SEMINAR CHIẾT XUẤT ALKALOID từ hà THỦ ô TRẮNG ppt _ DƯỢC LIỆU

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide dược liệu ppt dành cho sinh viên chuyên ngành dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn dược liệu bậc cao đẳng đại học chuyên ngành dược

CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN

LẬP ALKALOID

TỪ HÀ THỦ Ô TRẮNG

Streptocaulon juventas Merr

Asclepiadaceae

SEMINAR CHIẾT XUẤT

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”;

https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của hóa dược và các chế phẩm từ các hoạt chất tổng hợp hóa học thì dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên cũng đang được quan

tâm.Hơn nữa, Việt Nam với vị trí địa lý nằm trong

vùng khí hậu nhiệt đới được thiên nhiên ưu đãi với hệ sinh thái động – thực vật khá đa dạng Do đó, phát

triển các dạng thuốc có nguồn gốc dược liệu là một hướng thuận lợi và phù hợp với xu hướng tìm về tự

nhiên “back of nature” hiện nay.

Cây Hà thủ ô trắng là một loài thực vật khá

phô biến ở Việt Nam và đã được sư dụng từ lâu

đời với nhiều tác dụng chữa bệnh.

Theo kinh nghiệm của các lương y Việt Nam:

Củ Hà thủ ô trắng có tác dụng thanh nhiệt, giải

độc, chữa sốt nóng, sốt rét, cảm sốt ra nhiều

mồ hôi, bị thương sưng đau, phụ nữ ít sữa,

liều dùng 12 –20g/ ngày dưới dạng thuốc sắc, cao thuốc, rượu thuốc, thuốc hoàn; chế với Đậu đen tác dụng như Hà thủ ô đỏ.

Củ Hà thủ ô trắng có nhiều thành phân và

có chứa chất có phản ứng alkaloid chưa xác

định

TỔNG QUAN

• Bộ phận dùng: rễ đã phơi khô hay sấy khô (Radix Streptocauli)

của cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr.),

họ Thiên lý Asclepiadaceae

• Mô tả: rễ nạc hình trụ, đường kính 1-3 cm Mặt ngoài màu nâu

nhạt đến nâu xám, có nếp nhăn và rãnh dọc, có nhiều lỗ vỏ nằm ngang và những vết tích của rễ con còn sót lại Mặt cắt ngang có màu trắng ngà đến màu vàng nâu nhạt, nhìn thấy ro tầng phát sinh libe – gỗ Vị hơi đắng, có nhiều bột

• Lưu ý: Tránh nhầm lẫn với rễ Dây càng cua (Cryptolepis

buchanani Roem.et Schult.) cùng họ Thiên lý Theo Trần Công

Khánh, đã có trường hợp dùng nhầm rễ Hà thủ ô trắng với rễ Dây càng cua bị ngộ độc chết người

• Hà thủ ô trắng là loài cây dây leo bằng thân quấn dài khoảng 3-5 m, thân màu đỏ sẫm hoặc nâu nhạt Toàn cây đều có lông dày, ngắn, ngọn lông rất dày; có nhựa mủ màu trắng như sữa.

• Lá đơn, mọc đối, hình trứng ngược, dài 8–15cm, rộng 4–8 cm, đầu nhọn, mặt trên xanh thẫm ít lông, mặt dưới xanh nhạt,

lông dày, mịn

• Cụm hoa hình xim 2 ngả mọc ở kẽ lá, hoa nhỏ màu vàng

nâu.Đài có 5 răng thuôn, có lông Tràng hình chuông gồm 5 cánh hình mác dài

• Quả 2 đại chĩa ra hai bên như sừng bò, mỗi đại hình thoi dài từ 7–9cm đường kính từ 5–6mm, khi chín có màu vàng nâu Hạt dẹt, lưng phồng có chùm lông mịn ở đầu xòe ra như đuôi công

• Rễ củ phình to, dài giống củ sắn (khoai mì).Bên ngoài có một lớp vỏ nâu lồi lom, phần thịt màu trắng đến vàng nhạt, có

nhiều bột, giữa có loi Rễ có nhiều nhựa mủ và có vị đắng

Sinh thái và phân bố

• Mùa hoa tháng 7 – 9; mùa quả tháng 10 – 12.Hà thủ ô trắng

có thể sinh sản hữu tính (gieo hạt) hoặc vô tính (trồng bằng các đoạn rễ nhỏ không lấy làm thuốc)

• Hà thủ ô trắng phân bố ở các nước vùng nhiệt đới.Ở nước

ta, Hà thủ ô trắng có mặt ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam,

chủ yếu ở vùng trung du và núi thấp

• Hà thủ ô trắng là cây ưa ẩm, ưa sáng, nhưng cũng chịu

hạn, chịu bóng rất tốt, thích hợp với nhiều loại đất (trừ nơi úng ngập mặn)

Thu hái

• Thu hái rễ củ quanh năm

• Rễ đào về, rưa sạch, thái lát dày khoảng 3cm, phơi hay sấy khô Có thể ngâm nước vo gạo một đêm trước khi phơi hay sấy khô

Tổng quan về thành phần hóa

họcTheo các tài liệu: Hà thủ ô trắng có các triterpen và steroid tự

do, saponin triterpen, tannin pyrogalic, acid hữu cơ, đường khư và các hợp chất uronic Trong rễ củ có coumarin, acid béo và alkaloid chưa xác định

Từ rễ củ Hà thủ ô trắng phân lập được 3 triterpen tự do là

lupeol (lup-20-en-3β-ol), lupeol acetat (lup-20-en-3β-acetoxy)

và ursen acetat

Từ phần dịch nước còn lại của cao metanol rễ cây Hà thủ ô trắng sau khi đã chiết với CHCl3, các tác giả Bùi Xuân Hào, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan

đã phân lập được 3 hợp chất khung cardenolid và xác định cấu trúc các hợp chất này bằng các phương pháp phổ

nghiệm 3 hợp chất đó được xác định là periplogenin

glucoside, 17α– periplogenin và acovenosigenin A 3-O-

glucoside

Định tính alkaloid trong dược liệu Hà thủ ô

trắng theo DĐVN IV

Định tính bằng thuốc thử chung alkaloid

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thấm

ẩm bằng amoniac đậm đặc (TT) trộn cho thấm đều rồi cho vào bình 20 - 25 ml cloroform (TT), đặt trên cách thuỷ sôi trong 2 - 3

phút, lọc vào bình gạn qua giấy lọc đã được thấm ẩm bằng

cloroform (TT) Lắc 2 lần, mỗi lần với 5 ml dung dịch acid

hydrocloric 0,1 N (TT) Để yên cho dung dịch tách thành 2 lớp,

gạn lấy lớp acid Gộp dịch chiết acid rồi chia vào 3 ống nghiệm

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng: Silica gel GF 254, hoạt hoá ở 110oC trong 1 giờ

Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (9 : 1).

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol (TT), lắc kỹ trong 30 phút Lọc, cô dịch lọc tới còn 1 ml dùng

làm dung dịch thư

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Hà thủ ô trắng (mẫu

chuẩn), tiến hành chiết tương tự như đối với dung dịch thư

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi

dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để

khô trong không khí, phun dung dịch vanilin 1% trong acid

sulfuric (TT) Sấy bản mỏng ở 105 oC trong 3 - 5 phút Trên

sắc ký đồ của dung dịch thư phải có các vết cùng giá trị Rf và màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

• Kích thích nhẹ sự co bóp cơ trơn, co mạch ngoại vi, kích thích

hô hấp nhẹ nhưng không làm thay đổi huyết áp

• Kích thích nhu động ruột, lợi tiểu, kích thích nhẹ cơ tim, làm tăng biên độ, tần số tim nhưng ổn định

• Kích thích tiêu hóa giúp ăn ngon, tăng cân, tăng cường thể

lực

• Hạ nhiệt, tiêu viêm, an thần nhẹ, tăng thị lực

Công năng – công dụng của Hà thủ ô trắng

• Rễ có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, chữa cảm sốt, sốt rét,

ra nhiều mồ hôi, đau vùng tâm vị, sưng đau, còn dùng trị kinh nguyệt không đều, tiểu ra máu,…

• Theo tuệ tĩnh, hà thủ ô trắng được dùng phối hợp với hà thủ ô

đỏ theo tỉ lệ 1:1 trong các bài thuốc bổ máu, khí huyết

PHẦN THỰC NGHIỆM

Theo tài liệu nhóm tham khảo, tác giả tiến hành chiết hà thủ ô trắng bằng các dung môi sau:

– Chiết bằng cồn acid

– Chiết bằng MeOH

– Chiết bằng ethylacetat trong môi trường kiềm

– Chiết bằng nước acid H 2 SO 4 2%

Cô bay hơi cồn Kiềm hóa pH=12

Dịch kiềm

L

ắc với dung môi

Cắn khô

Kết quả:

Cắn thu được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng, phát hiện bằng thuốc thư Dragendoff cho vết màu vàng cam rất nhạt; phát

hiện bằng thuốc thư Vanillin-sulfuric cho các vết của

triterpen hàm lượng rất cao Do đó phương pháp này

không được lựa chọn vì hàm lượng alkaloid chiết được ít, hàm lượng triterpen lại rất cao.

Chiết bằng MeOH

400g bột dược liệu

Chiết bằng MeOH Đun hồi lưu /

BM 30 phút, lọc ( lặp lại nhiều lần đến khi

chiết kiệt

alkaloid)

Dịch chiết MeOH

C

ô bay hơi dung môi

Cắn

Hòa trong nước

acid sulfuric

2%

Dịch acid

K iềm

hóa pH=1 2

Lắc với dung môi

Cắ

n khô

Chiết bằng ethylacetat trong môi trường kiềm

Kết quả:

Cắn thu được kiểm tra với các thuốc thư đặc hiệu của alkaloid: Mayer, Bouchardat, Bertrand, Dragendoff đều cho tủa ro Cắn thu được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, phát hiện bằng thuốc thư Dragendoff có vết màu vàng cam ro Phát hiện bằng thuốc

thư Vanillin-sulfuric cho thấy có vết triterpen hàm lượng

Chiết bằng nước acid H2SO4 2%

Chiết dược liệu với acid H 2 SO 4 2%

Đun cách thủy/ BM 30 phút, lọc (Chiết nhiều lần đến khi kiệt alkaloid)

400 g bộtdược liệu

Dịch chiết nước - acid

Kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 5% tới pH=12 Lắc với CH 2 Cl 2

Cô bay hơi dung môi

Cô bay hơi dung môi

Cô thu hồi dung môi

Dịch CH2Cl2

Cao CH2Cl2

dương tính với các thuốc thư trên.

Kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng, phát hiện bằng thuốc thư

Dragendoff, phần dịch chiết có CH2Cl2 vết màu cam ro và dịch chiết ethyl acetat vết màu vàng cam nhạy, dịch chiết n-butanol không thấy hiện màu với thuốc thư

Phương pháp chiết bằng nước acid H 2 SO 4 2% thu được

hàm lượng alkaloid nhiều hơn so với các phương pháp trên

và giảm đáng kể các thành phần triterpen Do đó phương pháp chiết bằng nước acid H 2 SO 4 2% được lựa chọn

để áp dụng váo qui trình chiết alkaloid trong hà thủ ô

trắng.

Quy trình áp dụng

Cân 15kg bột dược liệu làm ẩm bằng nước acid acid H2SO4 2% trong khoảng 1 giờ Cho dược liệu đã làm ẩm vào các bình ngầm kiệt (4 bình) Thêm dung môi ngập mặt dược liệu khoảng 2-3

cm.Ngâm lạnh trong 24 giờ

Rút dịch chiết cho đến khi kiểm tra trên giấy lọc không còn vết màu vàng cam với thuốc thư Dragendorff

Dịch chiết thu được cô bay hơi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ

550C đến khi còn ½ thể tích Dịch nước acid để qua đêm thấy một lương muối kết tinh màu trắng, lọc loại muối thu được 86,5 g

muối dịch acid sau đó được kiềm hóa bằng NaOH 10% đến

pH=12 để tủa hoàn toàn alkaloid Dịch kiềm tiếp tục lắc lần lượt với dichloromethane, ethyl acetat nhiều lần cho đến khi hết

alkaloid ở từng dung môi chiết (kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng không còn màu vàng với thuốc thư Dragendorff) Cô thu hồi dung môi thu được 10 g cao dichloromethane và 8 g cao ethyl acetat

Kết quả:

Từ 15 kg bột rễ hà thủ ô trắng thu được các cao alkaloid: 10

g cao dichloromethane, 8 g cao ethyl acetat Hiệu suất chiết

lần lượt là 0.067%, 0.05%.

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN

CÁC PHÂN ĐOẠN

Từ kết quả thăm dò cho thấy hệ dung môi:

hệ CH2Cl2 – MeOH – NH4OH (9 : 0.25 : 1) cho sắc đồ đẹp, ro, các vết có Rf cách xa nhau -> hệ phân tích trên sắc kí lớp mỏng

CH2Cl2 cho Rf thấp ->sắc kí cột chân không

•

•

Cao CH2Cl2 được phân tích thành các phân đoạn đơn giản bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không với các điều kiện thực hiện như

1000C trong 1 giờ, khối lượng là 80 g

• Pha động: CH2Cl2 cố định trong suốt quá trình khai triển

• Nhồi cột: silica gel được nhồi vào cột theo phương pháp bột khô

Nén chặt khối chất hấp phụ bằng áp suất hút phía dưới cột Ổn

định cột bằng dòng dung môi chảy qua cột nhờ áp suất hút

• Nạp mẫu: mẫu nạp dạng dung dịch Khi lớp dung môi dùng để ổn

định cột còn trên mặt chất hấp phụ khoảng 1 – 2 mm thì nạp mẫu

Từ lúc nhồi cột đến khi thu được phân đoạn đầu tiên vẫn duy trì

Khai triển cột:

• Tốc độ: 1 phân đoạn/ 7 phút.

• Dụng cụ hứng: erlen 250 ml, thể tích mỗi phân đoạn là 150ml.

• Kiểm tra: các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – NH4OH (9 : 0.25 : 1), phát hiện bằng thuốc thư Dragendorff cho các vết màu

cam Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp

chung thành một phân đoạn

• Kết quả: thu được 4 phân đoạn, kí hiệu từ 1 -> 4, khối

lượng và thành phần được trình bày ở bảng sau:

Phân đoạn 1: chứa 3 alkaloid có độ phân cực vừa, kí hiệu là

A, B, C Hiện vết màu cam với tt Dragendorff trên SKLM

Phân đoạn 2: chứa 2 alkaloid kí hiệu là D, E có Rf sát nhau gần

trùng khít nhau Hiện vết màu cam với tt Dragendorff trên SKLM

Phân đoạn 3: chứa 2 alkaloid kí hiệu là E, F; hiện vết màu cam

với thuốc thư Dragendorff trên sắc kí lớp mỏng, trong đó chất E

có hàm lượng thấp thể hiện vết rất nhạt trên sắc kí đồ

Phân đoạn 4: chứa một alkaloid rất phân cực, kí hiệu là G,

hiện vết màu cam với thuốc thư Dragendorff trên SKLM

Phân đoạn Thành phần alkaloid Khối

Nhận xét:

Qua sắc kí cột chân không đã thu được môt số kết quả như sau:

• Phân đoạn 1: gồm 3 alkaloid A, B, C trong đó chất A và C chiếm chủ yếu, lượng chất B chiết rất ít, phân đoạn này còn lẫn tạp màu không xác định Sau khi cô bay hơi dung môi thu được 3.3 g cắn, màu nâu

• Phân đoạn 4: chủ yếu là alkaloid G sau khi cô bay hơi thu

được 0.5 g cắn, màu nâu Phân đoạn này cũng còn lẫn nhiều tạo phân cực

• Phân đoạn 2,3: lượng thu được khá ít mà thành phần khá phức tạp

• Vì vậy phân đoạn 1 và phân đoạn 4 được lựa chọn để phân tách tiếp các alkaloid

PHÂN LẬP CÁC CHẤT

• Phân lập các alkaloid A, B, C

• Phương pháp sắc ký cột cổ điển Pha động: CH2Cl2, sau đó là

CH2Cl2 –MeOH (20:0,2)

Kết quả: thu được 5 phân đoạn

• Phân đoạn 1.1: chủ yếu là alkaloid A phân đoạn này tương đối sạch và chất A có hàm lượng lớn, tuy nhiên vẫn có các tạp màu

đi kèm

• Phân đoạn 1.3: chứa chủ yếu alkaloid B và các tạp màu đi kèm

• Phân đoạn 1.5: chứa chủ yếu alkaloid C và các tạp màu đi kèm

• Phân đoạn 1.2 và 1.4 chứa chủ yếu tạp

Tinh chế các alkaloid phân lập được.

• Các phân đoạn có chứa alkaloid được tinh chế bằng cách lọc qua gòn bằng pipet Pasteur, sau đó kết tinh trong ethylacetat ở nhiệt độ 50C

• Phân lập alkaloid G từ phân đoạn 4

• Phương pháp cột cổ điển Pha động: CH2Cl2, sau đó tăng dần tỉ

lệ MeOH (tỉ lệ bắt đầu là 20:0,2)

Kết quả:

Từ phân đoạn 4.2 cô thu hồi dung môi được chất G (0,2g) còn lẫn một ít tạp màu, không kết tinh được do đó, alkaloid G được tinh chế qua cột SPE

Dịch sau khi qua SPE cô thu hồi dung môi, tiếp tục cho kết tinh trong EtOAc thấy xuất hiện kết tinh màu trắng, ly tâm gạn bỏ

dung môi để lấy chất kết tinh, làm khô dung môi trong tủ chân không thu được 5mg mẫu

Chất Khối lượng Cảm quan

A 0,42g Chưa kết tinh, màu vàng

B 0,3g Chưa kết tinh, màu vàng

C 1,2g Chưa kết tinh, màu vàng

G 5mg Kết tinh, màu vàng

KẾT LUẬN-NHẬN ĐỊNH

Kết luận

Từ 15 kg bột rễ hà thủ ô trắng thu được các cao alkaloid: 10 g cao dichloromethane, 8 g cao ethyl acetat Hiệu suất chiết lần lượt là 0.067%, 0.05%

Cao dichloromethane được chọn để phân phân lập các alkaloid bằng phương pháp sắc ký cột chân không Kết quả thu được 4 phân đoạn:

– Phân đoạn 1 ( chứa chủ yếu alkaloid A,B,C ) khối lượng 3,3g

– Phân đoạn 2 ( chứa chủ yếu alkaloid D,E ) khối lượng

2,0g

– Phân đoạn 3 ( chứa chủ yếu alkaloid F ) khối lượng 0,6g.– Phân đoạn 4 ( chứa chủ yếu alkaloid G ) khối lượng 0,5g

Phân đoạn 1 và phân đoạn 4 tiếp tục được phân lập bằng

phương pháp sắc ký cột cổ điển, kết quả thu được 4 alkaloid

A, B, C, G Dùng phương pháp tinh chế qua SPE, kết tinh lại trong dung môi thích hợp đã thu được các alkaloid sau:

– Alkaloid A: chưa kết tinh, màu vàng, khối lượng 0,42g– Alkaloid B : chưa kết tinh, màu vàng, khối lượng 0,3g

– Alkaloid C : chưa kết tinh, màu vàng, khối lượng 1,2g

– Alkaloid G : kết tinh màu trắng, khối lượng 5mg

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định nhờ so sánh với dữ liệu phổ học với các tài liệu tham khảo

Nhận định

• Trong các phương pháp chiết alkaloid toàn phần từ hà thủ

trắng, phương pháp chiết bằng nước acid H2SO4 2% thu được hàm lượng alkaloid nhiều hơn so với các phương pháp trên và giảm đáng kể các thành phần tạp

• Có thể phân lập các alkaloid trong hà thủ ô trắng bằng sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển và tinh chế qua cột SPE

• Kết quả nghiên cứu thành phần alkaloid trong hà thủ ô trắng

mở ra hướng đi mới nhằm chứng minh thành phần hóa học của một cây thuốc quý

• Các kỹ thuật chiết xuất và phân lập alkaloid trong hà thủ ô

trắng có thể áp dụng rộng rãi ở các cơ sở sản xuất dược phẩm

ở Việt Nam

Tài liệu tham khảo

• Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 2009.

• Đỗ Tất Lợi Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, lần thứ 7 Nhà xuất bản

Y học, Hà Nội, 836-837 (2004).

• Viện dược liệu Tài nguyên cây thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Y học Kỹ

thuật, 454-455 (1993).

• Bùi Xuân Hào, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan

Thành phần hóa học của rễ cây Hà thủ ô trắng Tạp chí phát triển Khoa học và

Công nghệ, tập 12, số 10, 72-77(2009).

• Trần Thị Kiều Loan Khảo sát thành phần alkaloid trong cây Hà thủ ô trắng

Streptocaulon juventas (Lour) Merr., họ Thiên lý Asclepiadaceae) Khóa luận

tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Y Dược Tp HCM, TP.HCM,

2007.

• Phaṃ Thanh Tâm, Trần Hùng Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol của Hà

thủ ô trắng Y học Tp.HCM, Chuyên đề nghiên cứu Khoa học Dược, 2000.

• Phạm Thanh Tâm Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ lipid huyết

của Hà thủ ô trắng Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Y Dược Tp

HCM, TP.HCM, 2002.