SEMINAR các kỹ THUẬT sắc ký điều CHẾ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN cứu dược LIỆU ppt _ DƯỢC LIỆU

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide dược liệu ppt dành cho sinh viên chuyên ngành dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn dược liệu bậc cao đẳng đại học chuyên ngành dược

CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỀU CHẾ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ

Sắc ký lớp mỏng điều chế

1 Giới thiệu chung:

Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC: preparative thin layer chromatography) là phương pháp

phân lập và tách các chất trong một lượng mẫu lớn hơn lượng mẫu trong SKLM thông thường (TLC)

Có thể sử dụng lượng mẫu từ 10mg – 1g.

Sắc ký lớp mỏng điều chế

2 Nguyên tắc:

•Tương tự với SKLM phân tích

•Trong SKLM điều chế, các chất được phân

lập trên những bản mỏng lớn hơn, dày hơn,

và thường cho vệt dài hơn là những điểm trong vùng gắn mẫu.

•Sau khi triển khai, thu hồi bằng cách cạo

lớp chất hấp phụ từ bản mỏng trong vùng quan tâm và rửa các chất phân lập được từ chất hấp phụ bằng những dung môi mạnh

•Chất thu được từ lớp mỏng có thể tinh

khiết hóa thích hợp cho việc định danh và xác định cấu

hiệu năng cao

•Các thao tác đơn giản dễ kiểm soát và áp dụng

•Giảm các tiêu chuẩn ước lượng bằng sklm

phân tích

•Khả năng thu hồi các thành phần đã phân tách

từ bản mỏng

•Khả năng chạy nhiều chất chuẩn đồng thời

trong điều kiện đồng nhất

•Lượng dung môi ít hơn

Sắc ký lớp mỏng điều chế

b nhược điểm

• Sự phân hủy các hợp chất không bền khi

tiếp xúc với không khí và ánh sáng ở bề mặt lớp mỏng

• Sự hiện diện của các chất không tinh

khiết trong bản mỏng hoặc những mảnh chất hấp phụ lẫn với mẫu thu hồi.

Sắc ký lớp mỏng điều chế

4 Pha tĩnh :

•Bề dày phổ biến của lớp mỏng là 0.5 – 2.0

mm (500 – 2000 μm)

•Kích thước bản mỏng thường khoảng

5×20, 10×20, 20×20, 20×40, hoặc đôi khi là 20×100 cm

•Thành phần: dùng các tiểu phân mịn tăng

Sắc ký lớp mỏng điều chế

5 Yêu cầu và kỹ thuật chuẩn bị mẫu, đưa mẫu lên cột:

•Trước khi tiến hành SKLM điều chế nên sử dụng SKLM

phân tích.

•Với những bản mỏng dày hơn, đĩa SKLM điều chế sẽ hút

dung môi nhanh vào các khoang trống hơn đĩa phân tích

Có thể thêm dung môi khi khai triển nhưng tránh khuấy

động chất lỏng trong bình

•Theo Kirchner, Stahl, Halpaap, hỗn hợp dung môi sẽ tăng

khả năng khai triển các chất phân cực yếu hơn và cho giá trị

Rf ban đầu thấp nhưng thành phần dung môi sẽ bay hơi sau khi khai triển với tốc độ khác nhau.

•Nếu R f <0,1 thì cần cải tiến.

•Sau khi phân lập và tách rửa, các chất chưa được phân

tách hoàn toàn có thể tiến hành lại trên bản mỏng phân tích

Sắc ký lớp mỏng điều chế

6 Cách chọn dung môi và thay đổi dung môi

trong quá trình sắc ký:

A Chọn dung môi:

•Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại

•Dung môi không quá dễ bay hơi

B Thay đổi dung môi:

•Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các hợp chất

nàygiữa chất hấp phụ và dung môi ly giải

•Thường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng

tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn 2cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha khi thay đổi nhiệt độ)

Sắc ký lớp mỏng điều chế

7 Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả:

A Phát hiện:

•Các chất hữu cơ có màu thì có thể dễ dàng nhìn

thấy bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày

•Các chất phát quang thì có thể soi dưới uv

•Chất phát hiện hóa học tốt nhất trong sklm điều chế

là hơi iod trong buồng kín Nó sẽ làm rõ các vùng

màu nâu sáng hoặc tối trên nền màu vàng sáng

•Test huỳnh quang- brom cũng phát hiện được các

Sắc ký lớp mỏng điều chế

b Thu nhận kết quả:

Với các chất nằm trong vùng được đánh dấu có thể thu được bằng cách hòa tan trong dung môi thích hợp, sau đó cô đặc mẫu thường là bằng cách bốc hơi

•Dung môi thu hồi:

•Dung môi dùng để phân lập chất lỏng nên có độ phân cực vừa đủ và có thể trộn

lẫn với các thành phần

•Không nên sử dụng methanol vì có thể hòa tan silicagel và một số tạp chất khác

•Acetone, ethanol, chloroform… là những sự lựa chọn tốt cho việc thu hồi các

chất

•Tránh dùng nước vì sẽ gây khó khăn cho việc bốc hơi khi cô đặc

Với vùng ngoài chứa các chất quan trọng

•Cạo ra cho vào giấy lọc

•Thêm một ít nước để lấy các chất trên lớp chất mang Để giảm sự mất silicagel

trong quá trình cạo có thể phun một ít cồn để làm ẩm lớp mỏng.

•Các chất cạo ra được cho vào ống, thêm dung môi, sau đó đem cho vào máy trộn

Vortex hoặc lắc bằng tay trong vòng 5 phút.

• Các chất trong ống sẽ được để lắng hoặc đem li tâm Gạn, lọc, hoặc dùng pipet

để thu những chất nổi trên bề mặt Để đảm bảo rằng silicagel được loại hoàn toàn khỏi dịch nên sử dụng loại lọc cỡ trung bình.

– Tách hydrocortisone khỏi prednisolone

– Tách papaverine, noscapine, thebaine, codeine,

SẮC KÝ CỘT

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

- Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác

nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh

- chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ -

phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân

chủ yếu của việc tách sắc ký

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

1 Nguyên tắc

- M ẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp

phụ (thường là silica gel, nhôm Oxyt).

- Cột chứa chất hấp phụ sẽ đóng vai trò là pha tĩnh.

- Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc

theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau, ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau.

- vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp phụ và bị đẩy đi

với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác

nhau.

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

2 Pha tĩnh

Silica gel (hay kieselgel của acid silicic) pha thuận:

- Là 1 chất phân cực

- Si-40, Si-60, Si80, Si-100 được dùng trong sắc ký điều

chế, Si-60 thường được sử dụng nhất

- Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề

mặt quyết định- trung tâm hấp phụ

- Cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại được

loại bỏ bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion clorid và lắng gạn để loại các hạt nhỏ lơ lửng, sau đó sấy 105 0 Cx2 giờ Không sấy quá lâu,

nhiệt độ vượt quá ngưỡng tránh làm mất nhóm

silanol→khả năng hấp phụ bị bất hoạt.

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

2 Pha động

Silicagel pha đảo:

- Có nhiều loại mẫu kỵ nước như các peptid, thì sắc ký pha đảo thường là phương pháp được lựa chọn sử dụng cột silicagel C-18 Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon

dài thường là 18C(C-18) hay 8C(C-8) Si- nối Carbon

:Si-O Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh không

phân cực , pha động phân cực.

- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→

alcol/phenol →amin→ eter/aldehyd→

cetone→hợp chất halogen→alkan

- Trong sắc ký có 3 dạng nhôm oxyd: nhôm trung

tính, acid, base.Tùy vào chất cần tách mà lựa

- Hoạt tính của nhôm oxyd tùy thuộc lượng nước

nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng nước gia tăng Trước khi dùng cần hoạt hóa bằng

cách sấy

- Oxyd nhôm phân tách tốt các chất phân cực

yếu đến trung bình, thường dùng để phân tách các hợp chất thơm

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

2 Pha tĩnh

Kieselguhr

- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại

là các oxyt kim loại.

- Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất

phân cực như đường, các triglycerid, các acid béo bậc cao, cetoacid, lacton Nhưng thường được dùng chủ yếu làm giá mang cho pha tĩnh trong sắc ký

phân bố.

Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử

- Rây phân tử thường dùng các chất như: dextran,

agarose hay poly-acrylamide( Sephadex, Sepharose, Fraktogel, Bio-gel P2…)

- Tách các hợp chất thân nước.

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

3 Pha động

- Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý

đến khả năng trộn thành hỗn hợp của các dung môi.

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

3 Pha động

Độ mạnh của dung môi

Snyder dựa trên giá trị thực nghiệm đưa ra bảng giá trị độ phân cực của dung môi

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

4 Cách thức chuẩn bị cột sắc ký

• Cột sắc ký thường là một ống thủy tinh có đường kính

từ 50mm trở lên, chiều cao từ 50cm đến 1m với 1 cái vòi ở phía dưới.

• Chiều cao cột vừa phải, càng cao thì khả năng tách càng hiệu quả nhưng nguy cơ mất mẫu càng lớn Cột được rửa sạch, sấy khô, gắn trên trên một giá vững chắc.

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

Phương pháp nhồi cột:

• Phương pháp khô: điền đầy với bột pha tĩnh khô, bổ

sung pha động khi pha tĩnh hoàn toàn ướt, và không được phép để cột khô.

• Phương pháp ướt: Một hỗn dịch tương đối loãng,

tạo từ chất hấp phụ hòa trong dung môi nền, được

đổ cẩn thận vào trong cột đã chứa một lớp dung môi nằm trên lớp bông ở đáy cột Mở khóa cột tối đa

Chú ý phải loại trừ bong bóng khí bằng cách cho từ

từ và thường xuyên vỗ nhẹ cột

SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ

Ổn định cột:

- Cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng 2 nút cao su gõ nhẹ đều quanh cột đến khi không còn bọt trong cột, mặt thoáng phẳng và không tụt xuống được nữa

- Sau khi nén cột cho dung môi chảy qua cột trong một thời gian thích hợp tùy theo kích thước để ổn định cột cột càng ổn định thì các băng tách sẽ càng phẳng và gọn.

5 Rửa giải theo Gradient

6 Ưu nhược điểm

7 Ứng dụng

- dòng chảy dung môi bị giới hạn gây ra bởi các hạt gel

nhỏ nên đã sử dụng áp lực khí (khoảng 10 - 15 psi) để điều chỉnh đẩy dung môi qua các cột của pha tĩnh

-Kết quả là sắc ký rất nhanh, có độ phân giải cao.

SẮC KÝ CỘT NHANH

2 Pha tĩnh

•Dựa vào độ phân giải của các chất mà tính lượng

silicagel phù hợp, thông thường 30-100 lần lượng mẫu

•Nếu Rf ≈0,2, cần một khối lượng dung môi ≈ 5 lần khối

lượng silica gel khô để chạy cột.

•Mật độ của silica gel bột là khoảng 0,75 g mỗi mL.

SẮC KÝ CỘT NHANH

3 Dung môi

•Tốt nhất nên tạo ra Rf ≈ 0,15 đến 0,20.

•Hệ hai dung môi có độ phân cưc lớn tốt hơn.

•Tỷ lệ dung môi xác định sự phân cực của hệ

thống dung môi và quyết định khả năng rửa giải Dung môi phân cực cao hơn tăng tốc độ rửa giải cho tất cả các hợp chất

•Dung môi phổ biến trong hệ hai dung môi

theo thứ tự phân cực ngày càng tăng là

dicloromethan / hexane, ether / hexane,

hexane / ethyl acetate, và dichloromethane / methanol Hexan / ethyl acetate có thể được

sử dụng dự phòng

SẮC KÝ CỘT NHANH

• Dựa trên độ phân cực của các thành phần cần được

phân lập, trong trường hợp độ dung môi có độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảm xuống bằng cách

hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1).

Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải:

Hexane:dichloromethane 3:1) Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc

SẮC KÝ CỘT NHANH

4 Nạp mẫu lên cột

•Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột

có thể nạp mẫu ở nồng độ gần 1% tùy theo loại silica gel

•Ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động

(Rf từ 0.04 – 0.4, CV > 1), nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả hơn rất

nhiều Khi đó thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu, hiệu năng tách sẽ cao.

SẮC KÝ CỘT NHANH

5 Rửa giải theo gradient

•Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách

các pic theo mỗi pha.

SẮC KÝ CỘT NHANH

• Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt

hơn.

•Độ phân giải trung bình (lớn hơn 0.15).

•Không tách được hỗn hợp phức tạp hay tách riêng

chất cần phân lập mà chỉ thu được các phân đoạn

chứa chất cần phân lập.

•Để thực hiện cần phải có máy bơm nén khí và một bộ

phận gồm những cột và những nắp vặn kín chuyên dụng, có kích thước từ nhỏ đến lớn Những bộ phận này tương đối đắt tiền nếu so với sắc ký cổ điển.

SẮC KÝ CỘT NHANH

7 Ứng dụng

Tách các phân đoạn đơn giản từ hỗn hợp phức tạp Sau đó đưa các phân đoạn này lên sắc ký cột cổ điển để tách thành các phân đoạn tinh khiết.

SẮC KÝ CỘT KHÔ

1 Nguyên tắc

2 Pha tĩnh

3 Lựa chọn dung môi

4 Quy trình đơn giản hóa

5 Ưu nhược điểm

6 Ứng dụng

SẮC KÝ CỘT KHÔ

1 Nguyên tắc

•Sắc ký cột khô (DDC) là một kỹ thuật sắc ký hiện đại cho phép chuyển đổi nhanh chóng và dễ

dàng các thông số hoạt động của sắc ký lớp

mỏng phân tích ( TLC) sang sắc ký cột chế hóa ( CC)

•DDC là một phương pháp sắc kí " không rửa

giải ", nghĩa là, những chất cần tách sẽ nằm lại trong cột ở cuối quá trình sắc kí Việc sử dụng  ống nilon ép mỏng cho phép dễ dàng lấy ra

những chất phân tách bằng cách cắt ống thành từng đoạn

•Dung môi chảy nhờ trọng lực

•Pha tĩnh dùng trong DDC là pha tĩnh sử dụng

trong sắc kí lớp mỏng.

Sản phẩm pH Hoạt tính Chất phát quang trọngTỷ Diện tích bề mặt

Silica for DCC 7 III 0.5 % g/ml0.5 500-600 m2/gAlumina for

DCC 7 III 0.5 % g/ml0.8 200 m2/g

SẮC KÝ CỘT KHÔ

3 Lựa chọn dung môi:

Dung môi sử dụng là hệ dung môi cho kết quả phân tách tốt nhất trong sắc ký lớp mỏng.

SẮC KÝ CỘT KHÔ

4 Quy trình đơn giản hóa:

•Sử dụng cùng 1 hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng

•Cắt 1 ống nylon theo chiều dài yêu cầu Để phân lập

1g chất liệu, cần khoảng 300 g chất hấp phụ trong

một ống 1mX740 mm (hình 2)

•Đóng ống bằng cách kéo một đầu và giữ chặt một

đầu bằng cái ấn, ghim hay đinh kẹp

•Chèn một tấm giấy nhỏ hay lót bông thủy tinh ở đáy

cột, dùng một cây kim đâm xuyên qua lỗ ở đáy cột.

•Đổ đầy cột đến ba phần tư chiều dài.

•Mẫu được dùng để phân lập nên kết hợp với một

lượng chất hấp thụ tương tự bằng ít nhất 10 lần khối lượng của nó trong một ống kiểm tra hình nón.

SẮC KÝ CỘT KHÔ

• Thêm từng centimet chất hấp thụ vào phía trên

mẫu, sau đó cho một miếng bông thủy tinh nhỏ

• Cột chặt ống bằng một kẹp trên giá.

• Mở khóa vòi của bình đựng dung môi, thêm dung

môi cho đến khi dung môi chảy đến đáy cột

Ngưng lại, chờ khoảng 30 phút (Hình 5)

• Tìm vị trí của dải phân lập bằng mắt thường, tia

UV hay tắt quang Phun thuốc thử thích hợp vào vùng tiếp xúc và so sánh với phần cột không

được xử lý để đánh dấu dải đã được phân lập.

• Đánh giá vị trí của dải trên ống nilon

• Lấy cột ra khỏi giá

• Cắt cột thành những phần theo yêu cầu

• Rửa giải những hợp chất tinh khiết từ những phần

đã cắt bằng các dung môi phân cực

•Sắc kí cột khô đã áp dụng thành công cho

những chất như thuốc nhuộm, alkaloids, và những hợp chất dị vòng khác, lipid, tinh

dầu, sesquiterpene, diterpene,

cucurbitacins, lignans, depside

SẮC KÝ LỎNG ÁP SUẤT

TRUNG BÌNH (MPLC)

SẮC KÝ LỎNG ÁP SUẤT TRUNG BÌNH (MPLC)

1 Nguyên tắc – yêu cầu của phương pháp

2 Ưu – nhược điểm phương pháp

SẮC KÝ LỎNG ÁP SUẤT TRUNG BÌNH (MPLC)

1 Nguyên tắc – yêu cầu của phương pháp:

a Nguyên tắc

SẮC KÝ LỎNG ÁP SUẤT TRUNG BÌNH (MPLC)

b Yêu cầu của phương pháp

•Một số cải tiến mới của hệ thông MPLC có thêm tiền

cột với chức năng tiền lọc, giảm áp lực làm việc cho cột chính, tăng tuổi thọ của cột, cho khả năng phân

tách tốt hơn

•Áp suất làm việc thường từ 5-20 bar, tối đa 40 bar

•Lượng mẫu thay đổi từ 0,1 – 100 gam và tốc độ dòng

thay đổi từ 5 – 200 mL/min.

•Thời gian ngắn khoảng vài giờ.

•Pha rắn sử dụng lại được=> tiết kiệm chi phí

•Thường là gia đoạn chuẩn bị mẫu cho HPLC.

b Nhược điểm:

•Tốn dung môi nhiều

- Dung môi tiêu thụ vừa phải

- Tốc độ chạy mẫu nhanh rất nhanh

- Đòi hỏi kinh nghiệm đóng gói tốt

- Khả năng tái cô đặc và tách thấp

- Chất mang cột (silicagel) không hồi

phục được

- Cần phân tích cấu trúc chất phân tách

- Chiều cao cột thay đổi được

- Kĩ thuật thấp, giá thấp

- Độ phân giải trung bình đến cao

- Kĩ thuật trung bình, yêu cầu sự tương thích của các thiết bị và cơ sở vật chất phù hợp với các thiết bị điện

- Dung môi tiêu thụ vừa phải

- Tốc độ chạy mẫu nhanh

- Cột dễ dàng đóng gói

- Khả năng cô đặc và tách cao

- Chất mang cột hồi phạc bình thường

- Cần có đầu dò UV

- Chiều cao cột cố định

- Kĩ thuật trung bình, giá trung bình