SẮC ký lớp MỎNG pptx _ KIỂM NGHIỆM (slide nhìn biến dạng, tải về đẹp lung linh)

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”; https:123doc.netusershomeuser_home.php?use_id=7046916. Slide bài giảng môn kiểm nghiệm thuốc pptx dành cho sinh viên chuyên ngành dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết từng bài, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm thuốc bậc cao đẳng đại học chuyên ngành dược

MỤC TIÊU

1 Trình bày lịch sử phát triển, định nghĩa và cơ chế tách

2 Phân tích pha tĩnh và pha động thường dùng

3 Trình bày trang thiết bị và cách triển khai

4 Trình bày các thông số đặc trưng và các yếu tố ảnh hưởng

5 Ứng dụng của TLC trong phân tích Dược

2

NỘI DUNG

1 Lịch sử phát triển, định nghĩa và cơ chế tách trong TLC

2 Phân tích pha tĩnh và pha động phổ biến trong TLC

 Pha tĩnh: Silicagel, silica-ghép, oxyd nhôm…

 Pha động: Các hệ DM có độ phân cực và khả năng rửa

giải khác nhau…

3 Trang thiết bị và cách triển khai TLC

4 Các thông số đặc trưng và các yếu tố ảnh hưởng

5 Ứng dụng của TLC trong phân tích Dược: phân tích

thuốc, hóa hợp chất tự nhiên

1938, Izmailov và Schraiber : SKLM (Al2O3, bảng thủy tinh)

cách phát hiện)

bảng mỏng tráng sẵn…

1 LỊCH SỬ - ĐỊNH NGHĨA - CƠ CHẾ TÁCH

Lịch sử

4

SKLM là một phương pháp sắc ký mà trong đó một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (silica gel, nhôm oxyt, tráng trên nền phẳng ) pha tĩnh

Một dung môi khai triển ( pha động ) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau do sự hấp phụ, phân bố … tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có R f khác nhau.

Định nghĩa

2 PHA TĨNH – PHA ĐỘNG TRONG SKLM

 SILICAGEL= KIESELGEL= GEL CỦA ACID SILICID (SiO 2 nH 2 O )

 Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay

 Chất phân cực, trung tâm hấp phụ là các nhóm -OH silanol (-Si-OH, HO-Si-OH, -Si-trihydroxyl) có tính acid -OH silanol có Pka 9,5 và pH 5 -7 MP: pH < 8.5

 Tỉ lệ silanol tự do/geminal silanol khoảng (2:1), diện tích bề mặt 200-400m 2 /g

 Mật độ nhóm silanol càng cao (hạt càng mịn) khả năng hấp phụ càng lớn

 Tan ít trong MeOH

đến 70 0 C 100- 120 0 C 250- 650 0 C

Nhiệt độ Ngậm nước

(n H20)

Khả năng hấp phụ Tính chất Tình trạng

200-450 0 Mạnh, không giải hấp được Phục hồi được Bắt đầu trơ

450-1100 -1 Mất hoàn toàn khả năng hấp

 Silica gel = silica gel pha thuận= silica gel NP hay

# Kieselgurh

Đường kính lỗ xoang (40,60,80,100)

của hạt silica gel, Angstrom

Trộn chất phát huỳnh quang

25 bảng nhôm

tráng sẵn

20x20cm

Cho biết kích thước của hạt có thể lọt qua 1 rây có

400 lỗ trên 1 inch vuông American Society for testing and materials

Số mesh 40

0

D hạt (µm)

Kieselgel 60 WF 254

Hạt thô Hạt vừa hay

trung bình

Hạt mịn

63-200µm 40-63 15-40

FC, VLC FC, VLC,CC TLC

G= gypsum:chất kết dính (CaSO4 5-15%, Tinh bột 2-5%, dextran…)

Dùng cho TLC, cỡ hạt mịn (5-40µm)

High performance: Hiệu năng cao, d= 4-8µm

14

 NHÔM OXYD (Alumina: Al2O3 nH2O)

 Kích thước hạt thường thô hơn so với silica gel

 Là chất hấp phụ phân cực mạnh (hơi kém hơn Silica gel),

 S bề mặt 100m 2 /g, bề dày lớp mỏng 0,1- 0,15mm

 Có ba loại Alumina trên thị trường

◦ Loại trung tính (7,3 ± 0,5): Al-OH + -Al-O

-◦ Loại acid (4,0 ± 0,5) : -Al-OH

◦ Loại base (9,0 ± 0,5 ): -Al-O

Nhưng cũng có thể chuyển đổi pH của oxid nhôm nếu cần

 Hoạt tính giảm khi hàm lượng nước gia tăng hoạt hóa 120 o C /1h

16

Xác định bậc hoạt tính của oxid nhôm dựa vào giá trị Rf

của các chất màu chuẩn

Bảng Brockman

 KIESELGUHR

còn lại gồm các oxid nhôm, sắt, Mg, Ca, P, S…

kieselguhr thay đổi tùy theo hãng sản xuất

như cetoacid, lacton, … thường được dùng làm chất mang cho pha tĩnh trong sắc ký phân bố

kieselguhr – silicagel với tỷ lệ 1:1

 POLYAMID (đất tẩy trắng)

tách các chức phenol

các nhóm chức của mẫu với oxy của –CO trong polyamid

20

 Ngoài cơ chế hấp phụ còn có cơ chế phân bố nhờ các xoang rỗng của polyamid đây cũng được xem là cơ chế tách chính của polyamid (alkaloid, acid amin…)

 THẠCH CAO

 Được điều chế bằng cách trộn dung dịch CaCl2 và H2SO4 với

tỷ lệ đồng phân tử, đun 70 – 80oC, gạn lấy CaSO4, rửa tới trung tính, sấy 48 giờ sấy 115 -120oC.

 Chất hấp phụ yếu

 Hiện nay ít sử dụng

22

 Chất hấp phụ có độ phân cực yếu dùng dưới dạng bột cho SKC

 dùng loại các sắc tố tạp khỏi dịch chiết dược liệu hoặc để tinh chế các chất

 SILICA GEL- GHÉP (SILICA GEL BONED PHASE)

 Chất mang là các hạt silica đồng nhất, xốp, bền cơ học có d= 3,5,10 µm được thủy phân hoàn toàn bằng HCl 0.1M ở nhiệt độ cao /1 ngày) để tạo thành các nhóm Silanol va gem - silanol

 Các nhóm Silanol va gem - silanol được cho phản ứng với clorosilane để tạp thành các -Si-O-Si-R, Si-R.

R: là mạch carbon kém phân cực ( C 2 , C 4 , C 4 , C 8 , C 18 )

Sử dụng phổ biến hơnDùng nhiều trong HPLC

Silica gel – ghép pha đảo = RP-TLC

Cơ chế phân bố là chính

26

 CELLULOSE

(giấy Whatman, FN…)

và nước hoặc bằng isopropanol, acid acetic và nước tạo hỗn dịch

để chạy SKC pha đảo

 Cellulose có cơ chế phân bố là chính thường dùng tách các hợp chất phân cực mà không thể tách bằng sắc ký hấp phụ (polysaccaride, acid amin, acid nucleic ) các vết thu được khá tròn,

ít biến dạng và thời gian phân tách ngắn

thạch cao để làm chất mang dung môi pha tĩnh

28

 Là yếu tố quan trọng trong quá trình sắc ký

phần được gọi là hệ dung môi.

kiềm, acid … có thể được thêm vào hệ dung môi

2 1 PHA ĐỘNG

 Độ tinh khiết của dung môi: có 1 kết quả tốt, lặp lại

 Để đánh giá khả năng rửa giải của 1 dung môi người ta thường dùng khái niệm “độ phân cực” của dung môi.

 Độ phân cực của dung môi được dự đoán bằng moment lưỡng cực, hằng số điện môi, thực nghiệm v.v…

30

DM CTCT Nhiệt độ sôi

Boiling point

Tỉ trọng Density P’

(dãy Snyder)

F (dãy Halpaap)

Acetic acid CH3-C(=O)OH 118 °C 1.049 g/ml 6.0 Lớn

Formic acid H-C(=O)OH 101 °C 1.21 g/ml

Water H-O-H 100 °C 1.000 g/ml 10.2 Rất lớn

Dimethylformamide

(DMF)

H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 0.944 g/ml

R: là mạch phân cực ( cyanopropyl, aminopropyl, propadiol…)

Silica gel –ghép pha thuận

Ước lượng độ phân cực của một dung môi

P’ S= (a%x P’A+ b% P’ B)

Ví dụ: S = Bz- EtOAc (80:20)

36

 Để so sánh và phân biệt 2 dung môi trong 1 hệ dung môi, người ta phân biệt:

làm cho chất phân tách di chuyển nhanh hơn

mạnh bằng dung môi mạnh

 Dung môi mạnh hay yếu là xét trên 1 hệ cụ thể

mạnh

mạnh

 Khi viết 1 hệ dung môi, thông thường người ta viết

◦ Dung môi yếu trước – Dung môi mạnh sau

◦ Tỉ lệ của các dung môi (dung môi yếu:dung môi mạnh)

38

Hòa tan tốt mẫu thử

 Yêu cầu cho 1 dung môi sắc ký tốt

 Lựa chọn dung môi cho sắc ký (TLC)

(silica gel RP…)

Phân cực mạnh (ACN, Me, H2O

Qui tắc tam giác Stahl (1960’)

40

 Tham khảo dãy (Snyder, dãy Halpaap) để chọn ra vài loại dung môi tinh khiết có “độ mạnh” phù hợp

theo hướng tăng dần độ phân cực sau đó chấm bản lên một loạt bản, mỗi bản khai triển với một trong các hệ dung môi này, sơ bộ ghi nhận các hệ dung môi nào tách tốt

(bằng cách soi đèn UV hoặc phun thuốc thử phù hợp)

 Nếu muốn điều chỉnh hệ dung môi 2 thành phần mới chọn, có thể thêm thành phần thứ 3 vào hệ này để cho các vết tách rõ hơn, sắc

chỉnh: modifier)

bên cạnh tác dụng điều chỉnh pH cũng có thể làm tăng đáng kể

độ phân cực của hệ dung môi vừa chọn

Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm

42

 Một số yếu tố giúp lựa chọn pha tĩnh và pha động cho TLC

cực, số lượng và đặc tính các nhóm chức hóa học)

khoảng 0,2 – 0,8 đạt độ phân giải cực trị

môi phân cực như hỗn hợp n-butanol:nước

Thêm một ít acid acetic hoặc ammoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của acid hoặc base tương ứng.

phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng

44

3 DỤNG CỤ CHO TLC

Tròn : Đường kính 12cm, cao 30cm Vuông : Đường kính 24 x 24cm Chữ nhật : Đườn kính 24x30cm

3.1 Bình triển khai

3.1 Bảng mỏng tráng sẵn (precoated TLC plate)

46

3.3 Các phụ kiện khác

Uv lamps cabinet 365, 254nm Mao quản

3 TIẾN HÀNH TLC

Bão hòa hệ dung môi

Chuẩn bị bảng mỏng Silica gel

 Thể tích các dung môi

 Lắc đều

 Giấy lọc bảo hòa DM

 Thời gianSOP/ Kết quả TLC đẹp

 Theo dõi CC: vết sát nhau hơn

 P-TLC: chấm băng liên tục dày 1-2mm, mao quản 1-10µl

 Đặt bảng mỏng vào bình dung môi:

• tránh dựa lưng vào giấy lọc

• tránh hai biên tiếp xúc DM

• nghiêng góc 45 o

 Không di chuyển bình sắc ký hay có rung động

 Khai triển một hay nhiều lần (F254)

 Khai triển theo hai chiều thẳng góc nhau 50

• Mẫu thử, dung môi hòa tan mẫu

• DM khai triển và số lần khai triển

• Điều kiện hiện màu

 Tính Rf hoặc Rx

• 2 số lẻ

• Theo thứ tự Rf nhỏ dần

 SKĐ đính kèm

Kỹ thuật sắc ký hai chiều

O

O () ()

0 ()

Quay 90 o

 Trong trường hợp mẫu phân tích có nhiều chất nếu sự tách kỹ thuật sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký hai chiều để kết quả tách được rõ ràng hơn.

Dùng loại kình 20x20cm Chấm chất phân tích ở góc kính, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi I, quay một góc 90 o C, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi thứ II.

52

CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP TRONG TLC

Hiện tượng Nguyên nhân Khắc phục

Vết di chuyển không hoàn

toàn

Mẫu còn nhiều tạp phân cực Loại tạp kỹ hơn trước khi tiến

hành TLC

Vết trải dài không tách Chọn dung môi sắc ký chưa tốt

DM chiết không chuyên biệt

Thăm dó lại hệ Chọn DM chiết mẫu chuyên biệt hơn

Vết di chuyển xéo Bảng mỏng bỉ mẻ ở hai bờ, thành

bảng mỏng tiếp xúc dung môi

Hở bình sắc ký

Thay bảng mỏng khác Thay bình sắc ký khác

Vết hình móng ngựa Vết chấm hình tròn quá lớn Chấm nhỏ hơn với nồng độ cao

Vết loang Vếch khuyếch tán do bay hơi vì để

lâu hoặc nhúng thuốc thủ quá lâu

Vẽ, chụp hình ngay sau khi hiện màu xong

54

4 CÁC THÔNG SỐ SẮC KÝ ĐẶC TRƯNG

4.1 Hệ số lưu giữ Rf ( Retardation factor)

R f = dR/ d M = v/ V 0 => 0 < R f < 1

dR : khỏang di chuyển được của chất cần tách

dM : khoảng di chuyển được của dung môi.

OA OF

OX A

Rf

X

R X

) (

)

( )

(

Các yếu tố ảnh hưởng cùa R f

 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ

 Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm

 Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng

 Thành phần và độ tinh khiết của pha động

 Phương pháp khai triển sắc ký

 Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký ( “hiện tượng bờ”, hình B)

 Ảnh hưởng của các cấu tử khác có trong thành phần hỗn hợp cần tách

 Độ ẩm, nhiệt độ, và pH

4.2 Độ phân giải Rs ( Resolution factor)

(khoảng cách giữa trung tâm các vết)

Trong SKLM, nếu giá trị Rs lớn hơn 1.0, các chất phân tích tách ra khỏi nhau

• Để cải thiện Rs, thay đổi lực rửa giải của dung môi để tối ưu hóa

• Biến đổi thành phần của hệ dung môi để mà các thành phần ái lực (hòa hợp) với pha động vừa đủ

• Việc thay đổi bản chất hóa học của hệ thống dung môi như thay đổi dung môi có thể liên kết hydro bằng dung môi không thể cho liên kết hydro với chất phân tích thường có hiệu quả nhất.

chấm vết nhỏ hơn và với nồng độ loãng hơn

60

4.3 Hệ số dung lượng

 Quãng đường di chuyển của chất trong mẫu là dR và của dung môi là dM

 tM và tR là thời gian tương ứng để pha động và chất tan di chuyển được một quãng đường là dR

 Thời gian chất tan lưu giữ trong pha động bằng quãng đường dR chia cho tốc độ thẳng của pha động u: tM = dR/u.

f

f R

R M

M

M R

R

R d

d

d t

t

t

'

4 Ứng dụng TLC trong phân tích Dược

Rf: 0.3-0,75

62

4.2 Bán định lượng

điều chế, hiệu năng cao) nếu có mẫu chuẩn có thể bán định lượng một chất hay một nhóm chất có trong mẫu thử tự động hóa bởi thiết bị chuyên dùng

4.2 Thăm dò dung môi cho CC

Cf-MeOH = 100-5 = 3 lan

66

Một số kinh nghiệm thực

hành SKLM

bản mỏng trước khi chạy ( sấy

30ph ở 110 độ) Sấy xong cất vào hộp kín dùng dần.

các dm dễ bay hơi, thường dùng

methanol vì đây là dung môi vạn

năng, có khả năng hòa tan chất phân cực và ko phân cực.

 Chọn dung môi nền

 Không chọn hai dung môi có độ

phân cực quá gần nhau

 Thay đổi tỉ lệ hai dung môi sau

khi chạy thử

Một số kinh nghiệm thực

hành SKLM

68