Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng được sử dụng nhiều trong định tính dược liệu và đã trở thành một trong các phương pháp quan trọng được sử dụng trong hầu hết các chuyên luận dược liệu Dược điển Việt Nam

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÍ THỊ BẢO THOA

Mã sinh viên : 1201576

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG CAO ACTISO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Ngô Minh Thúy, giảng viên bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi giải đáp những thắc mắc trong quá trình thực hiện luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Sinh viên

Phí Thị Bảo Thoa

MỤC LỤC

Table of Contents

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về actiso 3

1.1.1 Đặc điểm của actiso 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Bộ phận dùng 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Công dụng và dạng dùng 5

1.2 Tổng quan về acid chlorogenic 7

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 7

1.2.2 Tác dụng 8

1.2.3 Phương pháp xác định acid chlorogenic 8

1.3 Tổng quan về cao thuốc 10

1.3.1 Định nghĩa 10

1.3.2 Phương pháp điều chế 11

1.3.3 Yêu cầu chất lượng 12

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu sắc ký lớp mỏng 13

1.4.1 Nguyên tắc 13

1.4.2 Đại lượng đặc trưng 14

1.4.3 Pha tĩnh 14

1.4.4 Pha động 15

1.4.5 Khai triển sắc ký 15

1.4.6 Phát hiện vết trên sắc ký đồ 16

1.4.7 Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị và nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng 19

2.1.2 Hóa chất 19

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu: 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Nghiên cứu khảo sát chọn điều kiện sắc ký 20

2.2.2 Nghiên cứu phương pháp chiết acid chlorogenic trong actiso 21

2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.2.4 Ứng dụng phương pháp xây dựng định lượng acid chlorogenic trong một số mẫu thực 23

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 25

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch 25

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC 25

3.2 Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 28

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 28

3.2.2 Khảo sát thời gian chiết 29

3.3 Quy trình phân tích 30

3.3.1 Xử lý mẫu 30

3.3.2 Điều kiện sắc ký 30

3.4 Thẩm định phương pháp 31

3.4.1 Độ thích hợp của hệ thống 31

3.4.2 Độ chọn lọc 32

3.4.3 Khoảng tuyến tính 33

3.4.4 LOD - LOQ 35

3.4.5 Độ lặp lại 36

3.4.6 Độ đúng 37

3.5 Áp dụng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong một số mẫu cao actiso lưu hành trên thị trường 38

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 41

4.1 Về lựa chọn phương pháp phân tích 41

4.2 Về xây dựng phương pháp phân tích 42

4.3 Về việc thẩm định phương pháp phân tích 43

4.4 Về kết quả nghiên cứu trên mẫu thực 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 5

Phụ lục 1: Sắc ký đồ analog đường chuẩn 5

Phụ lục 2: Sắc ký đồ analog mẫu thực 7

Phụ lục 3: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện phân tích 10

Chuẩn bị mẫu 10

Điều kiện sắc ký 10

Phụ lục 4: Số liệu khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết 11

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

SKLM

UPLC

: Sắc ký lớp mỏng : Ultra performance liquid chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các mẫu cao actiso đang lưu hành trên thị trường 19

Bảng 2.2 Tên và nguồn gốc hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết 28

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết 30

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống 31

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của acid chlorogenic 33

Bảng 3.5 Kết quả xác định LOD, LOQ của acid chlorogenic: 35

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp (Mẫu CA1) 36

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 37

Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu thử 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây actiso 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid chlorogenic 7

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động 27

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của vết ứng với acid chlorogenic chuẩn 27

Hình 3.3 Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết acid chlorogenic trong cao actiso (n = 2) 29

Hình 3.4 Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống 31

Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp 32

Hình 3.6 Sắc ký đồ analog xác định tính chọn lọc của phương pháp (Mẫu CA1) 33

Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định khoảng tuyến tính của acid chlorogenic 34 Hình 3.8 Đường biểu diễn mối tương quan giữa lượng chuẩn trên vết và diện tích pic của acid chlorogenic 34

Hình 3.9: Sắc ký đồ analog của mẫu chuẩn acid chlorogenic trong xác định LOD - LOQ 35

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu thực 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăm sóc sức khỏe ban đầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng là công việc cấp bách và cần thiết Công nghiệp hóa càng phát triển nhanh thì môi trường sống càng có nguy cơ bị suy thoái, vì thế việc phòng và chữa bệnh càng trở lên cấp bách

Chữa bệnh bằng thuốc y học cổ truyền là một phương pháp có từ lâu đời ở nước ta và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò quan trọng trong nền y học nước nhà Những năm gần đây, các nước trên thế giới có khuynh hướng đẩy mạnh việc sử dụng thuốc đông y kết hợp với thuốc tây y trong điều trị một

số bệnh mãn tính Ở Việt Nam, thị trường thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc trở nên rất đa dạng về chủng loại và phong phú về nguồn gốc Công tác kiểm tra chất lượng thuốc đặc biệt là thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc

là một nhiệm vụ cấp thiết và quan trọng góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L, thuộc họ cúc

(Asteraceae), tên gọi khác là artichoke, globe artichoke (Anh); artichaut (Pháp) Actiso có rất nhiều tác dụng, một trong các tác dụng quan trọng đó là làm tăng lượng nước tiểu và lượng urê trong nước tiểu, làm giảm hằng số Ambard, giảm nồng độ cholesterol máu và urê máu Thành phần có tác dụng giảm béo phì, hạ huyết áp, kháng virus, chống ung thư đại tràng nhờ khả năng sửa chữa các tổn thương ADN trên mô hình chuột thực nghiệm là acid chlorogenic [6]

Hoạt chất acid chlorogenic trong actiso được biết đến như là một chất

có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u; chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng chống virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp Đã có một số nghiên cứu định lượng acid chlorogenic trong dược liệu bằng HPLC như Dược điển Mỹ [29], Dược điển châu Âu [17], sắc ký lớp mỏng [19], [22], [24]

được công bố Dược điển Việt Nam 4 chưa có bất kỳ một chuyên luận nào đề cập tới định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ở Việt Nam mới có công

bố định lượng acid chlorogenic trong dược liệu bằng HPLC [5]

Sắc ký lớp mỏng được sử dụng nhiều trong định tính dược liệu và đã trở thành một trong các phương pháp quan trọng được sử dụng trong hầu hết các chuyên luận dược liệu (Dược điển Việt Nam IV) Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với hệ thống thiết bị đồng bộ, hiện đại có khả năng tách tốt, độ nhạy được cải thiện và đặc biệt là hệ thống phần mềm cho phép phát hiện và định lượng các chất đã dần được đưa vào thực tế Để cung cấp một phương pháp kiểm nghiệm dược liệu nhanh, đơn giản, có độ đúng, độ chính xác đảm bảo,

có khả năng ứng dụng rộng rãi Chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”, với các mục tiêu sau:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

- Ứng dụng phương pháp HPTLC để định lượng acid chlorogenic trong một số mẫu cao actiso lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về actiso

1.1.1 Đặc điểm của actiso

Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L., thuộc họ Cúc (Asteraceae) Cây thảo lớn, sống hai năm hoặc lâu năm, cao 1 – 1,2 m, có thể

đến 2 m Thân ngắn, thẳng và cứng, có khía dọc, phủ lông trắng như bông Lá

to, dài, mọc so le, phiến lá xẻ thùy sâu và có răng không đều, mặt trên xanh lục, mặt dưới có lông trắng; cuống lá to và ngắn

Cụm hoa to mọc ở ngọn thân thành đầu màu đỏ tím hoặc tím lơ nhạt; lá bắc ngoài của cụm hoa rộng, dày và nhọn, đế cụm hoa nạc, phủ đầy lông tơ, mang toàn hình ống

Quả nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng [3], [4], [11]

Actiso là loại cây thảo sống nhiều năm Cây ưa sáng và ưa ẩm Qua thực tế nhiều năm trồng ở Việt Nam cho thấy actiso sinh trưởng phát triển tốt nhất ở một số vùng núi cao như Sa Pa, Đà Lạt nơi có khí hậu ẩm mát Cây trồng ở đây có thể cao tới hơn 1,5 m, ra hoa và kết hạt tốt Trong khi đó, cây trồng ở vùng ngoại thành Hà Nội và một vài nơi khác sinh trưởng kém hơn [4], [11]

 Acid hữu cơ bao gồm:

- Acid phenol: Cynarin (acid 1-3 dicafeyl quinic) và các sản phẩm thủy phân (acid cafeic, acid chlorogenic, acid neo chlorogenic)

- Acid alcol: acid hydroxymethylacrilic, acid malic, acid lactic, acid fumaric,…

- Acid khác: acid succinic

 Hợp chất flavonoid (dẫn chất của luteolin) bao gồm cynarosid (luteolin - 7

- D - glucopyrano - sid), scolymosid (luteolin - 7 - rutinosid) và cynarotriosid (luteolin - 7 – rutinosid - 3’ - glucosid)

 Thành phần khác:

- Cynaropicrin là chất có vị đắng thuộc nhóm guaianolid

- Enzym: oxidase, peroxidase, oxigenase, catalase Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy hoạt chất trong quá trình phơi, sấy, chế biến

- Nhiều chất vô cơ

Hoạt chất là cynarin, các flavonoid, các acid cafeic và chlorogenic có tác dụng hiệp đồng với cynarin

Gân lá chứa ít hoạt chất, đồng thời lại chiếm khối lượng lớn của lá, nền cần được loại bỏ trước khi chế biến

Trong khi chế biên, nếu phơi sấy ở 20-25oC, thời gian làm khô kéo dài, các dẫn xuất polyphenol giảm mất 40%

Nếu sấy ở 60oC, các dẫn xuất polyphenol giảm mất 80%

Nếu sấy ở 80oC hoặc 120oC, lá chỉ còn vết cynarin

Hoa chứa taraxasterol và faradiol Hai chất này thí nghiệm trên chuột nhắt có tác dụng ức chế viêm mạnh do chất 12 - O - tetradecanoyl phorbol - 13 acetat gây ra [3], [11]

T V Orlovskaya [28] đã tìm thấy 15 acid amin trong lá actiso, 9 trong số đó

là các acid amin thiết yếu: valin, threonin, methionin, isoleucin, leucin, lysin, phenylalanin, histidin, và arginin Tổng hàm lượng các acid amin thiết yếu là 4,71% (hoặc 58,29% acid amin toàn phần)

Nassar MI [23] đã xác định được 6 flavonoid và một acid phenolic từ dịch chiết methanol của búp actiso Ngoài ra, còn có 37 hợp chất khác được xác định trong dịch chiết dầu dễ bay hơi của búp actiso, phần lớn gồm mono-

và sesquiterpen

Dược điển châu Âu (EP) 8.0 qui định hàm lượng acid chlorogenic trong

lá actiso khô phải không dưới 0,8% [17]

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự đã định lượng cynarosid và scolymosid trong lá actiso Đà Lạt cho thấy hàm lượng hai hoạt chất này lần lượt nằm trong khoảng 0,34 – 0,61% và 0,17 – 0,21% [10]

1.1.5 Công dụng và dạng dùng

 Công dụng:

- Lá actiso vị đắng, có tác dụng lợi tiểu và được dùng trong điều trị bệnh phù và thấp khớp

- Cụm hoa được dùng trong chế độ ăn kiêng của bệnh nhân đái tháo đường vì nó chỉ chứa lượng nhỏ tinh bột, phần carbon hydrat gồm phần lớn là inulin

- Ngoài việc dùng đế hoa và lá bắc để ăn, actiso được dùng làm thuốc thông tiểu tiện, thông mật chữa các bệnh suy gan, thận, viêm thận cấp và mạn, sưng khớp xương Thuốc có tác dụng nhuận tràng và lọc máu nhẹ đối với trẻ

em Dạng dùng là lá tươi hoặc khô, đem sắc (5-10%), hoặc nấu cao lỏng, với liều 2-10g lá khô một ngày Có khi chế thành cao mềm hay tĩnh mạch Có thể chế thành dạng cao lỏng đặc biệt dùng dưới hình thức giọt

- Người ta còn dùng thân và rễ actiso thái mỏng, phơi khô, công dụng như

lá

- Theo Ủy ban về thảo dược của cơ quan dược phẩm châu Âu [16], actiso

và các chế phẩm từ được sử dụng cho các trường hợp suy thận, ung thư, giải độc, chứng khó tiêu, rối loạn túi mật, cholesterol cao, tăng đường huyết, vàng

da, rối loạn chức năng gan, buồn nôn (châu Âu); trị mụn trứng cá, thiếu máu, viêm khớp, xơ vữa động mạch, hen, suy giảm bài tiết mật, viêm phế quản, tiểu đường, rối loạn tiêu hoá, sốt, đầy hơi, sỏi mật, gout, xuất huyết, trĩ, cholesterol cao, tăng huyết áp, tăng đường huyết, viêm, suy thận, rối loạn chức năng gan, béo phì, viêm tuyến tiền liệt, thấp khớp, ứ nước, loét, viêm niệu đạo (Brazil); dùng actiso cho các trường hợp phù, cao huyết áp, rối loạn chức năng thận, suy gan, thiểu niệu (Haiti); …

 Dạng dùng:

- Actiso có thể được sản xuất dưới dạng trà thảo dược "Chè atisô" là một sản phẩm thương mại tại khu vực Đà Lạt của Việt Nam

- Ở các nước trên thế giới như Pháp, Đức, Hungary, Hà Lan…actiso được

sử dụng ở cả dạng chế phẩm truyền thống (như bột lá khô, dịch chiết nước, dịch chiết ethanol, lá khô…) và các dạng bào chế hiện đại (như viên nang cứng, viên nén, dung dịch uống, trà thảo dược…) [16]

Xí nghiệp Liên hiệp Dược tỉnh Lâm Đồng đã bào chế viên bao Cynaraphytol Mỗi viên chứa 0,2 g hoạt chất toàn phần lá tươi actiso tương đương với 20 mg cynarin

Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 26 ở thành phố Hồ Chí Minh đã sản xuất trà actiso túi lọc từ thân, rễ và hoa của cây actiso

Ngoài ra, còn rất nhiều các chế phẩm bảo vệ sức khỏe chứa thành phần actiso trên thị trường Việt Nam Dược liệu được bán ở dạng búp và lá

1.2 Tổng quan về acid chlorogenic

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid chlorogenic [27]

Công thức phân tử: C16H18O9

Trọng lượng phân tử: 354,31

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 1-oxo-2- propenyl[oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic

3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-Tên khác: acid 3-0-Caffeoylquinic

Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid…

Nhiệt độ nóng chảy: 210ºC [27]

Acid chlorogenic là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất

là ở 4ºC

1.2.2 Tác dụng

Acid chlorogenic có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u, chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng kháng virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp

Acid chlorogenic được ứng dụng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo đường typ 2, bệnh tim mạch…), được thương mại hóa dưới tên Sveltol (tại Anh và Na uy) Là một thành phần thêm vào thực phẩm để thúc đẩy quá trình giảm cân và dùng trong mỹ phẩm để làm đẹp [15], [19], [21]

Tất cả các nghiên cứu riêng lẻ các hợp chất trong actiso cho thấy acid chlorogenic, lutein, luteolin-7-O-glucoside có hiệu quả chống oxy hoá cao, trong đó acid chlorogenic là hợp chất chống oxy hóa mạnh nhất Hơn nữa, acid chlorogenic cho thấy hiệu quả ức chế HMG-CoA tuyến tụy mạnh, phụ thuộc liều lượng ở nồng độ từ 5 đến 50 mg/ml [20]

1.2.3 Phương pháp xác định acid chlorogenic

Schütz K đã phát triển phương pháp định tính và định lượng các hợp chất phenolic từ nước ép và bã của búp actiso bằng HPLC với detectơ mảng diod và khối phổ [25] Trong số 22 hợp chất chính, có 11 acid caffeoylquinic

và 8 flavonoid đã được phát hiện Định lượng các hợp chất riêng lẻ được thực hiện bằng hiệu chuẩn bên ngoài Apigenin 7-O-glucuronit được tìm thấy là flavonoid chính trong tất cả các mẫu được nghiên cứu Acid 1,5-di-O-caffeoylquinic là acid hydroxycinnamic chủ yếu, với 3890 mg/kg ở búp actiso

và 3269 mg/kg trong bã dược liệu, trong khi ở nước ép acid caffeoylquinic (cynarin) lại chiếm ưu thế, do sự chuyển đồng phân trong quá trình chế biến Hàm lượng phenolic toàn phần xấp xỉ 12 g/kg trên dược liệu khô cho thấy actiso là một nguồn các hợp chất phenolic triển vọng để sử dụng làm chất chống oxy hoá tự nhiên hoặc là thành phần thực phẩm chức năng

1,3-di-O-Fritsche đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột (Sephadex LH-20) kết hợp với các phương pháp phân tích (HPLC-DAD-MS và HPLC-DAD) để phân tách, định tính và định lượng các hợp chất trong actiso [20] Trong dịch chiết

lá actiso có các hợp chất sau: 8-deoxy-11-hydroxy-13-chlorogrosheimin, acid cryptochlorogenic, acid chlorogenic, acid neochlorogenic, cynarin, cynaratriol (dự kiến), grosheimin, 8-deoxy-11,13-dihydroxygrosheimin, luteolin-7-O-rutinoside, luteolin-7-O-glucoside và cynaropicrin Nồng độ acid chlorogenic trong khoảng 0,35-18,34 mg/g dịch chiết nước

Phương pháp LC-ESI-MS/MS đã được phát triển để phân tích và định lượng các dẫn xuất acid caffeoylquinic, bao gồm acid chlorogenic, acid 1,3-di-O-caffeoylquinic (cynarin) và acid 1,5-di-O-caffeoylquinic trong búp và lá actiso [14] Việc tách nhanh chóng (ít hơn 4 phút) đạt được dựa trên cột silica C18 (50 mm x 2,1 mm; 2,7 μm) Các hợp chất mục tiêu đã được phát hiện và định lượng bằng khối phổ hai lần trong chế độ giám sát đa phản ứng Khoảng tuyến tính từ 0,06 đến 2800 ng/mL đối với acid chlorogenic, 0,3-3000 ng/mL đối với cynarin và 0,24-4800 ng/mL đối với acid 1,5-di-O-caffeoylquinic Độ thu hồi trung bình dao động từ 92,1 đến 113,2% với RSD ≤6,5%

Theo Dược điển châu Âu EP 8.0 [17], acid chlorogenic trong lá và cao actiso được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy trì ở 40oC; hệ pha động là gồm A: acid phosphoric – nước (0,5:99,5), B: acid phosphoric – acetonitril (0,5:99,5) chạy theo chế độ gradient thành phần pha động, phát hiện bằng detectơ UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 40 phút Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 9,1 phút Hàm lượng acid chlorogenic yêu cầu không nhỏ hơn 0,8% tính theo dược liệu khô Cũng trong tài liệu này, phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để định tính với bản mỏng silica gel thường (hạt 5 – 40 µm) hoặc hạt nhỏ 2-10 µm, hệ dung môi pha động gồm acid formic khan – acid acetic – nước – ethyl acetat (11:11:27:100), mẫu thử lá actiso được chiết với ethanol 60% bằng cách khuấy trong 2 giờ, chất chỉ điểm được sử dụng để pha dung dịch

chuẩn gồm acid chlorogenic và luteolin – 7 – glucosid Sau khi triển khai sắc

ký, bản mỏng được sấy ở 100oC, phun thuốc thử diphenylboric acid aminoethyl ester 10 g/l trong methanol, sau đó là dung dịch macrogol 400 50 g/l trong methanol, phát hiện ở 365 nm Vết acid chlorogenic sẽ cho huỳnh quang màu xanh nhạt

Nhóm các nhà khoa học tại khoa Dược, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ actiso đạt độ tinh khiết 92,39% [8] và cynarin đạt hàm lượng 94,26% [9] Nhóm các nhà khoa học tại Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ Kim ngân hoa đạt độ tinh khiết 98,34 ± 0,66 (%) và đã đưa vào thương mại hóa phục vụ công tác kiểm nghiệm thuốc [5]

1.3 Tổng quan về cao thuốc

1.3.1 Định nghĩa

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác Cao thuốc được chia làm 3 loại:

 Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử

dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

 Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại

trong cao không quá 20%

 Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao

khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Giai đoạn II:

Cao lỏng: Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng

các phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ theo như quy ước (1

ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu) Trong trường hợp điều chế cao lỏng bằng phương pháp ngâm nhỏ giọt, tốc độ chảy cuả dịch chiết có thể chậm, vừa hay nhanh Nếu chiết xuất 1000 g dược liệu thì:

Ở tốc độ chậm: Không quá 1 ml dịch chiết/ phút,

Ở tốc độ vừa: 1 - 3 ml dịch chiết/ phút

Ở tốc độ nhanh: 3 - 5ml dịch chiết/ phút

Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 lượng dược liệu đem chiết Sau đó cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách thuỷ hoặc cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 ºC cho đến khi loại hết dung môi Hoà tan cắn thu được vào trong dịch chiết đầu đậm đặc và nếu cần, thêm dung môi vào

để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy định Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc

Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại

không quá 20% Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ

ẩm còn lại không quá 5% Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60oC Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới

áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80oC

Trường hợp muốn thu cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất bằng các phương pháp thích hợp tuỳ thuộc vào bản chất cuả dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất

Có thể cho thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ để làm chất mang hay

để cải thiện các tính chất vật lý Đối với cao khô có thể sử dụng các bột trơ thích hợp hay cao khô của dược liệu sử dụng để điều chỉnh nồng độ hoạt chất đến tỷ lệ quy định

1.3.3 Yêu cầu chất lượng

Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau đây:

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều

chế cao

Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu

sắc đã mô tả trong chuyên luân riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử

dụng Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng thuốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ

Cách tiến hành: Lấy riêng phần phía trên của chai thuốc chỉ để lại khoảng 10 -

15 ml Chuyển phần còn lại trong chai vào một bát sứ men trắng, nghiêng bát cho chúng chảy trên thành bát tạo thành một lớp dễ quan sát Quan sát dưới ánh sáng tự nhiên, thuốc phải đạt các yêu cầu quy định Nếu không đạt phải thử lại lần hai với chai khác, nếu không đạt coi như lô thuốc không đạt chỉ tiêu này

Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): Cao đặc

không quá 20% và cao khô không quá 5%

Hàm lượng cồn: Đạt 90 - 110% lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng

cho cao lỏng và cao đặc)

Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nuớc

hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu quy định trong Dược điển

Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu trong Dược điển Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu quy định về số lượng vi khuẩn

hiếu khi, vi khuẩn gây bệnh, nấm men, nấm mốc [1]

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu sắc ký lớp mỏng

1.4.1 Nguyên tắc

Sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển từ lâu Quá trình tách bằng TLC được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dích trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách

có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha động là dung môi

đơn hoặc đa thành phần [2]

1.4.2 Đại lượng đặc trưng

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là

hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di

chuyển của chất phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động

Rf = dR /dM

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát); thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu trong cùng một bản mỏng cùng một lần phân tích, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn; phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng

để đánh giá nhanh chất lượng của thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi dược liệu, do đó thích hợp cho việc xác định nhanh dược liệu [2]

1.4.3 Pha tĩnh

Pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng là các hạt có kích thước 10-30 µm được trải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5-20 cm, nhiều khi có đưa thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích [2]

Trong đó silicagel thường dùng nhất theo cơ chế sắc ký hấp phụ Các loại bản mỏng silicagel: Silicagel G : có trộn thạch cao 5%; Silicagel

H : không trộn thạch cao; Silicagel GF254 : có trộn thạch cao và chất huỳnh quang (fluorescent) [26]

1.4.4 Pha động

Pha động cho TLC thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường sắc rửa giải, thường kết hợp ít nhất 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm Sau đây là một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC :

- Dung môi cần có độ tinh khiết cao

- Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2÷0,8 đạt độ phân giải cực trị

- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-butanol-nước Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị

số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi không phân cực như methylbenzen sẽ làm tăng đáng kể trị

có độ nhớt cao, khó bay hơi) người ta đặt một tờ giấy lọc áp sát thành bình

Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô (đã bay hết dung môi) được cho vào bình sắc ký đã bão hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm còn cách bề mặt pha động khoảng 0,5 cm

Có nhiều cách khai triển sắc ký, nhưng cách thông thường là sắc ký lên

1.4.6 Phát hiện vết trên sắc ký đồ

Dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn cách phát hiện thích hợp các vết sắc ký

Sau đây là một số kỹ thuật thường gặp:

- Phun thuốc thử hiện màu: Dùng thuốc thử tạo màu với chất phân tích Đôi khi người ta làm nóng bản mỏng để tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu

- Soi dưới đèn UV: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm hoặc 366

nm Một số bản tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang

- Dùng densitometer: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới đèn UV-VIS Chất phân tích hấp thụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký [2]

1.4.7 Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng

1.4.7.1 Định tính

Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện Đôi khi do sắc ký liên tục không sắc định được tuyến dung môi pha động, người ta dụng hệ số lưu giữ tương đối Rf để đặc trưng cho chất phân

c R,

x R,d

d

R,x : Đường đi của chất phân tích (cm)

dR,c : Đường đi của chất chuẩn (cm)

1.4.7.2 Thử tinh khiết

Dùng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ Trong các Dược điển thường qui định kiểm tra tạp chất có mặt trong dược chất bằng sắc ký lớp mỏng

1.4.7.3 Định lượng:

Có hai cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:

- Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp (phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ…) Phương pháp này hiện nay ít dùng vì

có nhiều trở ngại, lại mất nhiều thời gian

- Định lượng trực tiếp trên bản mỏng :Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:

 Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang

 Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số:

Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính

Hiện nay để tăng độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường bởi vì:

- Vết sắc ký nhỏ hơn

- Thời ngan sắc ký ngắn hơn

- Lượng dung môi dùng ít hơn

Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường Tuy vậy trong kỹ thuật này – kể cả HPTLC – sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5-10% Nguồn sai

số chủ yếu ở khâu đưa mẫu lên bản mỏng [2]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị và nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

- Chất chuẩn: Acid chlorogenic hàm lượng 99,97%, lô KC.10.16-04.01 của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

- Mẫu cao Actiso: gồm 2 mẫu cao khô và 4 mẫu cao mềm

Bảng 2.1 Các mẫu cao actiso đang lưu hành trên thị trường

Kí hiệu Mẫu - Nguồn gốc

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.2 Tên và nguồn gốc hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất Độ tinh khiết (%) Nguồn gốc sản xuất

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu:

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag với detectơ, phần mềm điều khiển Wincat

- Cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ), độ chính xác 0,01mg và 0,1mg

- Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức)

- Nồi cách thủy Memmert WNB14 (Đức)

- Bản mỏng silicagel GF 254 của Merck (Đức)

- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, màng lọc mẫu (syringe filter),

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý phân tích: Mẫu được chiết theo phương pháp thích hợp, dịch chiết được định mức, lọc qua màng lọc 0,45 μm, chấm lên bản mỏng, triển khai sắc ký, ghi lại sắc ký đồ

2.2.1 Nghiên cứu khảo sát chọn điều kiện sắc ký

Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 có kích thước 5 × 10 cm; 5

×20 cm Thể tích mẫu 25 µl, phát hiện ở bước sóng 366 nm; dựa trên điều kiện sẵn có và tham khảo các tài liệu [7], [17], [30] tiến hành khảo sát bằng thực nghiệm các hệ dung môi pha động sau:

- Hệ 1: Ethyl acetat: acid acetic: nước (6:1:1) [30]

- Hệ 2: Ethyl acetat: acid acetic: acid formic: nước (10:1,1:1,1:2,7) [7]

- Hệ 3: toluen: ethyl acetat: acid formic: nước (3:12:1:1) [17]

Quét phổ ứng với vết của acid chlorogenic từ 200 – 700 nm, chọn bước sóng cho đáp ứng cao nhất để dùng trong định lượng

Lựa chọn dung môi khai triển tách được acid chlorogenic cho vết gọn, Rf nằm trong khoảng 0,2 - 0,8 và bước sóng có cực đại hấp thụ

2.2.2 Nghiên cứu phương pháp chiết acid chlorogenic trong actiso

Quy trình xử lý mẫu:

- Cân mẫu vào bình định mức, thêm dung môi chiết

- Siêu âm trong 15 phút

- Định mức đến thể tích chính xác

- Ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm

- Phun mẫu lên bản mỏng

Khảo sát điều kiện chiết:

- Dung môi chiết: sử dụng hỗn hợp dung môi methanol - nước với tỷ

lệ methanol từ 30 – 80% với C = 10%

-Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 15 phút, 30 phút

Mỗi điều kiện khảo sát tiến hành lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình Lựa chọn điều kiện chiết cho hiệu suất chiết cao

của chất phân tích trong mẫu thử phải tương đương với Rf của chất phân tích trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Sự phù hợp của hệ thống: đánh giá độ ổn định của hệ thống với

Rf và diện tích pic khi phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị, ghi lại các giá trị Rf , diện tích pic Yêu cầu: RSD của giá trị Rf không quá 2,0% và RSD của diện tích pic của acid chlorogenic phải không quá 3,0%

- Độ tuyến tính: tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X)

Xây dựng đường chuẩn 4 điểm X1 đến X4 của dung dịch chuẩn acid chlorogenic ở trong khoảng nồng độ phù hợp Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn Làm lặp lại 3 lần Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất phân tích Tính hệ số tương quan tuyến tính Yêu cầu đường hồi qui có dạng đường thẳng với r ≥ 0,99

- Độ lặp lại của phương pháp: độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Tiến hành: chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, chạy mẫu trên hệ thống HPTLC, ghi lại sắc ký đồ Xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử Yêu cầu: tại mức hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 1% tới nhỏ hơn 10%, theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp (RSD) phải ≤ 2,7%

- Độ đúng: độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn Thêm một lượng chính xác chất chuẩn thích hợp vào trong mẫu thử sao cho tổng hàm lượng chất phân tích trong dung dịch (sau khi xử lý) nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn Tiến hành phân tích theo điều kiện đã chọn Dựa vào hàm lượng acid chlorogenic đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn dịch

thử thêm chuẩn, tính được lượng acid chlorogenic thu hồi lại trong mẫu thử Yêu cầu (theo AOAC) lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng khoảng 97 – 103% với hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 1% tới nhỏ hơn 10%

- Giới hạn phát hiện - LOD: Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng) Có nhiều cách xác định LOD khác nhau nhưng trong phương pháp này sử dụng phương pháp dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể phát hiện tín hiệu của chất phân tích, xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio, trong đó

S là chiều cao tín hiệu chất phân tích

N là nhiễu đường nền)

Nhiễu đường nền được tính về hai phai của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa chiều cao

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thì lấy S/N = 3

- Giới hạn định lượng – LOQ: Giới hạn định lượng là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà ta có thể định lượng Cách xác định LOQ tương tự như LOD, tuy nhiên LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường thì lấy S/N =

* Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký (y) và lượng chất phân tích trên vết (x): y = ax+b

Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL