Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide dược liệu ppt dành cho sinh viên chuyên ngành dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn dược liệu bậc cao đẳng đại học chuyên ngành dược
Trang 1CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP
TAXOL TỪ THÔNG ĐỎ
Taxus spp.
Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay
nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”;
https://123doc.net/users/home/user_home.php?
use_id=7046916
Trang 2THỰC VẬT HỌC
Trang 3THỰC VẬT HỌC
Chemotaxonomy of Taxus
Erik L.M van Rozendaal et al.
Trang 4THỰC VẬT HỌC
Những cây thân gỗ, dạng cây bụi hoặc cây gỗ lớn, đơn tính hoặc lưỡng tính Vỏ thân màu đỏ nâu, có vảy Nhánh thẳng lên hoặc rũ xuống, nhánh non thường có màu
xanh hoặc vàng xanh, chuyển dần sang màu đỏ nâu
Trang 5THỰC VẬT HỌC
Lá mềm dẻo mọc đối nhau thành từng cặp và xoắn lệch dần từ gốc cành lên ngọn
(two-ranked leaves arrangement hay distichous phyllotaxis) Lá thuôn dài có đầu nhọn nhưng
mềm
Hạt của cây chín trong 1 mùa, màu nâu, vỏ quả dày, mọng nước màu đỏ, nhầy và bao phủ một phần hạt mở ra ở một đầu để lộ hạt cứng bên trong
Trang 6HÓA HỌC
Trang 8LỊCH SƯ
Trang 9Năm 1856, H Lucas chiết được chất
độc từ Taxus baccata – Taxine.
Năm 1956, Graf in Wurzburg chứng minh Taxine là một hỗn hợp.
Trang 11HÓA HỌC
Nhóm hoạt chất được quan tâm nhiều
nhất trong các cây thuộc chi Taxus là các
alkaloid Taxanes
Alkaloid Taxane được cấu tạo cơ bản
bởi một khung terpenoid liên kết ester
với nhánh bên là một phenylpropanoid
β-amino acid
Trang 13HÓA HỌC
Trang 18Taxol là bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, nhiệt độ nóng chảy 216 – 217 o C, không tan trong nước, tan trong c ác dung môi hữu cơ
C ác dung môi hữu cơ có thể giúp tạo ra dung dịch Taxol có nồng độ đến vài
milimolar, bao gồm các alcol như: methanol (46 mM), ethanol, t-buthanol,
isopropanol; DMSO, methylen chloride (20 mM), acetonitril (20 mM)
Về tính chất hóa học, Taxol tham gia phản ứng thủy phân ester, epimer hóa C-7, acyl hóa, oxy hóa, khử, thế ái điện tử
Trang 19HÓA HỌC
Phản ứng thủy phân yếu bởi methanol (methanolysis) của Taxol có vai trò quan trọng trong phân tích dịch chiết Phản ứng tạo ra sản phẩm là một methyl ester từ nhánh bên và 10-deacetylbaccatin III cho phần còn lại của khung diterpenoid
Do vậy, khi chiết với methanol, sẽ có một phần Taxol bị thủy phân tùy vào điều kiện kỹ thuật làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng sau cùng.
Trang 20TÁC DỤNG – CÔNG DỤNG
Trang 21ĐỘC TÍNH TAXINE
Toàn bộ các phần trên một cây thông đỏ đều có độc, ngoại trừ lớp áo hạt dày
Kể cả hạt thông đỏ cũng có độc
Ngộ độc cấp dẫn đến tử vong trong vòng 24 g không có biểu hiện triệu chứng bất thường
Ngộ độc bán cấp ghi nhận các triệu chứng gồm mất điều hòa vận động, tim
chậm, thở gấp, run cơ, ngã, co giật rồi chết.
Điểm đặc biệt của ngộ độc Taxine là nó gây ra tụt huyết áp không bù trừ được bởi hệ thành kinh giao cảm, phó giao cảm lẫn thần kinh trung ương mà chỉ có thể bằng một tác động trực tiếp lên mô cơ tim.
Trang 22TAXOL – KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ
Cơ chế độc đáo của Taxol trên tế bào được Susan Horowitz tìm ra năm 1977 cho thấy Taxol thúc đẩy quá trình hình thành các ống vi thể trong phân bào và rồi ổn định các ống vi thể đó không cho chúng phân ly tách thành tế bào mới Kết quả là tế bào kép tạo ra chết.
Trang 23TAXOL – KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ
Khả năng kháng tế bào ung thư của Taxol được sử dụng hữu hiệu trong điều trị ung thư buồn trứng, ung thư vú, ung thư phổi và Kaposi’s sarcoma
Năm 1990, Taxol được hãng dược Bristol-Meyers-Squibb (BMS) mua độc quyền với tên thương mại là TAXOL®
Trang 24CHIẾT XUẤT
Trang 25CHIẾT XUẤT
• Mục đích là chiết ra Taxine hoặc
phân đoạn có chứa Taxol
• Chiết bằng dung môi hữu cơ
• Chiết xuất lỏng siêu tới hạn
• Chiết xuất bằng phương pháp vi ba
Trang 26DUNG MÔI HỮU CƠ
• Nguyên liệu thường được xay nhỏ đến
kích thước thích hợp.
• Dung môi chọn thường là ethanol,
methylen cloride, methanol, aceton …
• Qua nhiều giai đoạn.
Trang 27DUNG MÔI HỮU CƠ
DƯỢC LIỆU TƯƠI ( 1 kg)
Chiết bằng EtOH 3 lần x 4l.
Gộp dịch chiết.
DỊCH CHIẾT EtOH
Cô bớt dung môi
DỊCH CHIẾT EtOH ĐẬM ĐẶC
(110 g)
Hòa tan vào EtOAc Chiết bằng HCl 10 %
DỊCH CHIẾT ACID
Rửa với 2 lần x 400 ml EtOAc
DỊCH CHIẾT ACID LOẠI TẠP
Trung hòa bằng Na2CO3 Chiết lại bằng EtOAc Loại nước bằng Na2SO4.
DỊCH CHIẾT TAXINES
SƠ ĐỒ 1
Trang 28DUNG MÔI HỮU CƠ
SƠ ĐỒ 2
DƯỢC LIỆU ( 2 g)
Chiết bằng MeOH 20 ml.
Lắc tại nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Ly tâm dịch loại các phần tử rắn
DỊCH CHIẾT MeOH
Cô dung môi chân không, 40 o C
DỊCH CHIẾT MeOH ĐẬM ĐẶC
(10 ml)
Thêm 10ml CH2Cl2 và 10 ml nước Phân bố đều.
DỊCH CH 2 Cl 2
Cô dung môi đến cắn Hòa lại vào MeOH.
DỊCH CHIẾT TAXINES / MeOH
Trang 29DUNG MÔI HỮU CƠ
DƯỢC LIỆU ( 10 g)
Chiết bằng MeOH 1 l.
DỊCH CHIẾT MeOH
Cô thu hồi dung môi
DỊCH CHIẾT MeOH ĐẬM ĐẶC
(125 ml)
Chiết với CH2Cl2 100 ml (30 phút) Chiết với nước 100 ml (10 h)
DỊCH CHIẾT CH 2 Cl 2
Cô thu hồi dung môi
DỊCH CHIẾT CH 2 Cl 2 ĐẬM ĐẶC
Hòa tan trong MeOH
DỊCH CHIẾT TAXINES / MeOH
PHÂN ĐOẠN CHỨA TAXOL
Đưa lên cột Silicagel.
Ổn định bằng dung môi CH2Cl2 /acetone 97:3 Rửa giài bằng CH2Cl2 /acetone 75:25
SƠ ĐỒ 3
Trang 30DUNG MÔI HỮU CƠ
SƠ ĐỒ 4
DƯỢC LIỆU ( 1 g)
Thêm 5 ml Hexane.
Để yên 24 giờ, loại Hexane.
DƯỢC LIỆU LOẠI TẠP
Thêm 5 ml acetone x 3 lần.
Lắc trong 24 h, gộp dịch chiết, lọc
Cô dung môi.
Hòa vào 5 ml MeOH.
DỊCH CHIẾT TAXINES / MeOH
Trang 31DUNG MÔI HỮU CƠ – KẾT QUẢ
Adsorption characteristics and seperation of Taxol from yew tree by NP-HPLC
Young Kwang Park et al.
SƠ ĐỒ 3
Taxus canadenis
30 µl dịch chiết cho 1,5176 µg Taxol
3 g bột nguyên liệu cho 369,355 µg Taxol
Hiệu suất chiết là 0,0123 %.
Trang 32DUNG MÔI HỮU CƠ – KẾT QUẢ
Solvent otimization on Taxol extraction from Taxus baccta L., using HPLC and LC-MS
Sadeghi-aliabadi H et al.
SƠ ĐỒ 4
Trang 33DUNG MÔI HỮU CƠ – KẾT QUẢ
Solvent otimization on Taxol extracton from Taxus baccta L., using HPLC and LC-MS
Sadeghi-aliabadi H et al.
SƠ ĐỒ 4
Trang 34CHIẾT SIÊU TỚI HẠN
Dùng Carbon dioxide ở trạng thái siêu tới hạn thâm nhập
vào nguyên liệu dạng bột để chiết xuất.
Có sử dụng đồng dung môi như ethanol, ehtylacetate,
methanol, dichloromethane, ethylether.
Đã có nghiên cứu dùng Dinito oxit để làm dung môi siêu
tới hạn.
Trang 35CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical extraction of Taxol from the bark of Taxus brevifolia
David W Jennings et al.
Trang 36CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical extraction of Taxol from the bark of Taxus brevifolia
David W Jennings et al.
Trang 37CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical fluid extraction of Paclitaxel and Baccatin III from needles of Taxus cuspidata
Moon-Kyoon Chun et al
Trang 38CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical fluid extraction of Paclitaxel and Baccatin III from needles of Taxus cuspidata
Moon-Kyoon Chun et al
Trang 39CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical fluid extraction of Paclitaxel and Baccatin III from needles of Taxus cuspidata
Moon-Kyoon Chun et al
Trang 40CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical extraction and HPLC analysis of Taxol from Taxus brevifolia unsing nitrous oxide and nitrous oxide + ethanol mixture
Vishnu Vandana et al.
331 K
Trang 41CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical extraction and HPLC analysis of Taxol from Taxus brevifolia unsing nitrous oxide and nitrous oxide + ethanol mixture
Vishnu Vandana et al.
Trang 42CHIẾT SIÊU TỚI HẠN – KẾT QUẢ
Supercritical extraction and HPLC analysis of Taxol from Taxus brevifolia unsing nitrous oxide and nitrous oxide + ethanol mixture
Vishnu Vandana et al.
Trang 43CHIẾT VI BA
Hệ thống chiết vi ba MES 1000 của CEM Corp
Khảo sát tối ưu thời gian chiết, dung môi, nhiệt độ
chiết.
Kết quả so sánh với phương pháp chiết lắc dung môi
hữu cơ truyền thống
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Trang 44CHIẾT VI BA
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Trang 45CHIẾT VI BA
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Trang 46CHIẾT VI BA
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Trang 47CHIẾT VI BA
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Trang 48CHIẾT VI BA- KẾT QUẢ
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Trang 49CHIẾT VI BA- KẾT QUẢ
Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass
M J Incorvia Mattina
Hệ thống MES 1000 của CEM Corp.
5 g nguyên liệu tươi độ ẩm 55 – 65 %
Nhiệt độ 85 độ C
Thời gian 9 phút 10 giây
Dung môi Ethanol 95% 10 ml có lắc sơ với 5 ml nước trước khi
cho dung môi
Kết quả thu được khoảng 90 % các Taxanes trong mẫu.
Trang 50PHÂN LẬP
Trang 51PHÂN LẬP
Do tính chất phức tạp của dịch chiết gồm những chất có cấu tạo tương đồng
nên phương pháp phân lập chủ yếu Taxol là HPLC ở quy mô phân tích hoặc
điều chế.
Yêu cầu cơ bản của các phương pháp phân lập là phải tách pic Taxol ra khỏi
các pic khác, đặc biệt là Cephalomannin vốn có thời gian lưu rất sít với Taxol
Nhận thấy, điều kiện thường sử dụng trong sắc ký phân lập Taxol là sắc ký
pha đảo dùng chương trình dung môi hoặc đẳng dòng
Tuy nhiên, các phương pháp phân lập Taxol với sắc ký pha thuận cũng là
một hướng phát triển bởi đặc tính sử dụng các dung môi độ nhớt thấp dễ dàng đạt được tốc độ dòng cao cũng như dễ dàng thu hồi sản phẩm
Trang 52PHÂN LẬP
Ví
dụ Cột Pha động Tốc độ dòng
Phát hiện Kết quả
1 Pha đảo C18 Altech
Gradient MeOH:Nước 58,5:41,5 MEOH: Nước 61,5:1,5 Trong 25 phút.
1,45 ml/phút PDA
227 nm
T R Taxol 19.0 phút Các pic tách nhau hoàn toàn.
2 Pha đảo C18 Altech
Gradient.
MeOH:Nước 50:50 (5’) Tăng MeOH (5’) MeOH (8’)
UV
230 nm
Đủ điều kiện định lượng
4 Pha đảo C18 Nova-Pack Isocratic Acetonitril:Nước 40:60 1 ml/phút UV
227 nm
Các pic tách nhau đủ điều kiện định lượng (Hình 3)
5 Pha thuận Zorbax SW-Taxane Isocratic Heptane:ethanol 75:25 0,7 ml/phút UV
260 nm
Đủ điều kiện định lượng.
6 Pha thuận Nova-Pack Isocratic Hexane:propanol:Methanol
96:2:2
1 ml/ phút UV
228 nm
Đủ điều kiện định lượng.
Trang 53PHÂN LẬP
Ví dụ 1: Pha đảo
Taxus brevifolia
a) Sắc ký đồ của Taxol chuẩn
b) Sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn 10-deacetylbaccatin III, baccatin III, 10-deacetyltaxol, Cephalomannine, Taxol, 7-epi-10-deacetyltaxol.
c) Mẫu dịch chiết Taxol có thời gian lưu 19,02 phút
Supercritical extraction and HPLC analysis of Taxol from Taxus brevifolia unsing nitrous oxide and nitrous oxide + ethanol mixture
Vishnu Vandana et al.
Trang 55Preparative seperation of Taxol in normal- and reversed-phase operations
Dauh-Rurng Wu et al.
Trang 56PHÂN LẬP
Ví dụ 6: Pha thuận - Taxus canadenis
Adsorption characteristics and seperation of Taxol from yew tree by NP-HPLC
Young Kwang Park et al.
Trang 57KẾT LUẬN
Phương ph áp dùng HPLC để phân lập Taxol là hiệu quả và có độ chính xác cao, giúp đạt được Taxol có độ tinh khiết cao
Bằng sự thay đổi th ành phần pha động, bản chất pha tĩnh và đặc
t ính quá trình chạy sắc ký, yêu cầu tách rõ ràng các chất trong một hỗn hợp nhiều thành phần rất tương đồng về cấu trúc (Baccatin III, Cephanomannine và Taxol) là có thể dễ dàng đạt được.
Tuy nhiên, c ác phương pháp chiết xuất và phân lập Taxol dù đạt được độ tinh khiết cao nhưng hiệu suất thu được qua nhiều phương
ph áp vẫn không có đột phá Về căn bản, đó là do bản thân hàm lượng Taxol trong thông đỏ rất thấp ( khoảng 0,064 mg/g nguyên liệu khô) nên, bù lại, cần d ùng lượng rất lớn vỏ thân, hoặc lá để chiết đủ nhu cầu sử dụng
Với những phương ph áp đã nêu, Taxol thu được có thể thỏa mãn nhu cầu phân tích.
Trang 58KẾT LUẬN
Một cách tổng quát, phương pháp tiếp cận Taxol thông
qua chiết xuất tự nhiên đến thời điểm này đã không còn gây được nhiều hứng thú chủ yếu bởi những giới hạn về mặt
nguyên liệu Hiện nay hướng phát triển đi về bán tổng hợp, hoặc có thể trong tương lai là tổng hợp trực tiếp Taxol mới
là cách tiếp cận lâu dài, cung cấp đủ nguồn hoạt chất cho nhu cầu sử dụng trong lĩnh vực điều trị bệnh.
Trang 59TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Frank Stephenson, A tale of Taxol, website of the Florida State University, Office of research.
2 Erik L.M van Rozendaal et al., Chemotaxonomy of Taxus, Phytochemistry, 52 (1999), 427-433.
3 Hils, Matthew H.,Taxaceae, Flora of North America Editorial Committee (eds.), Flora of North America North of
Mexico, 1999, Vol 2, Oxford University Press
4 Christina R Wilson, Stephen B Hooser, Toxicity of yew (Taxus spp.) alkaloids, Veterinary Toxicology, 2007, Elsevier,
929-935.
5 Gionanni Appendino, Taxine, Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives, Vol 11, 1996, Pages 237-268.
6 David G I Kinston, The chemistry of Taxol, Pharmac Ther Vol 52, pp, 1991.
7 Sadeghi-aliabadi H et al., Solvent otimization on Taxol extracton from Taxus baccta L., using HPLC and LC-MS,
DARU, Vol 17, No.3, 2009.
8 Vishnu Vandana et al., Supercritical extraction and HPLC analysis of Taxol from Taxus brevifolia unsing nitrous
oxide and nitrous oxide + ethanol mixture, Fluid phase equilibria 116, 1996, 162-169.
9 Young Kwang Park et al., Adsorption characteristics and seperation of Taxol from yew tree ny NP-HPLC,
Seperation/Purification technology 19, 2000, 27-37.
10 Jeevan Kumar Prasain et al., Taxines from the needles of Taxus wallichiana, Phytochemistry 58, 2001, 1167-1170.
11 David W Jennings et al., Supercritical extraction of Taxol from the bark of Taxus brevifolia, The journal of
supercritical fluids, 1992, 5, 1-6.
12 S D Harvey et al., Seperation of Taxol from related Taxanes in Taxus brevifolia extracts by isocratic elution
reversed-phase microcolumn HPLC, Journal of chromatography, 587, 1991, 300-305.
13 Dauh-Rurng Wu et al., Preparative seperation of Taxol in normal- nad reversed-phase operations, Journal of
chromatography A, 702, 1995, 233-241.
14 Sang-Huyn Pyo et al., An improved HPLC process for the large scale production of Paclitaxel,
Seperation/Purification technology 76, 2011, 378-394.
15 Moon-Kyoon Chun et al., Supercritical fluid extraction of Paclitaxel and Baccatin III from needles of Taxus
cuspidata, The journal of supercritical fluids, 1996, 9, 192-198.
16 M J Incorvia Mattina et al., Microwave-assited extraction of Taxanes Taxus biomass, J Agric Food Chem., 1997,
45, 4691-4696.
Trang 60NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN
Huỳnh Xuân Lộc Huỳnh Quang Mỹ Khánh
Trần Thị Ngọc Hà Ngô Văn Cần Nguyễn Thị Thúy Ái Nguyễn Thị Ánh Hồng Nguyễn Hoàng Khải
Trang 61CẢM ƠN THẦY
VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI