình dạng hạt kim loại, bước sóng laser, bản chất tương tác của đế SERS và chất hấp phụ nên đế SERS cần được thiết kế và tối ưu hóa Các đế SERS được đề xuất để phân tích hóa học đều chú ý đến việc chuẩn bị, khả năng tăng cường, khả năng tái sinh và tính ổn định Cho đến nay, gần như tất cả các vật liệu phân tích SERS được làm từ bạc hoặc vàng, với đa số được chế tạo từ bạc [37],[24]

1.3.3.3 Dung dịch keo sử dụng cho SERS

Các đế SERS là các bề mặt kim loại quý (Au, Ag…) có độ ráp thích hợp ở kích thước nano, ví dụ tạo bởi các hạt nano, thanh nano, dây nano Au/Ag, các cấu trúc nano dạng lá, hoa…Tín hiệu phổ Raman của các chất phân tích hấp phụ trên bề mặt các đế SERS này sẽ được tăng cường nhờ tổ hợp của các hiệu ứng điện từ và hóa học Đến nay đã có nhiều nghiên cứu chế tạo các đế SERS bằng các phương pháp khác nhau phục vụ cho phép đo phổ Raman như: Các bề mặt kim loại gồ ghề; huyền phù hạt kim loại nano; hệ các hạt kim loại nanô nằm cố định trên bề mặt phẳng; hệ các hạt kim loại nano nằm cố định trên bề mặt của một hệ dây nano trật tự; hệ các

hạt kim loại có hình dạng biến đổi (dạng lá, hoa, nhím, sao, ) Trong số các loại đế SERS, các hạt kim loại nano trong dung dịch huyền phù là đế SERS được sử dụng nhiều nhất Điểm thu hút chính của các hạt nano huyền phù là chế tạo chúng dễ dàng với chi phí thấp Các đế huyền phù hạt kim loại nano được báo cáo là có khả năng cung cấp sự tăng cường SERS lớn [34],[38],

Các nghiên cứu đã cho thấy sử dụng cấu trúc nano của Ag cho độ tăng cường cao nhất tới 1014, sử dụng các hạt nano Au cho độ thích ứng sinh học tốt nhất Khi

sử dụng cấu trúc nhánh cây của Ag để tăng cường tán xạ Raman đã cho phép nhận biết được thuốc kháng sinh ở nồng độ rất thấp (cỡ 20ppb) [28] Nhược điểm của việc sử dụng các hạt keo kim loại là khó bảo quản (thường phải dùng ngay sau khi chế tạo), độ lặp lại không cao Vì vậy mà hiện nay keo kim loại dùng trong SERS vẫn chưa có chế phẩm thương mại và thường được điều chế tại phòng thí nghiệm trước khi sử dụng Keo kim loại truyền thống nhất là keo bạc được tác giả Lee P.C [34] đưa ra đầu tiên vào năm 1982 và hiện nay nhiều tác giả đã tham khảo, cải tiến

để điều chế ra keo phù hợp với máy Raman của từng phòng thí nghiệm và hoạt chất nghiên cứu Tính chất của keo thường được xác định thông qua độ hấp thụ quang

UV, kích thước hạt được xác định thông qua hình ảnh đo TEM Tác giả Lee P.C đã đưa ra 3 loại keo bạc như sau :

(a) Ag2S04 (80 mg) được hòa tan trong cốc 200 ml nước nóng và sau đó trộn với 5g của PVA (Polyvinyl alcohol) hòa tan trong cốc 200 ml nước nóng Hỗn hợp này sau đó được sục với H2 ở nhiệt độ sôi gần 3 giờ Thể tích cuối cùng đã được điều chỉnh đến 500 mL

(b) 100 ml dung dịch AgNO3 5 x l0-3 M được thêm từng phần vào 300 mLNaBH4 2 x10-3 M được khuấy mạnh ở nhiệt độ thấp 50 ml dung dịch PVA 1% đã được bổ sung trong thời gian phản ứng Hỗn hợp này sau đó đã được đun sôi trong

1 h để phân hủy lượng NaBH4 dư thừa Thể tích cuối cùng đã được điều chỉnh đến

500 ml

(c) AgNO3 (90 mg) được hòa tan trong 500 ml H2O, sau đó dung dịch được đun sôi 10 ml dung dịch natri citrat 1% được thêm vào Dung dịch cuối cùng được đun sôi trong 1 giờ

Các keo Ag chuẩn bị bởi cách (a) và (b) là màu nâu và có cực đại hấp thụ ở

400 nm trong khi đó chuẩn bị bằng cách (c) là vàng lục và có cực đại hấp thụ ở 420

C nên được thực hiện Từ bảng 1.1, có thể nhận thấy, trong các kỹ thuật hay được

sử dụng trong phát hiện thuốc giả hiện nay ở Việt Nam (TLC, GC và LC kết hợp phổ UV và MS), chỉ có LC-MS là kỹ thuật đáp ứng yêu cầu nhóm A Tuy nhiên LC-MS lại chưa phổ biến nhiều, và đòi hỏi xử lý mẫu tốt, cũng như chi phí vận hành cao Kỹ thuật phổ biến hơn là TLC hay LC-DAD đều là các kỹ thuật thuộc nhóm B và C, cần kết hợp nhiều phương pháp mới có thể định tính khẳng định

Bảng 1.1 Phân loại kỹ thuật phân tích của SWGDRUG

Phổ hồng ngoại (IR) Điện di mao quản (CE) Phép nhuộm màu

Phổ khối (MS) Sắc ký khí (GC) Phổ huỳnh quang

Phổ cận hồng ngoại (NIR) Phổ trao đổi ion (IM) Miễn dịch

Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân (NMR)

Sắc ký lỏng Đo điểm nóng chảy

Phổ Raman Kiểm tra vi tinh thể Phổ UV

Định danh thuốc Sắc ký lớp mỏng Riêng cần sa : Kiểm tra vi phẫu và hình thái cây

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được SWGDRUG phân loại là một kỹ thuật loại

B và thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm pháp y như một công

cụ sàng lọc trong việc kiểm tra các chất được kiểm soát với ưu điểm nhanh chóng, không tốn kém và hiệu quả khi tách và phân tích các thành phần của hỗn hợp Đại lượng đặc trưng của TLC là Rf tuy nhiên giá trị Rf xác định sơ bộ một chất, nhưng không đặc trưng cho một hợp chất Vì vậy không thể xác định được TLC một mình, đó là lý do tại sao nó phải được kết hợp với một phương pháp xác nhận loại A

Quang phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS), về cơ bản phản ánh quang phổ Raman (nhóm A) Một phổ SERS có thể thu được một cách nhanh chóng và đặc trưng cho từng chất nên được xem là phương pháp định danh các hợp chất Do đó,

sự kết hợp giữa TLC và SERS tuân thủ đúng theo khuyến cáo của SWGDRUG Trong TLC-SERS, các chất phân tích được tách bằng TLC, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu trên một máy quét TLC ở bước sóng 254 nm Hỗn dịch keo kim loại được nhỏ trực tiếp tới mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman ngay sau khi nhỏ keo bạc (hình 1.7)

Hình 1 7 Quy trình phân tích mẫu theo phương pháp TLC-SERS

Yan Zhang và cộng sự đã thử nghiệm với điều kiện pH khác nhau để phát triển một cơ sở dữ liệu dấu vân tay SERS cho các thuốc cổ truyền Trung Quốc được hấp phụ trên các hạt nano Ag Phương pháp này có thể giúp người dùng tránh mua phải các sản phẩm có chứa các chất thêm vào không rõ ràng [48] Bên cạnh đó, Zheng Lei và cộng sự đã sử dụng các hạt nano Au hoặc Ag để thiết lập một tương quan tuyến tính giữa phát hiện SERS và nồng độ aminopyrin Giới hạn phát hiện (LOD)

là 2.50 × 10-7 M trong dung dịch nước [49] Những phương pháp này có thể giúp người dùng xác định sự hiện diện của các thành phần bất hợp pháp trong các chế phẩm thuốc cổ truyền

1.4 Một số phương pháp định tính, định lượng chất ức chế PDE - 5 trộn trong các chế phẩm nguồn gốc từ dược liệu

Bảng 1 2 Một số nghiên cứu phát hiện chất ức chế PDE – 5 trộn trái phép

trong các chế phẩm đông dược

Nền mẫu Hoạt chất Phương pháp phân tích và kết quả Tài

liệu Viên nang,

viên nén,

mật ong,

chocolate

sildenafil, tadalafil, vardenafil

HPLC

Cột C18 Pha động: acetonitril – amoni acetat 3M – acid formic 0,2%

Tốc độ dòng là 1ml/phút, thể tích bơm mẫu là 10µl và bước sóng phát hiện là 292nm

TLC Pha động : cloroform/ methanol/

LC – ESI – MS/MS

Pha đông: amoni formalic 2mM(A): acetonitril (B) Cột: C18

Điều kiện ghi phổ: số lần quét 16,

độ rộng xung 8.3 μs (lật góc 90 °), thời gian thu nhận 2,04 giây, chiều rộng quang phổ 8000

Hz Viên nang,

viên nén

Sildenafil, tadalafil, vardenafil và dẫn chất

UFLC-ESI-MS/MS

Cột Shim-Pack XR-ODS II (2,0 x

100 mm, 2,2 m) Pha động: acetonitril and dung dịch hỗn hợp (12 mmol/L HCOONH4, 0.01% acetic acid)

Tốc độ dòng: 0,4ml/phút Nhiệt độ cột 400

[40]

Sử dụng keo bạc trong nước + KI

ở nhiệt độ 60oC Mẫu tiếp tục thêm 20 ml hỗn hợp H2O- dung dịch NaOH 1N (pH=12), lắc tiếp 30 phút sau đó được chiết với 20ml ethylacetat Dịch chiết ethylacetat sau đó được thu hồi, làm bay hơi dung môi ở 60oC và cuối cùng hòa tan trong 10ml MeOH Dịch chiết MeOH được đem đi triển khai sắc ký với bản mỏng silica gel GF254 (merk), hệ dung môi khai triển là ethylacetat/n-propanol/NH3 25

%( 45:5:1) Rf của caffeine, acetaminophen, sildenafil citrat, tadalafil và vardenafil HCl lần lượt là 0,57; 0,69; 0,27; 0,77; 0,22 Bước sóng của mỗi chất phân tích là

274 nm (cafein), 248 nm (acetaminophen), 233 và 304 nm (sildenafil citrat), 236

nm và 290 nm (tadalafil) và 251 nm (vardenafil) Giới hạn phát hiện (LOD) của

cafein, acetaminophen, sildenafil citrat, tadalafil và vardenafil HCl lần lượt là 0,1475; 0,2273; 0,1346; 0,1951 và 0,2047 µg/ vết

X Hu và các cộng sự [29] đã sử dụng phương pháp TLC- SERS để phát hiện 6 chất ức chế PDE -5 là sildenafil, hydroxyhomo sildenafil, thioaildenafil, acetildenafil, vardenafil dihydrochlorid và pseudo vardenafil 0,5g mỗi mẫu tự tạo sau khi được thêm vào một lượng chính xác dung dịch chuẩn của các chất trên được chiết siêu âm với 0.5ml dung dịch methanol/H2O/amoni hydroxid (75:25:1), ly tâm trong 5 phút, lọc thu được dịch chiết Dịch chiết sau đó được tiến hành triển khai sắc ký với bản mỏng silica gel GF254, dung môi pha động là ethanol/n-hexan/amoni hydroxid (70:30:1) Bản mỏng được soi dưới đèn UV ở bước sóng 254nm để đánh dấu các vết Các vết sau đó được nhỏ hỗn hợp keo bạc trước khi tiến hành đo SERS Kết quả thu được cho thấy giới hạn phát hiện của 6 chất acetildenafil, sildenafil, hydroxyhomo sildenafil, vardenafil, Thioaildenafil và pseudo vardenafil lần lượt là 7, 5, 6, 7, 10 và 7 mg/kg Các tác giả cũng đã tiến hành

áp dụng phương pháp trên cho 50 mẫu thực thu mua ngoài thị trường gồm dạng viên nén, dạng bột thuốc, dạng viên nang Kết quả thu được cho thấy không có mẫu nào có chứa 6 chất nghiên cứu trên Các mẫu thực này cũng được kiểm tra kết quả lại bằng phương pháp HPLC để kiểm tra tính đúng của phương pháp

Như vậy, trên thế giới đã phát triển rất nhiều phương pháp để phát hiện các chất ức chế PDE – 5, từ các phương pháp đơn giản như TLC cho đến các kỹ thuật hiện đại như LC – MS/MS, GC - QQQMS[39]… còn tại Việt Nam các phương pháp được sử dụng để phát hiện các chất ức chế PDE – 5 là MS [7], LC/MS, LC-MS/MS [6], HPLC [7] Các thiết bị này đều đắt tiền và đòi hỏi quy trình xử lý mẫu nghiêm ngặt trong khi đó điều kiện cơ sở vật chất của các đơn vị tuyến dưới khó đáp ứng được Do đó, cần phải gia tăng phát triển các phương pháp phân tích đơn giản, đáng tin cậy để sàng lọc nhanh chóng mẫu Theo bảng phân loại các kỹ thuật phân tích của SWGDRUG, TLC là một kỹ thuật loại B và hình thức tiên tiến là HPTLC sẽ giúp cho việc sàng lọc nhanh các chất phân tích Trong một lần có thể phân tích được một số lượng mẫu lớn do đó rất thích hợp cho việc sàng lọc nhanh các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường

Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) là một phương pháp kết hợp một kỹ thuật phân tích loại A

và một kỹ thuật loại B sẽ giúp cho việc phát hiện nhanh và đặc hiệu các chất phân tích với độ nhạy cao Năm 2016, nhóm nghiên cứu của chúng tôi tại trường đại học Dược Hà Nội đã thực hiện xây dựng phương pháp phát hiện Glibenclamid trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược bằng TLC – SERS tuy nhiên giới hạn phát hiện vẫn còn cao mới chỉ là 10 µg/vết và phương pháp mới chỉ được tiến hành trên dung dịch chuẩn chất phân tích

Trên cơ sở đó, trong đề tài này, chúng tôi tiếp tục phát triển phương pháp TLC – SERS để phát hiện sildenafil trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược và tiến hành ứng dụng quy trình xây dựng được trên các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

a Chất chuẩn

- Sildenafil citrat hàm lượng 98,28%, số lô WS.0316265.03 (Viện Kiểm nghiệm

thuốc trung ương)

- Tadalafil hydroclorid hàm lượng 97,65 %, số lô WS 0215264.02 (Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương)

- Vardenafil hydroclorid: CAS Number: 330808-88-3 (theo tiêu chuẩn chất lượng châu âu)

b Hóa chất: Methanol, isopropanol, ethylacetat, bạc nitrat, dung dịch amoniac

25%, ether dầu hỏa…

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ Sỹ): bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển winCAT và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính

- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 của Merck (Đức)

- Cân phân tích Sartorius TE 214S (d=0,1 mg) (Đức)

- Máy lắc xoáy Labinco BV L46

- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức)

- Máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật Bản)

- Tủ sấy WiseVen WOF-105 (Hàn Quốc)

- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến

- Hệ thống quang phổ Raman, LabRam HR 800, Horiba Jobin Yvon, camera CCD, tia laser 632,8 nm (Pháp)

- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, phễu thủy tinh

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thử: 24 chế phẩm đông dược (trong đó có 22 sản phẩm có số đăng ký,

02 sản phẩm thuốc đông dược từ lương y) gồm 02 mẫu viên hoàn, 21 mẫu viên nang, 01 mẫu cao thuốc được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh lý liệt dương, tăng cường sinh lý đang lưu hành tại Việt Nam; các chế phẩm này được mua tại các nhà thuốc, qua internet, của lương y và người dùng nghi ngờ gửi đến

- Mẫu placebo: Xây dựng 3 nền mẫu có thành phần dựa trên các bài thuốc cổ

truyền Nền mẫu được bổ sung thêm tá dược và bào chế tại phòng nghiên cứu phát triển sản phẩm công ty cổ phần Traphaco

 Nền Viên nang : dựa trên bài thuốc Hoàn sâm nhung bổ thận trong Dược

điển Việt Nam IV gồm 23 vị dược liệu : ba kích, hà thủ ô chế, bách hợp, nhân sâm, bạch linh, nhục thung dung, bạch truật, nhung hươu, cam thảo, hạt sen, cao ban long, đương quy, thỏ ty tử, Câu kỷ tử, thục địa, cẩu tích, trạch tả, Củ mài, tục đoạn, đảng sâm, xuyên khung, đỗ trọng, viễn chí.[1]

 Nền viên hoàn : dựa trên bài thuốc Minh mạng thang gồm 20 vị dược liệu :

thục địa, nhân sâm, ba kích, đương quy, đỗ trọng, kỷ tử, hoàng kỳ, cúc hoa, đại táo, dâm dương hoắc, cam thảo, xa tiền tử, táo nhân, hoài sơn, nhục thung dung, xà sàng tử, viễn chí, ngũ vị tử, phá cố chỉ, liên nhục.[4]

 Nền cao thuốc: dựa trên bài thuốc Điều nguyên cứu bản thang trong Hải

Thượng Y tông tâm lĩnh gồm 6 vị dược liệu : bạch truật, hoài sơn, thục địa, thỏ ty tử, phá cố chỉ, nhục quế.[3]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng sildenafil, tadalafil, vardenafil trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC

2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của các chất nghiên cứu trong dung môi [31], căn

cứ vào kết quả của các nghiên cứu đã công bố [29], [43], [25], [15] tiến hành khảo sát khả năng chiết các chất phân tích từ nền mẫu bằng các dung môi với nhiều tỉ lệ khác nhau và lựa chọn dung môi chiết hiệu suất cao, cho vết gọn, sắc nét Các dung môi khảo sát bao gồm:

(1) : Lắc với ether dầu hỏa sau chiết bằng MeOH 100%

2.2.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 với kích thước khác nhau

Pha động : Dựa trên điều kiện của nhiều tác giả[17],[16], [43],[45], [29] tiến

hành khảo sát bằng thực nghiệm các hệ dung môi pha động sau:

- Cloroform – methanol - amoniac 25% (90 :1 :5)

- Cloroform – methanol –diethylamin (90 : 10 : 1)

- Terbutyl methyl ether –methanol–amoniac 25% (20 : 2 : 1)

- Ethyl acetat - isopropanol - amoniac 25% (45:5:1)

- Ethanol- n-hexan- amoniac (70:30:1)

với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu placebo không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu placebo thêm chuẩn.[11]

- Độ phù hợp của hệ thống: Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp

3 chất phân tích trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn Yêu cầu: diện tích pic thu được của 6 lần sắc ký lặp lại mẫu chuẩn của 3 chất phân tích đạt yêu cầu theo AOAC có giá trị RSD (%) < 3,7%

- Khoảng tuyến tính: Pha riêng dãy các dung dịch chuẩn gốc sildenafil, tadanafil, vardenaifl rồi tiến hành phân tích trên hệ thống HPTLC Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng Yêu cầu: Các đường tuyến tính đều có hệ số tương quan r ≥ 0, 99 trong khoảng nồng độ khảo sát [11]

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ): giới hạn phát hiện

là nồng độ thấp nhất có S/N khoảng 3 (tín hiệu đáp ứng của pic gấp khoảng 3 lần đường nhiễu nền), giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất có S/N khoảng 10(tín hiệu đáp ứng của pic gấp khoảng 10 lần nhiều đường nền)[10],[35]

- Độ đúng, độ chính xác: Thực hiện theo phương pháp mẫu tự tạo trên các nền mẫu placebo Thêm chuẩn ở 3 mức hàm lượng thấp, trung bình và cao của chất phân tích Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo các điều kiện đã chọn Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp được xác định dựa vào kết quả của 6 mẫu tự tạo khác nhau của cùng một mức nồng độ Yêu cầu : độ thu hồi đạt 90 – 107 % Độ chính xác trong ngày là từ 3 nồng độ trên tính RSD (%) Yêu cầu: RSD ≤ 3,7%, riêng đối với mức nồng độ cao của sildenafil yêu cầu RSD ≤ 2,7 %, với mức nồng độ thấp

của tadalafil và vardenafil yêu cầu RSD ≤ 5,3 % Độ chính xác trung gian được xác định dựa vào RSD (%) của 6 kết quả ở ngày khác ở các mức nồng độ cao, thấp, trung bình Yêu cầu : RSD ≤ 3,7%, riêng đối với mức nồng độ cao của sildenafil yêu cầu RSD ≤ 2,7 %, với mức nồng độ thấp của tadalafil và vardenafil yêu cầu RSD ≤ 5,3 % Độ chính xác trung gian làm lại ngày khác với công việc tương tự (làm lặp lại từ chuẩn bị mẫu tới phân tích) [19],[35]

2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực

Áp dụng phương pháp HPTLC vừa xây dựng được để xác định hàm lượng sildenafil, tadanafil, vardenafil được trộn trái phép trong 24 mẫu chế phẩm (gồm viên nang, viên hoàn, cao thuốc) thu thập được trên thị trường (nếu có) Dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích tính hàm lượng chất phân tích được trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Công thức tính hàm lượng chất phân tích trong các mẫu dương tính (mg/đơn

vị mẫu) :

Cthử : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử tính theo đường chuẩn (µg/ml)

mthử : khối lượng bột mẫu thử được cân (g)

Vthử : thể tích MeOH dùng để pha loãng mẫu thử (ml)

2.2.4 Xây dựng quy trình định tính sildenafil trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS)

2.2.4.1 Khảo sát các điều kiện SERS

- Chuẩn bị hỗn dịch keo bạc: tham khảo tài liệu [38],[34]chuẩn bị hỗn dịch keo bạc trong nước

- Phương pháp phân tích: tham khảo các tài liệu [50],[36] phương pháp phân tích dự kiến: dung dịch chuẩn chất phân tích pha trong methanol được tiến

hành sắc ký TLC với pha động được lựa chọn Sau khi rửa giải, tấm TLC được để làm khô tự nhiên, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu ở bước sóng 254

nm hoặc 366 nm Hỗn dịch keo bạc được nhỏ trực tiếp tới mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman khi nhỏ keo bạc

- Lựa chọn hỗn dịch keo bạc: Tiến hành khảo sát khả năng tăng cường cường độ tín hiệu Raman của các hỗn dịch keo bạc trên các điểm phân tách của chất chuẩn sildenafil sau khi đã tiến hành sắc ký TLC Lựa chọn keo bạc cho tín hiệu phổ SERS của sildenafil rõ nhất, các đỉnh đặc trưng của sildenafil không bị chồng lấp bởi tín hiệu Raman của keo bạc

- Đánh giá chất lượng và khảo sát nồng độ hỗn dịch keo: tiến hành đo kích thước hạt keo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), khảo sát cực đại hấp thụ của hỗn dịch keo bạc và khảo sát nồng độ dung dịch keo tối ưu

- Xây dựng phổ TLC-SERS của chất chuẩn sildenafil, xác định các đỉnh đặc trưng của dược chất và tỉ lệ dao động của các đỉnh đặc trưng

2.2.4.2 Đánh giá phương pháp

- Tính chọn lọc: Phân tích và ghi nhận các phổ SERS với đồng thời 3 mẫu gồm sildenafil chuẩn, mẫu placebo và mẫu placebo thêm chuẩn, với mẫu placebo ở các dạng viên nang, viên hoàn, cao thuốc Yêu cầu: trên phổ SERS của mẫu placebo thêm chuẩn có các tín hiệu đặc trưng tái lặp quanh các dịch chuyển SERS chính của chất chuẩn Phổ SERS của mẫu placebo không xuất hiện các đỉnh đặc trưng trùng với đỉnh đặc trưng của mẫu chuẩn.[19],[11]

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD): Pha dãy dung dịch chuẩn của sildenafil citrat Thêm 1 ml các dung dịch trên vào bột nền mẫu placebo với lượng khoảng 1/2 liều dùng Tiến hành phân tích theo quy trình đã chọn Giới hạn phát hiện được lựa chọn là nồng độ thấp nhất mà ở đó tín hiệu cho các đỉnh đặc trưng của sildenafil còn

rõ ràng và có S/N các đỉnh đặc trưng của sildenafil khoảng 3 (tín hiệu đáp ứng của cường độ đỉnh gấp khoảng 3 lần nhiễu nền)[19],[11]

2.2.5 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực

Áp dụng phương pháp TLC – SERS vừa xây dựng được để phát hiện sildenafil được trộn lẫn trong một số chế phẩm thu thập được trên thị trường dựa trên việc so sánh phổ của chất chuẩn và phổ của các mẫu thực (dựa vào các đỉnh đặc trưng và tỉ

lệ dao động của các đỉnh đặc trưng)

PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC

Pha riêng các dung dịch chuẩn gốc sildenafil citrat, tadalafil hydroclorid và vardenafil có nồng độ khoảng 1mg/ml trong methanol Khảo sát các hệ pha động, tiến hành trên bản mỏng silica gel 60 F254, kích thước 10x10 cm; thể tích chấm: 5

µl, bước sóng phát hiện 254 nm Kết quả thể hiện ở hình 3.1

Hình 3 1 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động, trong đó 1- Sildenafil;

2-Vardenafil; 3-hỗn hợp 3 chất phân tích; 4-Tadalafil Nhận xét:

- Hệ 1 : Cloroform – methanol - amoniac 25% (90 :1 :5) : Vết của tadalafil còn tương đối cao Vardenafil và sildenafil vẫn còn sát nhau

- Hệ 2 : Cloroform – methanol –diethylamin (90 : 10 : 1): vết của các chất vẫn còn cao, vardenafil và tadalafil không tách

- Hệ 3 : Terbutyl methyl ether –methanol–amoniac 25% (20 : 2 : 1): Vết của các chất lớn

- Hệ 4 : Ethyl acetat - isopropanol - amoniac 25% (45:5:1): Hệ tách được 3 chất tuy nhiên giá trị vết của sildenafil còn hơi thấp trong khi vết của tadalafil tương đối cao Các vết tách rời xa nhau

- Hệ 5 : Ethanol- n-hexan- amoniac (70:30:1): Không tách được 3 chất