Nghiên cứu đặc điểm thực vật và bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây giổi thu hái tại hòa bình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ VĂN HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY GIỔI THU HÁI TẠI HÒA BÌNH LUẬN VĂN THẠC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ VĂN HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY GIỔI THU HÁI TẠI HÒA BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ VĂN HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY GIỔI THU HÁI TẠI HÒA BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH:DƯỢC LIỆU- DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: TS Hà Vân Oanh

TS Nguyễn Quỳnh Chi

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Hà Vân

Oanh - Bộ môn Dược học cổ truyền và TS Nguyễn Quỳnh Chi - Bộ môn

Dược liệu, là giảng viên đã hướng dẫn và giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá

trình thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Tuấn, Ths Nghiêm Đức Trọng đã

giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện, cho tôi những lời khuyên khi thực hiện

đề tài

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn ba mẹ, gia đình và bạn bè đã động viên và

ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 27 tháng 3 năm 2018

Học viên

Đỗ Văn Hải

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TĂT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Michelia L 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Đa dạng và phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học 6

1.1.5 Tác dụng sinh học 15

1.2 Tổng quan về cây giổi – Michelia tonkinensis A Chev 18

1.2.1 Đặc điểm thực vật 18

1.2.2 Sinh thái và phân bố 19

1.2.3 Thành phần hóa học 19

1.2.4 Tác dụng sinh học 21

1.2.5 Công dụng 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Dung môi, hóa chất 22

2.1.3 Trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp giám định tên khoa học và nghiên cứu đặc điểm thực vật 23

2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu 24

2.2.3 Phương pháp phân tích thành phần tinh dầu thu được 24

2.2.4 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 25

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Đặc điểm thực vật 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái 27

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá 28

3.1.3 Đặc điểm bột lá 29

3.1.4 Đặc điểm bột vỏ quả 30

3.1.5 Đặc điểm bột hạt 31

3.2 Kết quả nghiên cứu tinh dầu từ hạt và lá giổi 31

3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu từ lá và hạt giổi 31

3.2.2 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu lá và hạt giổi 32

3.3 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ lá giổi 36

3.3.1 Điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn 36

3.3.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất từ lá giổi 37

3.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất 40

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 51

4.1 Về đặc điểm thực vật và tên khoa học của mẫu nghiên cứu 51

4.2 Về thành phần hóa học của cây giổi 51

4.2.1 Nghiên cứu tinh dầu từ cây giổi 51

4.2.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất từ lá giổi 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR 13C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-NMR 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

APCI-MS Atmospheric Pressure Chemical Ionization - Mass

Spectrometry Cao D Cao diclomethan

Cao E Cao ethyl acetat

Cao H Cao n-hexan

Cao N Cao nước

DĐVN Dược điển Việt Nam

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

ED50 Liều có hiệu quả với 50% đối tượng thử

(Effective Dose 50%) ESI-MS Electrospray Ionization - Mass Spectrometry

GC/MS Gas chromatoghraphy Mass Spectrometry

(sắc ký khí khồi phổ) HMBC

IC50

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

(Inhibitory Concentration 50%)

IR Hồng ngoại (Infrared Radiation)

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

(Minimum Inhibitory Concentration)

NO

RI

Nitric oxyd Thời gian lưu (Retention Time Index)

SKLM

TLTK

Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo tt/kl Thể tích/khối lƣợng

UV Tử ngoại (Ultraviolet)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Michelia L ở Việt Nam

Bảng 1.2 Các terpenoid từ chi Michelia L

4

6

Bảng 1.6 Các hợp chất lignan từ chi Michelia L 13 Bảng 1.7 Một số thành phần của tinh dầu giổi 20 Bảng 3.1 Hàm lƣợng tinh dầu trong lá và hạt giổi 32 Bảng 3.2 Thành phần hóa học của tinh dầu từ lá giổi 33 Bảng 3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu từ hạt giổi 34 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất M12 và

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số terpenoid từ chi Michelia L

Hình 1.2 Một số hợp chất alkaloid từ chi Michelia L

8

10

Hình 1.3 Một số hợp chất benzenoid từ chi Michelia L 12

Hình 1.4 Một số hợp chất lignan từ chi Michelia L 14

Hình 3.10 cấu trúc hóa học của hợp chất M13.1 45 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất M13.2 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây giổi, hay còn được gọi là giổi an nam, giổi lúa, giổi ngọt, có tên

khoa học là Michelia tonkinensis A.Chev, tên đồng nghĩa là Talauma gioi A.Chev, Michelia gioii (A Chev.) Sim & Hong Yu, Michelia hypolampra Dandy, Michelia hedyosperma Y.W.Law, thuộc họ Ngọc Lan (Magnoliaceae)

[51] đã được nhân dân vùng Hà Nội, Hòa Bình lấy quả giã làm gia vị cùng với muối ăn có giá trị kinh tế cao Ngoài ra, quả cây giổi còn làm thuốc chữa các bệnh đau bụng, ăn uống không tiêu, hoặc ngâm rượu để xoa bóp khi đau nhức, tê thấp

Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của dược liệu này Với mục tiêu bổ sung cơ sở dữ liệu thực vật, hóa học cũng như nâng cao công dụng và giá trị ứng dụng thực tiễn của

dược liệu từ cây giổi, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực

vật và bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây giổi thu hái tại Hòa Bình” với một số mục tiêu cụ thể như sau:

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm vi học lá và quả cây giổi

- Định tính, định lượng tinh dầu và xác định các cấu tử trong tinh dầu

từ hạt và lá giổi thu hái tại Hòa Bình

- Chiết xuất phân lập và nhận dạng 1-2 hợp chất từ lá giổi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Michelia L

1.1.1 Vị trí phân loại

Chi Michelia Linnaeus thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), Bộ Ngọc

lan (Magnoliales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Dựa vào hệ thống phân loại thực vật của Takhtakjan, khung phân loại

của ngành Ngọc lan, vị trí phân loại của cây Giổi (Michelia tonkinensis

A.Chev.) được thể hiện như sau:

Chi: Michelia Linnaeus

Loài: Michelia tonkinensis A.Chev [46]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Các loài thuộc chi Michelia L thường là cây gỗ, hiếm khi là cây bụi,

thường xanh Cành giòn dễ bẻ, thường có mùi thơm do chứa tinh dầu Chồi và cành non nhẵn hoặc có lông Cành non phủ lông dày màu vàng, nâu vàng đến nâu đỏ, đôi khi nâu đen, xám hoặc trắng Cành thường có bì khổng Lá kèm bao bọc chồi sinh dưỡng, gồm 2 mảnh, dính với nhau ở gốc và đính trên thân hoặc cuống lá Lá kèm sớm rụng, để lại vết sẹo dạng vòng trên cành Vết lá kèm có thể có lông hoặc nhẵn Lá đơn, mọc vòng, phiến lá chất da, mép lá ngyên Lá non thẳng hoặc gập đôi trong chồi Phiến lá hình trứng, trứng ngược, bầu dục hoặc bầu dục thuôn Gân lá dạng lông chim, gân chính thường nổi ở mặt dưới, 13-22 cặp gân thứ cấp, gân tam cấp thường kết thành hình

mạng và nổi rõ khi lá khô Mặt trên lá trưởng thành thường có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, có thể có ánh bạc hoặc phấn trắng Lá non thường

có màu đỏ tía hoặc xanh tái Hoa lưỡng tính, mọc ở nách lá, đơn độc, thường

có mùi thơm Hoa mẫu 3, tràng 6-21, gần bằng nhau hoặc hiếm khi cánh vòng ngoài khác biệt Bao phấn mở trong, bên hoặc gần bên, trung đới hình mấu nhọn, dài hoặc ngắn Bộ nhụy có cuống, lá noãn 1vài hoặc rất nhiều, hiếm khi

1, thường không hoàn chỉnh, rời hoặc đính nhau, noãn 2 đến nhiều Bầu thượng Quả thường hình trụ khi chín, thường cong vì có nhiều lá noãn không phát triển Noãn chín chất da hoặc gỗ, dính ấy trục, không có cuống hoặc cuống ngắn, mở thành hai mảnh ở đường nối mặt lưng hoặc cả mặt lưng và bụng, đầu có mỏ ngắn và rất chắc Có từ 2 tới vài hạt trên 1 noãn, màu đỏ hoặc nâu [12], [20]

1.1.3 Đa dạng và phân bố

Trên thế giới: chi Giổi - Michelia L có 70 loài, phân bố ở các vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á [20]

Ở Việt Nam: theo Phạm Hoàng Hộ, chi Giổi có 19 loài [5] Trong danh lục các loài thực vật Việt Nam, Nguyễn Tiến Bân thống kê có 18 loài và 1 thứ

thuộc chi này Danh lục này có 3 loài Paramichelia braianensis (Gagnep.) Dandy, Paramichelia baillonii (Pierre) Hu và Tsoongiodendron odorum Chun đến nay được xác định là tên đồng nghĩa của các loài Michelia braianensis Gagnep., M baillonii (Pierre) Finet & Gagnep và Michelia odora (Chun) Nooteboom & B L Chen [1] Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã xác định và bổ sung thêm 6 loài thuộc chi này là Michelia gioii (A Chev.) Sima & H Yu, Michelia velutina DC [8], Michelia mannii King [49], Michelia fulva Chang et B L [9], Michelia citrata (Noot & Chalermglin) Q N Vu & N H Xia [10], Michelia macclurei Dandy [11], Michelia xianianhei sp nov [50] Như vậy, ở nước ta hiện nay đã xác định được khoảng 25 loài thuộc chi Michelia L

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Michelia L ở Việt Nam

4 Michelia balansae (A DC.)

(Giổi Balansa, giổi lông)

11 Michelia gravis Dandy

12 Michelia baillonii (Pierre) Finet [5]

Michelia tonkinensis Chev

(Giổi ngọt, Giổi lúa)

Hoà Bình, Tuyên Quang,

Hà Giang, Thanh Hoá, Lào Cai, Nghệ An, Phú Thọ

25 Michelia mannii King Ninh Bình, Lâm Đồng [49]

1.1.4 Thành phần hóa học

Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Michelia L đến nay vẫn chƣa đầy đủ, chủ yếu đƣợc tiến hành trên các loài M alba, M.compressa, M floribunda, M rajaniana, M champaca, M compressa var lanyuensis, M compressa var formosana, M doltsopa, M sphaerantha Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy các loài thuộc chi Michelia L chứa các hợp chất

nhóm terpenoid, steroid, alkaloid, flavonoid,

1.1.4.1 Terpenoid

Các hợp chất terpenoid từ các loài thuộc chi Michelia L chủ yếu thuộc

nhóm sesquiterpen, sesquiterpen lacton và monoterpen Các hợp chất này là

thành phần chủ yếu trong tinh dầu của các loài thuộc chi Michelia L nhƣ

terpen, myrcen, alloocimen, myrcenol, linalool, linalool oxid, geraniol, geranial, limomen, phellandren, terpnolen, cineol, thujen, sabinen, pinen, verbenon, myrtenol, cadian, caryophyllan, [59]

Bên cạnh các hợp chất terpenoid là thành phần của tinh dầu, nhiều hợp

chất terpenoid cũng đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Michelia L (bảng

1.2)

Bảng 1.2 Các terpenoid từ chi Michelia L

1

Costunolid, dihydrocostunolid, santamarin,

parthenolid, dihydroparthenolid, michelenolid,

11, 13-dehydrolanuginolid, dehydrolinalool

oxid

M alba

[15], [19]

2 Costunolid, santamarin, reynosin, parthenolid,

formosana

[18], [21]

8 Dihydroparthenolid, lanuginolid,

Hình 1.1 Một số terpenoid từ chi Michelia L

1.1.4.2 Alkaloid

Alkaloid từ chi Michelia L chủ yếu thuộc nhóm aporphin Các alkaloid

phân lập từ chi này đƣợc trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.3 Các alkaloid từ chi Michelia L

1 (-)-Anonain, (-)-norushinsunin, (-)-ushinsunin

và (-)-N-acetylanonain, liriodenin, oxoxylopin M alba [19]

4

Anonain, asimilobin, nuciferin,

(-)-anolobin, (-)-romerin, (-)-N-acetylanonain,

liriodenin, champacain, isocorydin,

(-)-norushinsunin, (-)-ushinsunin, atherospermidin,

O-methylmoschatolin

M

champaca

[30], [58]

lanyuensis

[39], [54]

6

Roemerin, liriodenin, oliverolin, ushisurin,

dehydroroemerin, romucosin, secoroemerin,

6α,7-dehydroanonalin, cepharadion-A,

O-acetyl-ushinsunin, northalifolin, noroliverolin

M

compressa var

formosana

[18]

Hình 1.2 Một số hợp chất alkaloid từ chi Michelia L

1.1.4.3 Steroid

Các steroid từ chi Michelia L đƣợc trình bày ở bảng:

Bảng 1.4 Steroid từ chi Michelia L

3 β -Sitosterol, stigmasterol,

stigmasta-4,22-dien-3-on, β-sitostenon M champaca

[30], [58]

4

6-Hydroxystigmast-4-en-3-on,

6-hydroxystigmast-4,22-dien-3-on

M compressa var

formosana

[18]

sphaerantha [36] 1.1.4.4 Benzenoid

Các hợp chất benzenoid phân lập đƣợc từ chi Michelia L đƣợc trình

bày ở bảng sau:

Bảng 1.5 Benzenoid từ chi Michelia L

1 4-Hydroxybenzaldehyd, acid

4-hydroxybenzoic, methylparaben M alba [19]

2 Vanillic acid, syringaldehyd M

compressa

[38], [41]

Hình 1.4 Một số hợp chất lignan từ chi Michelia L

1.1.4.6 Các hợp chất khác

Bên cạnh các nhóm hợp chất nêu trên, các loài thuộc chi Michelia L

còn chứa các hợp chất khác nhƣ amid, acid béo, quinol, chlorophyll,

Năm 2008, từ lá của M alba, Chen và cộng sự đã phân lập đƣợc 3 hợp

chất cấu trúc aliphatic là acid palmitic, acid stearic và acid linoleic, 1 amid là

N-trans-feruloyltyramin và 2 chlorophyll là pheophorbid a và aristophyll-C

[19]

Từ loài M compressa, có 4 amid đƣợc phân lập là feruloyltyramin, N-cis-feruloyltyramin, N-trans-feruloylmethoxytyramin, N- cis-feruloylmethoxy-tyramin [19], [38]

N-trans-Hợp chất syringin đƣợc phân lập từ các loài M floribunda [41], M champaca [30]

Từ M champaca, các nhà nghiên cứu đã phân lập đƣợc 1 coumarin là scopoletin và 2 amid là N-trans-feruloyltyramin, N-cis-feruloyltyramin [30],

[58]

Từ thân cây M compressa var lanyuensis, Wang và cộng sự đã phân lập đƣợc 1 chlorophyl là pheophorbid b, (+)-O-methylarmepavin và 4- acetonyl-3,5-dimethoxy-p-quinol và 1 amid là N-trans-feruloyltyramin [54]

Sau đó, Wen Li Lo và cộng sự đã phân lập đƣợc thêm 2 hợp chất pressalanin

A và pressalanin B từ loài này [39]

Từ lõi thân của M compressa (Maxim.) Sargent var formosana

Kanehira, nhóm nghiên cứu từ Đài Loan đã phân lập đƣợc các hợp chất (11 1-oxoedudesm-4(14)-eno-13, 6α-lacton, annonbrain, blumenol A, aristolic

S)-acid II, 2,3-dihydro-1-benzofuran-5-yl]propan-1-ol, dehydrodiconiferyl alcohol, 1-

3-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-hydroxymethyl-7-methoxy-acetyl-β-carbolin, trans-feruloyloxyhexacosanoic acid, và các amid là formylanonalin, N-trans-feruloyltyramin, (-)-N-formyldehydroanonalin, N- trans-feruloylmethoxytyramin [18]

(-)-N-Từ phần trên mặt đất của loài M sphaerantha, J.Lin và cộng sự đã

phân lập đƣợc hợp chất nonacosan [36]

1.1.5 Tác dụng sinh học

Tác dụng nổi bật của các loài thuộc chi Michelia L là tác dụng chống

ung thƣ Ngoài ra, các loài này còn có các tác dụng nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng,

1.1.5.1 Tác dụng chống ung thư

Phân đoạn pentan và cloroform từ dịch chiết methanol vỏ thân cây M floribunda có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư biểu

mô vòm họng KB và ung thư máu P388 Các hợp chất phân lập được từ các phân đoạn này là costunolid, parthenolid, santamarin và liriodenin cũng có tác dụng ức chế đáng kể đối với các dòng tế bào trên [41]

Cao chiết cloroform từ vỏ cây M rajaniana có tác dụng ức chế mạnh

đối với dòng tế bào ung thư KB [43]

Cao chiết methanol và các hợp chất phân lập từ rễ M compressa thể

hiện tác dụng độc đối với các dòng tế bào ung thư MCF-7, NCI-H460 và

SF-268 [37]

Hợp chất 11,13-dehydrolanuginolid phân lập từ quả của loài M doltsopa thể hiện tác dụng độc trên dòng tế bào ung thư 9KB với ED50 = 1,8µg/ml [17]

Cao chiết ethanol từ vỏ thân M champaca có tác dụng ức chế sự phát

triển của tế bào ung thư da người Thành phần mang hoạt tính được xác định

là 2 hợp chất sesquiterpen lacton parthenolid và costunolid [28] Cao chiết từ hạt và hoa của loài này có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với IC50 lần lượt là 1,98 ± 0,31µg/ml và 1,86 ± 0,21µg/ml [57]

Một số hợp chất phân lập được từ M champaca thể hiện tác dụng độc đối với

các dòng tế bào ung thư vú và ung thư phổi [58]

Các hợp chất liriodenin và oliverolin được phân lập từ lõi thân M compressa var formosana thể hiện tác dụng độc đối với các dòng tế bào ung

thư biểu mô vòm họng (NPC-TW01), ung thư phổi tế bào không nhỏ H226), T cell leukemia, ung thư thận (A498), ung thư phổi (A549) và sacom

(NCI-xơ (HT1080) với IC50 trong khoảng 15,7–3,68 μM [18]

1.1.5.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng

Tinh dầu hoa M figo thể hiện tác dụng ức chế đối với các chủng vi khuẩn Bacillus sabtills, Escherichia coli và Mucor racemosus, tỉ lệ ức chế lần

lƣợt là 70,36%, 60,24% và 65,52% [16]

Tinh dầu chiết xuất từ phần trên mặt đất của M foveolata thể hiện tác dụng ức chế đối với các chủng vi khuẩn Salmonella enterica (MIC < 2 µl/ml), Staphylococcus epidermidis (MIC = 3 µl/ml), Staphylococcus aureus (MIC =

3 µl/ml) và Bacillus cereus (MIC = 4 µl/ml) [35]

Theo M.R Khan và cộng sự, một số cao chiết lá, vỏ thân, vỏ lá của loài

M champaca có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm [33] Cao chiết n-hexan

và chloroform từ lá loài này có tác dụng ức chế đáng kể với các dòng vi

khuẩn Pseudomonas sp., Salmonella sp., Staphylococcus aureus 1, 2 và Aspergillus niger [40]

Cao chiết từ hạt và hoa của M champaca có tác dụng kháng khuẩn Cao chiết từ hạt ức chế sự phát triển của các dòng vi khuẩn: Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Flavobacterium spp., Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholerae với MIC = 15,6 mg/l, Aeromonas hydrophila, Klebsiella sp

và V alginolyticus với MIC =31,3 mg/l và V parahaemolyticus với MIC =

125 mg/l Cao chiết từ hoa của loài này cho tác dụng ức chế các dòng tế bào

vi khuẩn sau: E tarda, E coli, Flavobacterium sp., P aeruginosa và V cholerae với MIC = 7,8 mg/l, A hydrophila, Klebsiella sp và V alginolyticus với MIC = 15,6 mg/l, Salmonella sp và V parahaemolyticus với MIC = 62,5

mg/l [57]

1.1.5.3 Tác dụng chống viêm

Cao chiết hoa của loài M champaca có tác dụng chống viêm in vivo

[44], [48] Cao chiết lá của loài này cũng thể hiện tác dụng chống viêm [29]

Năm 2014, nhóm nghiên cứu từ Đài Loan đã đánh giá tác dụng chống

viêm của các hợp chất phân lập đƣợc từ lõi thân M compressa var

formosana Kết quả thấy rằng roemerin và cyathisterol ức chế đáng kể sự sản

sinh nitric oxid (NO) với IC50 lần lượt là 8,5 ± 0,3 µg/ml và 9,6 ± 0,5 µg/ml [18]

1.1.5.4 Tác dụng khác

Cao chiết ethanol từ nụ hoa M champaca có tác dụng ức chế sự tăng

đường huyết trong bệnh tiểu đường [31]

Cao chiết ethanol từ lá M champaca có tác dụng chống oxy hóa [42],

thể hiện ở khả năng dọn gốc tự do DPPH và NO với IC50 là 30,07 µg/ml và 15,42 µg/ml, trong khi IC50 của acid ascorbic là 12,5 µg/ml và 4,07 µg/ml

[29] Ở một nghiên cứu khác, cao chiết lá M champaca cho tác dụng dọn gốc

tự do DPPH với IC50 = 5,41 µg/ml, gần bằng IC50 của chất chuẩn đối chiếu là acid ascorbic (IC50 = 4,59 µg/ml) [45]

Cao chiết từ hoa của M champaca có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình

gây tổn thương chuột bởi CCl4 [14]

Cao chiết từ M.alba có tác dụng bảo vệ da [22], [55]

1.2 Tổng quan về cây giổi – Michelia tonkinensis A Chev

Cây giổi, hay còn được gọi là giổi an nam, giổi lúa, giổi ngọt, có tên

khoa học là Michelia tonkinensis A Chev., tên đồng nghĩa là Talauma gioi A.Chev, Michelia gioii (A Chev.) Sim & Hong Yu, Michelia hypolampra Dandy, Michelia hedyosperma Y.W.Law, thuộc họ Ngọc Lan (Magnoliaceae)

[51]

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Giổi là cây gỗ cao đến 21 m, đường kính 20-25 cm, có khi tới 60 cm Bao chồi, cuống lá lúc non và đầu cành có màu sáng hay hơi bạc Cành non mảnh, đường kính 1-2 mm, màu nâu đen hoặc xám đen, không lông và có bì khổng thưa chạy dọc cành

Lá kèm rời Phiến lá dạng trứng ngược đến ellip – trứng ngược, dài

6-13 cm, rộng 5-5,5 cm, mỏng, dai, khi vò nát có mùi thơm gần giống lá Hồi

(Illicium), hai mặt lá màu xanh tươi, bóng, không lông; gân bên 8-10 cặp, khá

rõ ở cả hai mặt, gân bậc ba có dạng mạng lưới mảnh, dày, nổi rõ ở cả hai mặt; gốc lá dạng hình nêm, rộng, đầu lá có phần chóp tù; cuống lá dài 1-1,5 cm

Hoa có búp dạng ellip dài khoảng 2 cm, mọc ở nách lá, có nhiều lông màu sáng hay hơi bạc, hoa thơm Cánh hoa 9, chia làm 3 vòng, vòng ngoài mỏng, hơi kéo dài khoảng 15 x 2 mm, hai vòng cánh hoa trong dạng ellip hẹp 1,5-2 x 0,6 cm Nhị khoảng 25, dài 8-9 mm, chỉ nhị vươn dài ra tạo chóp nhọn dài 1-1,5 mm Cuống nhụy dài 4-5 mm và 2-3 cm ở quả, có lông màu sáng hay hơi bạc; bầu nhụy dạng trứng, vòi nhụy dài khoảng 2 mm; lá noãn 10, dạng ellip hẹp, dài 6-7 mm, 5 gờ; noãn 6-8 trong mỗi lá noãn Quả bì dày, dài 1,5-2 cm, các đại chín màu xám đen, có dạng ellip, 2-4,5 x 1-2,5 cm, nhiều bì khổng, đáy mỗi đại thắt lại tạo cọng ngắn 2-8 mm, đầu có dạng mỏ chim, các mảnh của đại dày, vỏ quả trong nhẵn bóng khi chín Hạt 1-4 trong mỗi đại chín, kích thước 9-10 x 6-8 mm [9]

1.2.2 Sinh thái và phân bố

Sinh thái: cây giổi thường phân bố trong rừng lá rộng, ở độ cao từ

300-800 m so với mặt nước biển Giổi là cây ưa sáng, khi còn nhỏ chịu bóng, mọc nhanh Cây ra quả hàng năm nhưng không đều Mùa hoa từ tháng 1 đến tháng

4, mùa quả từ tháng 9 đến tháng 10 [2]

Phân bố: cây giổi phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc như Hòa Bình,

Tuyên Quang, Hà Giang, Thanh Hóa, Lào Cai, Phú Thọ, [9]

và 18,5 % (hạt) Tinh dầu ở thân chứa chủ yếu là camphor (23,8%) Tinh dầu

vỏ cây chứa camphor (15,7%), safrol (14,3%), β-caryophylen (15,6%) và

elemicin (13,7%) Tinh dầu lá có thành phần chủ yếu là elemicin (46,3%) và

β-caryophylen (16,9%) [2]

Năm 2011, từ hạt của cây giổi, nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc đã

phân lập đƣợc 12 hợp chất là michehedyosid A–F, eugenol, eugenol

4-O-β-d-glucopyranosid, martynosid, alaschaniosi C, 3,4-methylenedioxycinnamyl

alcohol và (+)-pinoresinol 4-O-β-d-glucosid [56]

Theo một nhóm nghiên cứu ở Nga, thành phần chính của tinh dầu giổi

là safrol (41,44%) và myristicin (45,12%) [60]

Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Đài, hàm lƣợng tinh dầu trong lá giổi là

0,15% (tt/kl) theo khối lƣợng tuyệt đối, với các thành phần chính là α-pinen (40,3%), β-phellandren (7,6%), β-pinen (7,4%) và bicyclogermacren (7,3%)

[24] Thành phần của tinh dầu lá giổi đƣợc trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.7 Một số thành phần của tinh dầu lá giổi [24]

Thành phần

Hàm lƣợng (%)

Thành phần

Hàm lƣợng (%)

Thành phần

Hàm lƣợng (%)

α-thujen 0,2 β-cubeben 1,8 terpinen-4-ol 0,8

α-pinen 40,3 β-caryophyllen 6,9 bicycloelemen 5,4

β-pinen 7,4 allo-aromadendren 0,5 α-copaen 1,2

α-phellandren 0,6 bicyclogermacren 7,3 α-cadino 0,3

β-phellandren 0,5 (E,E)-α-farnesen 0,3 (E,E)-farnesol 1,1

(E)-β-ocimen 0,9 spathulenol 0,4 allo-ocimen 0,5 caryophyllen

1.2.4 Tác dụng sinh học

Nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học của cây giổi cũng còn rất hạn chế

Theo nhóm nghiên cứu tại Nga, tinh dầu giổi có tác dụng ức chế 59%

sự phát triển của nấm Candida albicans [60]

1.2.5 Công dụng

Theo y học cổ truyền, quả và hạt giổi có vị cay, thơm, tính ấm Vỏ cây

có vị đắng, hơi thơm, tính ấm Cả quả và vỏ cây đều có tác dụng tiêu thực, khu phong, thanh nhiệt

Quả và vỏ cây giổi đƣợc dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa, trị đau bụng, ăn không tiêu Vỏ cây còn đƣợc dùng làm thuốc chữa sốt Ngày dùng 6-

10 g quả, 20-30 g vỏ cây, sắc uống Quả (100 g) hoặc vỏ cây (200 g) còn đƣợc ngâm với 500 ml rƣợu 40o

để xoa bóp chữa đau nhức, tê thấp Quả và hạt giã với muối đƣợc dùng làm gia vị hoặc cất lấy tinh dầu [2]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất

- Mẫu lá của cây để nghiên cứu đặc điểm vi học phần lá

- Mẫu hạt tách từ quả thu hái tại 3 thời điểm (đầu tháng 9, giữa tháng 9, khi hạt tự rụng xuống đất) và mẫu lá để nghiên cứu định tính, định lượng tinh dầu và xác định các cấu tử trong tinh dầu

- Mẫu lá để chiết xuất và phân lập các hợp chất hóa học

- Nơi thực hiện đề tài: Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược Liệu, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - Đại học khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia Hà Nội

- Số hiệu tiêu bản HNIP/18518/17

- Nơi lưu mẫu: Phòng tiêu bản cây thuốc- Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: cloramin, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như methanol, n-hexan,

ethyl acetat, dichlomethan, aceton đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được cất

2.1.3 Trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm

- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường (0,040 - 0,063

mm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd) Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng

pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol 96% và sấy bản mỏng ở 105oC để phát hiện vết chất

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

- Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Memmert (Memmert, Đức), tủ sấy Binder-FD115 (Binader, Thụy Sĩ), máy cất quay Rotavapor R-

200 (Buchi, Thụy Sĩ), máy siêu âm Power sonic 405, cột thủy tinh các loại

- Máy ảnh kỹ thuật số

- Kính hiển vi leica DMSL, kính soi nổi

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190 nm-800 nm, hãng Shimadzu

- Máy đo độ nóng chảy Stuart –SMP 3

- Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT/IR-6300A tại Khoa hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối phân giải cao Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội là tetramethyl silan (Brucker, Đức)

- Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp giám định tên khoa học và nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Giám định tên khoa học:

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cành mang hoa, quả và lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình

thái thực vật, so sánh với các khóa phân loại của chi Michelia L dưới sự

hướng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật [3], [6], [13]

 Nghiên cứu đặc điểm thực vật:

- Đặc điểm hình thái: mô tả đặc điểm hình thái thực vật của mẫu cây giổi nghiên cứu bằng cách quan sát bằng mắt thường, kính lúp, kính soi nổi, quan sát điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa

- Đặc điểm vi học: cắt, làm tiêu bản vi phẫu và soi bột lá, hạt Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi [3]

2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu

- Hàm lượng tinh dầu trong các mẫu hạt giổi nghiên cứu được định

lượng bằng phương pháp cất kéo hơi nước

- Hàm lượng tinh dầu trong mỗi mẫu được tính theo công thức:

X (%) = a x 100

b Trong đó: X: Hàm lượng tinh dầu trong mẫu (%) (tt/kl)

a: Thể tích tinh dầu thu được sau khi định lượng (ml)

b: Khối lượng dược liệu sau khi đã trừ độ ẩm (g)

- Xác định hàm lượng nước trong dược liệu tươi: theo Dược điển Việt Nam

C

Việc định danh các cấu tử trong tinh dầu được thực hiện bằng cách so sánh các giá trị chỉ số khóa thời gian lưu (retention time index, RI) và phổ

khối lượng của chúng với các hợp chất tham khảo được công bố bởi Adams

và hệ thống dữ liệu MS từng hợp chất từ thư viện phổ MS Wiley 8th

kết hợp NIST 2008 Các giá trị chỉ số khóa thời gian lưu của từng cấu tử trong tinh dầu được xác định qua dãy đồng đẳng alkan C8-C28.

2.2.4 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

2.2.4.1 Phương pháp chiết xuất

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng, dùng dung môi methanol ở nhiệt độ 60oC (chiết 3 lần mỗi lần 3 giờ) Dịch chiết được gộp lại và cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu được cao chiết methanol đặc Cao chiết được phân tán vào nước cất, sau đó chiết lỏng – lỏng lần lượt với

các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichlomethan, ethyl acetat,

thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng Cất thu hồi dung môi dưới áp

suất giảm thu được các cao phân đoạn tương ứng là n-hexan, dichlomethan,

- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol 96%

DC-2.2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật

lý (nhiệt độ nóng chảy) và các phương pháp phổ bao gồm: phổ IR, phổ khối

lượng (APCI-MS hoặc ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hat nhân và so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu đã công bố

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây gỗ, thường xanh, cao khoảng 20 m, đường kính đến 60 cm

Lá kèm rời Phiến lá dạng trứng ngược, dài 7-13 cm, rộng 5-5,5 cm Lá dai, mỏng, khi vò nát có mùi thơm, hai mặt đều màu lục sẫm, bóng, không có lông, gân lá lông chim, gân bên 8-10 cặp, khá rõ ở cả hai mặt Gốc lá hình nêm, rộng, đầu lá có phần chóp hơi tù, cuống lá dài 1-1,5 cm

Hoa có búp dạng ellip dài 1-2 cm, mọc đơn độc ở nách lá, có nhiều lông màu sáng hay hơi bạc, hoa thơm Hoa mẫu 3,xếp xoắn trên đế hoa lồi, kích thước cánh hoa khoảng 2-3 x 15-25 mm ở bên ngoài , cánh hoa bên trong kích thước khoảng 1,5 -2 x 0,3-0,6 mm

Nhị khoảng 25, dài 8-10 mm, trung đới vươn dài tạo thành chóp nhọn dài 1-1,5 mm, bao phấn nứt dọc Bầu nhụy dạng trứng, vòi nhụy dài khoảng 2

mm, lá noãn 6-9, dạng ellip hẹp, dài 6-7 mm

Quả bì dày, dài 2-5cm Quả chín màu nâu sáng, có dạng ellip, 2,5 cm, vỏ ngoài sần sùi, nhiều lỗ bì , vỏ quả trong nhẵn bóng, đáy mỗi quả thắt lại tạo cuống ngắn 2-8 mm, đầu có dạng mỏ chim Mỗi quả có 1-6 hạt màu cam, kích thước 7-10 x 9-10 mm

2-4,5x1-Dựa vào các đặc điểm hình thái nêu trên, đối chiếu với các tài liệu [4], [5], [9], [20], [27], [52], khẳng định mẫu nghiên cứu thu ngày 15/3/2017 và

1/9/2017 tại xã Chí Đạo, huyện Lạc Sơn, tỉnh Hòa Bình là loài Michelia tonkinensis A Chev., thuộc họ Ngọc Lan (Magnoliaceae) Kết quả nghiên

cứu được giám định bởi Thạc sĩ Nghiêm Đức Trọng, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (phiếu giám định ngày 6/10/2017) (xem phụ lục 1)

Đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu được minh họa ở hình 3.1.:

Hình 3.1 Đặc điểm của cây giổi

Ghi chú: a: cành mang hoa, b: lá, c: cuống lá, d: mũi lá, e: mặt trên lá, f: mặt

dưới lá, g: cụm quả trưởng thành, h: hạt, i: quả mang hạt, j: hạt cắt ngang, k: nội nhũ, l: các bộ phận của hoa, m: hoa nhìn từ mặt trên, dưới và ngang, n, o, p: tràng, q: nhị, r: noãn, s: mặt noãn cắt ngang, t: bộ nhị, nhụy, u: búp hoa, v: cụm quả đang phát triển

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá

Vi phẫu lá (hình 3.2) có thiết diện đối xứng qua trục giữa, mặt trên phẳng, mặt dưới lồi Cấu tạo gồm các phần sau:

Gân lá: Biểu bì gồm các tế bào hình tròn xếp thành một lớp ngoài cùng

của gân lá (1) Dưới biểu bì là mô dày gồm 2-3 dãy tế bào thành dầy (3) Dưới

mô dày là mô mềm gồm các tế bào đa giác cạnh mỏng không đều (4), có các túi tiết tinh dầu (2) Trong mô mềm có xuất hiện rải rác các tế bào cứng (8) Ở giữa là cung libe gỗ, vòng gỗ phía ngoài khép kín (5), libe gỗ(6) Trong cùng

là mô mềm gồm các tế bào đa giác thành mỏng (7)

Hình 3.2 Đặc điểm vi phẫu lá giổi

1: Biểu bì, 2: Túi tiết tinh dầu, 3: Mô dày, 4,7: Mô mềm,

5: Mô cứng, 6: Libe , 8: Tế bào cứng

Hình 3.3 Đặc điểm bột lá giổi

1: Lỗ khí, 2: Mảnh biểu bì mang lỗ khí, 3: mảnh phiến lá, 4: Mảnh biểu bì, 5:

Mảnh mô mềm, 6: Mảnh mạch, 7: Túi tiết tinh dầu, 8: Bó sợi

Hình 3.4 Đặc điểm bột vỏ quả giổi

1: Tế bào cứng, 2: Tinh thể calci oxalat, 3: Mảnh mô mềm,

4, 5, 6: Các mảnh mạch

áo hạt mài cam, tế bào thành mỏng xếp lộn xộn (5)

Hình 3.5 Đặc điểm bột hạt giổi

1: Giọt tinh dầu, 2: Giọt dầu béo, 3: Mảnh nội nhũ, 4: Mảnh áo hạt 3.2 Kết quả nghiên cứu tinh dầu từ hạt và lá giổi

3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu từ lá và hạt giổi

Hàm lƣợng tinh dầu trong lá và hạt giổi đƣợc tính theo phần trăm thể tích/khối lƣợng (tt/kl) Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.1

Mẫu 1: mẫu hạt tách từ quả thu hái đầu tháng 9

Mẫu 2: mẫu hạt tách từ qả thu hái giữa tháng 9

Mẫ 3: mẫu hạt tách từ quả tự rụng, cuối tháng 9