Xây dựng phương pháp xác định các thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc nhóm sulfonylurea

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ OANH

Mã sinh viên : 1201450

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP

MỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

MỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :

1 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

2.Ths.NCS Đào Thị Cẩm Minh

HÀ NỘI 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh,

người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và

hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên khoa Dược

trường Đại học Y-Dược Huế, nghiên cứu sinh, người đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều

trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dược sĩ Phạm Thị Tâm – giảng viên khoa Dược trường

Đại học Y- Dược Thái Bình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các Thầy Cô giáo, các Kỹ thuật viên bộ

môn Hoá Phân Tích - Độc Chất - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ,

khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Hà Oanh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 : TỔNG QUAN _ 3

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3 Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dược hỗ trợ điều trị và điều trị tiểu đường 3 Tổng quan về nhóm sulfonylurea 6

1.1.2.1 Glipizid 6 1.1.2.2 Glimepirid _ 7 1.1.2.3 Gibenclamid _ 8 1.1.2.4 Gliclazid 9

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu _ 9 1.2.1 Sắc ký lớp mỏng _ 9

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU _ 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu _ 15 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu _ 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu _ 17

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC 17 2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu _ 17 2.2.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký _ 17 2.2.2 Thẩm định phương pháp _ 18 2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực _ 20

3.1.2.3 Khoảng tuyến tính 30 3.1.2.4 Độ đúng, độ chính xác của phương pháp 31 3.1.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng _ 34 3.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực _ 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ _ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1 Phụ lục 1

2 Phụ lục 2

1.1 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính Glipizid

1.2 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glimepirid

1.3 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glibenclamid

1.4 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính gliclazid

3 Phụ lục 3

Định lượng mẫu thực

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of

Official Analytical Chemists)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron

Microscopy) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần nền mẫu dược liệu tự tạo 16

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết của 4 chất phân tích 25

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp HPTLC 30

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính của 4 chất phân tích 31

Bảng 3.5 Đánh giá kết quả độ lặp lại và độ đúng của 4 chất phân tích 32

Bảng 3.6 Kết quả xác định LOD, LOQ của 4 chất phân tích 36

Bảng 3.7 Kết quả định lượng 4 chất trên mẫu thực 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Glipizid 6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Glimepirid 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glibenclamid 8

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Gliclazid 9

Hình 3.1 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động, trong đó 1- Gliclazid; 2-Glibenclamid; 3-Glipid; 4-Glimepirid; 5- hỗn hợp 4 chất chuẩn 21

Hình 3.2 Kết quả khảo sát hệ n- butylacetat chứa acid formic các tỷ lệ 22

Hình 3.3 Sắc kí đồ hệ n-butylacetat chứa 0,5% acid formic, sắc kí nhắc lại 24

Hình 3.4 Kết quả phổ UV của các chất phân tích: a- Glip; b- Glim; c- Glib; d- Glic 24

Hình 3.5 Kết quả khảo sát dung môi chiết 26

Hình 3.6 Sơ đồ xử lý mẫu phân tích 27

Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC :1- trắng ; 2- chuẩn ; 28

3- trắng thêm chuẩn 28

Hình 3.8 Sắc ký đồ analog của hỗn hợp hoạt chất xác định tính chọn lọc của phương pháp (a)-chất chuẩn; (b)-mẫu placebo tự tạo; (c)- hỗn hợp chuẩn trên nền mẫu placebo 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ analog xác định LOD của: a- Glip (96 ng/ vết);b- Glim (192 ng/ vết); c-Glib (192 ng/vết); d- Glic(480 ng/ vết) 35

Hình 3.10 Sắc kí đồ phân tích các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường 37

Hình 3.11 Kết quả chồng phổ mẫu âm tính 38

Hình 3.12 Kết quả chồng phổ UV các mẫu dương tính với Glibenclamid 38

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, con người có xu hướng phòng bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những bệnh mãn tính bằng những sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Các thuốc đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ (TPBVSK) có nguồn gốc tự nhiên đang là mục tiêu mà các nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên thế giới hướng tới Tuy nhiên, tình trạng tân dược được trộn trái phép trong đông dược, TPBVSK từ dược liệu đang diễn ra (thành phần có hoạt chất tân dược nhưng không công bố trên nhãn) Đái tháo đường là một bệnh mạn tính và có thể gây tổn hại nghiêm trọng cho nhiều hệ thống cơ thể trong một thời gian dài Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 422 triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới và khoảng 90% trong số đó là đái tháo đường typ II (không phụ thuộc insulin) [19] Trên thị trường dược phẩm, bốn nhóm thuốc tổng hợp chính bao gồm: sulfonylure, biguanid, thiazolidin và các thuốc khác không phải sulfonylure, được sử dụng phổ biến để điều trị tiểu đường typ II Đã có những nghiên cứu công bố thuốc giảm glucose máu thường bị phát hiện trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm đông dược như metformin, glibenclamid, gliclazid [15], [17]; Nếu sử dụng các chế phẩm này trong một thời gian dài mà không biết rõ thành phần, liều lượng người sử dụng có thể xuất hiện biểu hiện của tác dụng không mong muốn như nhiễm toan lactic, tổn thương gan thận, rối loạn tiêu hóa…[20], [21] Do đó, một nhu cầu cấp thiết nhằm phát triển một phương pháp nhanh chóng để sàng lọc các chế phẩm đông dược bị trộn lẫn các thuốc tân dược này

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong các

chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”

2

Với mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, bước đầu định lượng các thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc

ký lớp mỏng hiệu năng cao

2 Ứng dụng phương pháp này để phân tích một số mẫu chế phẩm đông dược lưu hành trên thị trường

3

Chương 1 : TỔNG QUAN Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dược hỗ trợ điều trị và điều trị tiểu đường

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chất sau đây: a) Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác; b) Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa [3]

Thuốc y học cổ truyền (bao gồm cả vị thuốc y học cổ truyền và thuốc thang) là thuốc có thành phần là dược liệu được chế biến, bào chế hoặc phối ngũ theo lý luận và phương pháp của y học cổ truyền hoặc theo kinh nghiệm dân gian thành chế phẩm có dạng bào chế truyền thống hoặc hiện đại [2]

Thuốc thành phẩm y học cổ truyền (thuốc đông y, thuốc từ dược liệu) là dạng thuốc y học cổ truyền đã qua tất cả các giai đoạn sản xuất, kể cả đóng gói và dán nhãn, bao gồm: Thuốc dạng viên, thuốc dạng nước, thuốc dạng chè, thuốc dạng bột, thuốc dạng cao và các dạng thuốc khác [2]

Mặc dù trong những năm gần đây đã có sự cải tiến của các loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp, điều trị bệnh tiểu đường vẫn không đạt được thành công rõ rệt Điều trị bệnh tiểu đường rất phức tạp do đây là bệnh mãn tính, người bệnh phải dùng thuốc cả cuộc đời, trong khi đó lại thiếu thuốc an toàn và hiệu quả, không bền vững về lâm sàng…Ngược lại, các loại thuốc thảo dược đã đạt được những thành công trong điều trị, hỗ trợ điều trị tiểu đường, đặc biệt là tính an toàn cao hơn, ít tác dụng bất lợi hơn và khả năng hạ thấp lượng đường trong máu ổn định Ở các nước phát triển, việc

4

sử dụng thuốc thảo dược cho người mắc bệnh tiểu đường được khuyến khích bởi những lo ngại về tác dụng phụ và chi phí liên quan tới việc sử dụng lâu dài các thuốc tân dược Ở Việt Nam, các thuốc đông dược và TPBVSK sử dụng hỗ trợ điều trị tiểu đường rất đa dạng Người bệnh có thể đến các nhà thuốc để mua các TPBVSK có số đăng ký, được bào chế thành dạng viên nén, viên nang hoặc trà túi lọc thuận tiện cho việc sử dụng Trong khi đó, các chế phẩm thuốc đông dược của các lương y, lương dược (không có số đăng ký) được bào chế dưới dạng viên hoàn hay thuốc bột ngoài được bán tại cơ sở chế biến còn được bán trên các trang mạng xã hội, người bệnh không cần đến tận nơi cũng có thể có được sản phẩm thuốc để sử dụng Điều này vừa

có lợi vừa bất lợi cho người bệnh, khi những chế phẩm này chưa được kiểm soát chặt chẽ có thể có những chế phẩm bị trộn lẫn tân dược mà người sử dụng không được biết

Về thành phần của các thuốc đông dược và TPBVSK hỗ trợ điều trị tiểu đường cũng rất đa dạng Các chế phẩm có thể chỉ có 1 hoặc nhiều thành phần là dược liệu Các dược liệu phổ biến nhất được sử dụng trong các chế phẩm này là dây thìa canh, khổ qua, nhàu, giảo cổ lam, sinh địa, hoài sơn…

Tuy thuốc từ thảo dược đã sử dụng lâu đời, nhưng người sử dụng có rất ít kiến thức về tính an toàn của nó Thuốc đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng Do quy định thiếu chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp không khai báo Đây cũng là vấn đề mà các cơ quan chức năng của nước ta cũng rất quan tâm Trong những năm gần đây, cùng với sự phối hợp của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc và chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược Trong đó bao gồm cả chế phẩm có và không có nguồn gốc, được sản xuất trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là các chế phẩm không có số đăng ký Các

5

chế phẩm này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi : ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc…

Nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu

sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ đạo tăng cường công tác quản lý chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu, đặc biệt là Chỉ thị số 03/CT-BYT ngày 24/02/2012 về việc tăng cường quản lý cung ứng, sử dụng dược liệu, thuốc Y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khám chữa bệnh bằng y học cổ truyền với nhiều giải pháp đồng

bộ Kết quả kiểm tra đánh giá chất lượng thuốc năm 2013, toàn quốc có 56.179 mẫu thuốc đã được kiểm tra đánh giá chất lượng (cả thuốc tân dược và đông dược), trong đó phát hiện 1004 mẫu thuốc (1,79 %) không đạt chỉ tiêu chất lượng

và 08 (0,014%) mẫu thuốc giả; tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng là (1,8%)

Tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng năm 2013 (1,8%) giảm so với năm 2012 (3,09%) [7]

Đã có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tình trạng trộn lẫn tân dược trong các chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường tại các nước [10], [15] Tại Trung Quốc năm

2010, khi kiểm tra 30 mẫu thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng trên thị trường đã phát hiện trong 14 mẫu có chứa các thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (gồm có: glibenclamid, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin…) [15] Trong một nghiên cứu khác tiến hành năm 2009 cũng tại nước này, trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5 thuốc được phát hiện có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, 3 thuốc chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin [17] Tại Ả Rập Saudi, trong nghiên cứu công bố năm 2006, khi tiến hành kiểm tra các mẫu chế phẩm nguồn gốc dược liệu cũng đã phát hiện một số mẫu dương tính với glibenclamid [11]

6

Từ các nghiên cứu ở các nước trên thế giới, nhận thấy các thuốc nhóm sulfonylurea như glibenclamid, gliclazid, glimepirid có thể được trộn vào các chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường, để góp phần nghiên cứu đồng thời 4 hoạt chất chống đái tháo đường nhóm sulfonyurea là glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid, đề tài này đã được tiến hành

Tổng quan về nhóm sulfonylurea

1.1.2.1 Glipizid

- Công thức cấu tạo: C21H27N5O4S

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Glipizid

Pyrazinecarboxamid, N-[2-[4-[[[(cyclohexylamino)carbonyl]amino]sulfonyl] phenyl]ethyl]-5-methy-1-cyclohexyl-3-[[p-[2(5-methylpyrazinecarboxamido)

ethyl]phenyl]sulfonyl]urea

- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, gần như không tan trong nước, ít tan trong ethanol Tan ít trong methylclorid, aceton, methanol ., hòa tan tốt trong dung dịch kiềm và dimethylformanid.[2]

- Liều dùng: Khởi đầu người lớn 5mg /ngày; người già hay người bệnh gan là 2,5 mg/ngày Duy trì thường từ 15mg/ ngày, chia làm nhiều lần [5]

- Tác dụng và cơ chế: có tác dụng là giảm nồng độ glucose trong máu tới mức bình thường ở người đái tháo đường không phụ thuộc insulin Cơ chế: kích thích

1.1.2.2 Glimepirid

Công thức cấu tạo: C24H34N4O5S

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Glimepirid

Tên khoa học: ethyl)phenyl)sulphonyl)-3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea

1-((4-(2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline-1-carboxamido) Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol [2]

- Liều dùng: Khởi đầu 1-2mg /ngày Duy trì 1-4mg/ ngày Tối đa 8mg/ngày Tác dụng và cơ chế tác dụng: có tác dụng hạ glucose huyết, kích thích giải phóng insulin từ tế bào beta tuyến tụy Cơ chế: liên kết với thụ thể ở màng tế bào beta, làm đóng các kênh Kali phụ thuộc lại, gây khử cực màng, làm kích thích mở kênh Calci

Từ đó làm tăng nồng độ Calci trong tế bào, kích thích giải phóng insulin khỏi tế bào Ở ngoài tụy, glimepirid giúp cải thiện sự nhạy cảm của các mô ngoại vi với insulin và làm giảm thu nạp insulin tại gan [5]

8

- Tác dụng không mong muốn: tác dụng không mong muốn quan trọng nhất là tụt glucose huyết, ngoài ra gây cảm giác chóng mặt, nhức đầu, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đau bụng [5]

1.1.2.3 Gibenclamid

Công thức hoá học: C23H28ClN3O5S

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glibenclamid

Tên khoa học: 1 – (4 – (2 – (5 – cloro – 2 – methoxybenzamido) ethyl) benzensulfonyl) – 3 – cyclohexylure [6]

- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung dịch kiềm loãng Nóng chảy ở 1690C đến 1740

- Tác dụng không mong muốn: hạ glucose huyết, buồn nôn, nôn [5]

9

1.1.2.4 Gliclazid

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Gliclazid

Tên khoa học: 1– (azabicyclo (3,3,0) oct–3–yl)– 3-p-tolylsulfonylure [6]

- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol 96% [4], [6]

- Liều dùng: Có thể bắt đầu dùng với liều: 40 - 80 mg, thường dùng 80 mg/ngày

và tối đa là 320 mg/ngày [6]

- Tác dụng và cơ chế tác dụng: kích thích tế bào beta tuyến tụy giải phóng insulin,

do vậy thuốc chỉ có tác dụng trên người bệnh còn có khả năng sản xuất insulin

- Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, nôn đau đầu, phát ban [5]

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC) trong kiểm nghiệm dược phẩm đã được phát triển từ lâu Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30 µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất

Rf = dR /dM

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường

đi của vết)

Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát); thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn; phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả [1]

11

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến của TLC HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời

có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [9]

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC [9]

Ƣu điểm của HPTLC:

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng

- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

12

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, ít gặp vấn đề nền mẫu

- Tài liệu hóa dễ dàng, kết quả có độ tin cậy cao

Do những ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC cho nghiên cứu này Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc giảm glucose máu trộn trong các chế phẩm từ dược liệu

Kenichi Kumasaka [14] đã sàng lọc và định lượng cho 6 sulfonylure chữa tiểu đường: tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid, và glimepirid trộn trái phép trong thực phẩm chức năng Các sulfonylure được chiết với aceton, sau đó dịch chiết đem tiến hành TLC và HPLC Trong phân tích TLC, các chất tách tốt với pha động gồm n-butyl acetat có chứa 0,4 % acid formic Quan sát vết ở UV

254 nm Thuốc thử phát hiện : Dragendoff, acid phosphomolybdic 10% methanol, acid sulfuric 30% methanol Giá trị Rf tương ứng của tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid và glimepirid trong các mẫu là 0,78; 0,58; 0,69; 0,48; 0,40 và 0,35 Với phương pháp HPLC sử dụng cột Cadenza CD-C18, pha động: acetonitril-đệm amoni acetat theo gradient, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10

µl, bước sóng phát hiện: 230 nm, 247 nm LOD của gliclazid, glibenclamid và glimepirid lần lượt là 100, 50, 20 ng/vết

Ning Li [15] sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp bổ sung bất hợp pháp trong thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng của Trung Quốc Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên, thuốc hạt được chuyển về dạng bột đồng nhất Cân chính xác lượng bột mẫu

13

tương đương với một đơn vị liều và chuyển vào một bình nón 100 ml, thêm 40 ml methanol, siêu âm trong 20 phút, lọc qua giấy lọc Mẫu được tách trên cột C18 với pha động gồm acetonitril và nước (cả hai có chứa 0,1% acid formic) rửa giải theo gradient, tốc độ dòng 0,20 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, chế độ phát hiện MRM, các LOD dao động 0,03-5,45 ng/mL Kết quả có 9 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin, gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và mitiglinid) được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30 mẫu thu thập từ thị trường Lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,88 mg/viên đến 6,78 mg/viên

Wensheng Pang [17] đã tiến hành phát hiện và xác định cấu trúc của các thuốc hạ đường huyết tổng hợp thêm trái phép vào các sản phẩm thuốc từ thảo dược để chống bệnh tiểu đường bằng phương pháp LC-MS-MS, phân tích theo chế độ MRM Các mẫu dạng viên nén hoặc nang được nghiền thành bột, sau đó chiết siêu âm với methanol (2 lần x 100 ml; 20 phút mỗi lần); gộp dịch chiết và ly tâm 10 phút, gạn dịch

và chuyển sang bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch bằng methanol; 1ml dung dịch này được chuyển sang bình định mức 10ml và pha loãng đến vạch bằng methanol

Sử dụng cột C18 (2,1mm x 150mm, 5µm); pha động là hỗn hợp của acetonitril và dung dịch acid formic 0,05% trong nước tỷ lệ 60:40; tốc độ dòng 0,2 ml/phút tại 40,7 bar; thể tích tiêm 10 µl Trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5 thuốc phát hiện thấy có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, và 3 thuốc chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,28 mg/viên đến 4,9 mg/viên, tính theo liều dùng tối đa hàng ngày là 1,56 mg đến 29,4 mg

Mei Cui [11] sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC) kết hợp với DAD để xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp trong các thuốc cổ truyền của Trung Quốc Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên và thuốc

14

hạt được nghiền thành bột đồng nhất Lượng bột tương đương 1 liều dùng được cho vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml methanol, chiết siêu âm trong 20 phút, pha loãng đến vạch bằng methanol Việc tách được thực hiện trên cột C18 với pha động gồm acetonitril và dung dịch chứa 1,0 mmol natri dodecyl sulfat và triethylamin 0,1% (sử dụng acid phosphoric điều chỉnh tới pH 3,75), tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo gradient, thể tích tiêm 20 µl, phát hiện ở UV 220 nm Kết quả, có 7 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, phenformin, rosiglitazon, gliclazid, glimepirid và mitiglinid) được tìm thấy từ 9 trong số 26 mẫu thuốc cổ truyền thu thập được Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,58 mg/viên đến 3,25 mg/viên, tính theo liều dùng là 3,34 mg/ngày đến 13,8 mg/ngày Hiện nay, các nghiên cứu đồng thời với nhóm thuốc này được trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược và TPBVSK tại Việt Nam là rất ít hoặc chưa được công bố Từ những tham khảo trên, đề tài tiến hành xây dựng các phương pháp HPTLC để phát hiện

và bước đầu định lượng 4 chất chống đái tháo đường nhóm sulfonylurea (glipizid, glimepirid, glibenclamid, gliclazid) được trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược

và TPBVSK được thu thập tại thị trường Việt Nam

15

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

a Chất chuẩn:

- Glipizid 99,17% SKS: 0107207 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Glibenclamid 100,10% SKS: 0103129 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Glimepirid 99,49% SKS: 0115320.01 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Gliclazid 99,53% SKS: WS 021518701 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

b Hoá chất : Methanol, n-butyl acetat, acid formic, acid acetic băng, ethanol, dicloromethan, cloroform, n-hexan, benzen… đạt độ tinh khiết thuốc thử phân tích (AR)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ Sỹ) : bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển winCAT và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính

- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 của Merck (Đức)

- Cân phân tích Sartorius TE 214S (d=0,1 mg) (Đức)

- Máy lắc xoáy Labinco BV L46

- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức)

- Máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật Bản)

16

- Tủ sấy WiseVen WOF-105 (Hàn Quốc)

- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, bình chiết, pipet

2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu

- Mẫu thử: 40 chế phẩm đông dược và TPBVSK dạng bào chế viên nén, viên nang cứng và viên hoàn có chỉ định điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tiểu đường đang lưu hành trên thị trường, được mua tại các nhà thuốc, mua qua các trang mạng internet, của các lương y hoặc do người dùng nghi ngờ yêu cầu kiểm tra

- Nền mẫu tự tạo: mẫu bột mịn tự tạo từ 18 vị dược liệu đại diện cho các vị dược liệu

có trong 40 mẫu chế phẩm đông dược, TPBVSK có mặt trên thị trường

Bảng 3.1 Thành phần nền mẫu dược liệu tự tạo

- Mẫu chuẩn tự tạo: chất chuẩn trộn cùng nền mẫu tự tạo với tỉ lệ nhất định

17

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC

2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của các chất nghiên cứu trong dung môi [4], [8] và căn cứ vào kết quả của các nghiên cứu đã công bố [12], [16], tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc tân dược từ nền mẫu bằng các dung môi với nhiều tỉ lệ khác nhau

và lựa chọn dung môi chiết hiệu suất cao, cho vết gọn, sắc nét Các dung môi khảo sát bao gồm:

2.2.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

- Pha tĩnh : Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 với kích thước khác nhau

18

- Pha động : Dựa trên điều kiện của các tác giả [14], [18], [21], tiến hành khảo sát bằng thực nghiệm các hệ dung môi pha động sau:

+ Hệ 1: MeOH - nước - acid acetic (6:4:0,25)

+ Hệ 2: n-butanol - acid acetic - nước (11:2:2)

+ Hệ 3: n-butyl acetat chứa 0,4% acid formic

+ Hệ 4: n-butyl acetat - MeOH - acid formic (11:2,5:1,5)

+ Hệ 5: toluen - ethyl acetat - MeOH (8,5:1:8,5)

Lựa chọn dung môi khai triển tách được 4 chất cần phân tích cho vết gọn, sắc nét

- Dùng phần mềm chuyên dụng lấy kết quả tích phân của các vết chất phân tích trên sắc ký đồ Dựa vào đáp ứng của chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và lượng chất phân tích trong mẫu chuẩn tính lượng chất phân tích trong mẫu thử

2.2.2 Thẩm định phương pháp

Theo hướng dẫn của AOAC [13] với các tiêu chí:

Độ chọn lọc: Phân tích đồng thời 3 mẫu: dung dịch hỗn hợp chuẩn chất phân tích, mẫu trắng là nền mẫu đông dược tự tạo và mẫu trắng thêm chuẩn trên hệ thống HPTLC Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn có các vết chính có cùng

19

hình dạng, màu sắc, quãng đường đi với vết của chất chuẩn Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn

Độ phù hợp của hệ thống: Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất phân tích trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn Yêu cầu: diện tích pic thu được của 6 lần sắc ký lặp lại mẫu chuẩn của 4 chất phân tích đạt yêu cầu theo AOAC có giá trị RSD (%) ≤ 3,7%

Khoảng tuyến tính: Pha riêng dãy các dung dịch chuẩn gốc 4 chất nhóm sulfonylurea rồi tiến hành phân tích trên hệ thống HPTLC Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa lượng chất phân tích trên vết và diện tích pic tương ứng Yêu cầu: phương trình hồi quy dạng đường thẳng có hệ số tương quan r > 0,99

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ): giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất có S/N khoảng 3 (tín hiệu đáp ứng của pic gấp khoảng 3 lần đường nhiễu nền), giới hạn định lượng được tính theo công thức: LOQ = LOD x 3,3

Độ lặp lại, độ đúng: Thực hiện trên mẫu tự tạo 1 mức nồng độ chất chuẩn được thêm vào nền mẫu Tiến hành xử lý mẫu và sắc kí theo các điều kiện đã chọn

Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua giá trị RSD thu được khi phân tích 6 mẫu tự tạo khác nhau của một nồng độ Làm lặp lại ở 1 ngày khác Độ chính xác trung gian được xác định dựa vào RSD (%) của 12 kết quả ở 2 ngày phân tích Yêu cầu : RSD ≤ 5,3%

Độ đúng (độ thu hồi) được xác định dựa vào phương trình hồi quy đã xây dựng trong cùng ngày phân tích và so sánh với lượng chuẩn thêm vào để đánh giá độ đúng của phương pháp Yêu cầu : độ thu hồi đạt 90-107%

20

2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực

Áp dụng phương pháp HPTLC vừa xây dựng được để định tính và định lượng 4 chất nhóm sulfonylure (Glipzid, glimepirid, glibenclammid, gliclazid) được trộn lẫn trong một số chế phẩm thu thập được trên thị trường (nếu có) Dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích tính hàm lượng chất phân tích được trộn lẫn trong chế phẩm đông dược

Công thức tính hàm lượng chất phân tích trong các mẫu dương tính (mg/đơn vị mẫu) :

Cthử : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử tính theo đường chuẩn (µg/ml)

mTB đơn vị : khối lượng trung bình đơn vị mẫu (g)

mthử : khối lượng bột mẫu thử được cân (g)

Vthử : thể tích MeOH dùng để pha loãng mẫu thử (ml)

21

Chương 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC

Pha riêng các dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 5,0 mg các chất chuẩn vào bình định mức 5,0 ml Thêm vào bình định mức khoảng 2 ml MeOH, lắc cho tan rồi thêm MeOH vừa đủ đến vạch

Khảo sát các hệ pha động, tiến hành trên bản mỏng silica gel 60 F254, kích thước 10x10 cm; thể tích chấm: 5 µl, bước sóng phát hiện 254 nm Kết quả thể hiện ở hình 3.1

22

Hệ 2: MeOH – H2O – acid acetic băng (6:4:0,25) : Không tách được 4 chất

Hệ 3: n-butanol – acid acetic – H2O – MeOH ( 12:4:1:2) Rf của các chất lớn, không tách đượcc 4 chất Cụ thể là Glibenclamid và Glimepirid trùng nhau

Hệ 4: n-butylacetat có chứa 0,4% acid formic : Rf của glipizid 0,08; Rf của glimepirid 0,23; Rf của glibenclamid 0,26; Rf của gliclazid 0,31 Hệ 4 có thể tách được riêng các chất nhưng Rf nhỏ, vết glibenclamid và glimepirid gần nhau

Hệ 5: ethyl acetat – toluen – diethyl ether – acid acetic (30:10:10:0,1) : các vết

rõ nét nhưng không tách được riêng 4 chất

Từ các kết quả trên, lựa chọn hệ 4 cho nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành khảo sát các hệ dung môi có tỷ lệ acid formic trong pha động dao động từ 0,3% đến 0,6%; ∆C = 0,1 % Thể tích chấm 5 µl, bản mỏng 10 x 20 cm, phát hiện ở bước sóng 254nm Kết quả thể hiện ở hình 3.2:

Hệ 4.1 Hệ 4.2 Hệ 4.3 Hệ 4.4

Hình 3.2 Kết quả khảo sát hệ n- butylacetat chứa acid formic các tỷ lệ

Tiến hành quét phổ UV tại vị trí vết của 4 chất phân tích glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid trong sắc đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp, kết quả thể hiện ở hình 3.4

24

HÌnh 3.3

Hình 3.3 Sắc kí đồ hệ n-butylacetat chứa 0,5% acid formic, sắc kí nhắc lại

Hình 3.4 Kết quả phổ UV của các chất phân tích: a- Glip; b- Glim; c- Glib; d- Glic

Glibenclamid có cực đại hấp thụ tại bước sóng 235nmm và 310 nm

Glipizid có cực đại hấp thụ tại bước sóng 233 nm và 279 nm

Gliclazid có cực đại hấp thụ tại bước sóng 232 nm và glimepirid có cực đại hấp thụ tại bước sóng 235 nm

Do đó, lựa chọn bước sóng 235 nm để phát hiện khi phân tích lấy kết quả định lượng của cả 4 chất phân tích

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

 Khảo sát dung môi chiết

 Với nền mẫu tự tạo chuẩn bị như mục 2.1.3, cân chính xác khoảng 0,6 g và hỗn hợp chuẩn 4 chất nghiên cứu, tiến hành xử lý bằng cách chiết lần lượt với 03 hệ dung môi khác nhau và phân tích theo các điều kiện HPTLC đã chọn Tính tỷ lệ

25

đáp ứng phân tích (diện tích pic - A) và khối lượng chuẩn (m) Lựa chọn hệ dung

môi chiết hiệu suất cao, cho vết gọn, sắc nét Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết của 4 chất phân tích

MeOH EtOH MeOH : H 2 O

Từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện phân tích được lựa chọn như sau:

- Bản mỏng : silica gel 60 F254 với các kích thước (20x20 cm) và (10x20 cm)

- Pha động : n-butyl acetat – acid formic (n-butyl acetat chứa 0,5% acid formic)

mẫu

28

3.1.3 Thẩm định phương pháp

3.1.3.1 Tính chọn lọc

Phân tích đồng thời 3 mẫu: dung dịch hỗn hợp chuẩn chất phân tích, mẫu trắng

là nền mẫu đông dược tự tạo và mẫu trắng thêm chuẩn trên hệ thống HPTLC Kết quả thu được như hình 3.7

Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC :1- trắng ; 2- chuẩn ;

3- trắng thêm chuẩn

Xử lý kết quả với phần mềm WinCAT đối với mẫu trên nền chế phẩm tự tạo, lấy sắc kí đồ analog Kết quả thể hiện ở hình 3.8

Do đó, phương pháp có tính chọn lọc đảm bảo để phát hiện 4 chất trên nền các chế phẩm đông dược khảo sát

3.1.3.2 Tính thích hợp hệ thống

Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch hỗn hợp chuẩn 4 chất phân tích tại nồng độ 1 mg/ml trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn Kết quả thu được thể hiện

ở bảng 3.3

Quãng đường (cm)

Diện tích pic

Quãng đường (cm)

Diện tích pic

Quãng đường (cm)

Diện tích oic

(%)

1,71 1,91 0,66 0,91 0,61 1,34 0,86 2,78

Từ các kết quả bảng 3.2 cho thấy: Diện tích pic thu được của 6 lần sắc ký lặp lại mẫu chuẩn của 4 chất phân tích có giá trị RSD (%) < 3,7%, đạt yêu cầu theo AOAC Như vậy hệ thống HPTLC đạt yêu cầu để phân tích 4 chất: glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid trong chế phẩm đông dược

3.1.2.3 Khoảng tuyến tính

Pha riêng từng dãy dung dịch chuẩn của mỗi chất: Glip có nồng độ từ 50 - 400 µg/ml, Glim có nồng độ từ 40 - 160 µg/ml, Glib có nồng độ từ 50 – 400 µg/ml và Glic

có nồng độ từ 400 - 3200 µg/ml từ các dung dịch chuẩn gốc rồi tiến hành phân tích trên

hệ thống HPTLC Chấm sắc kí với thể tích: 10 µl/ vết Xây dựng phương trình hồi quy