Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của dây hoàng liên (arcangelisia flava (l ) merr )

Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của Dây hoàng liên Arcangelisia flava L..

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 2

1.1.1 Đặc điểm chung của các cây thuộc họ Tiết dê 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật loài Arcangelisia flava (L.) Merr 4

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG 6

1.3.1 Tác dụng dược lý của Arcangelisia flava (L.) Merr 6

1.3.2 Tác dụng dược lý của berberin 7

1.3.3 Công dụng 8

1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN 9

1.4.1 Thành phần và cấu trúc ADN 9

1.4.2 Quá trình sao chép ADN 10

1.4.3 Các loại chỉ thị ADN 10

1.4.4 Chỉ thị RAPD trong kỹ thuật PCR 11

1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT IN VITRO THÔNG QUA MÔ HÌNH HOẠT HÓA AMPK 13

1.5.1 Vài nét về bệnh đái tháo đường 13

1.5.2 Vai trò của AMPK trong đái tháo đường 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Dung môi, hóa chất 16

2.1.3 Máy móc, thiết bị 18

2.1.4 Tế bào và động vật thí nghiệm 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 19

2.2.1.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái 19

2.2.1.2 Nghiên cứu về đặc điểm vi học 20

2.2.2 Nghiên cứu về đa dạng di truyền 20

2.2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 20

2.2.2.2 Khuếch đại ADN bằng PCR sử dụng chỉ thị RAPD 21

2.2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 22

2.2.2.4 Phương pháp phân tích số liệu 23

2.2.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học 23

2.2.3.1 Định tính các nhóm chất hóa học trong mẫu nghiên cứu 23

2.2.3.2 Định tính thành phần berberin, palmatin trong dịch chiết alcaloid của mẫu nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng 24

2.2.3.4 Định lượng berberin bằng HPLC 26

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu về tác dụng sinh học 29

2.2.4.1 Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng 29

2.2.4.2 Thử tác dụng hạ đường huyết in vitro trên mô hình hoạt hóa AMPK 30

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật và đa dạng di truyền của Dây hoàng liên 31

3.1.1 Đặc điểm thực vật của Dây hoàng liên 31

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái 31

3.1.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 34

3.1.1.3 Đặc điểm vi học bột dược liệu 35

3.1.2 Đa dạng di truyền của Dây hoàng liên 37

3.1.2.1 Kết quả tách chiết AND tổng số 37

3.1.2.2 Kết quả phân tích đa hình ADN bằng chỉ thị RAPD 38

3.1.2.3 Xác định hệ số tương đồng di truyền và cây quan hệ di truyền 44 3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học của Dây hoàng liên 45

3.2.1 Định tính thành phần hoá học của Dây hoàng liên 45

3.2.1.1 Định tính bằng phản ứng hoá học 45

3.2.1.2 Định tính berberin và palmatin trong Dây hoàng liên bằng sắc ký lớp mỏng 48

3.2.1.3 Xây dựng cây phân loại quan hệ gần gũi của các mẫu AR1 – AR8 dựa trên hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid toàn phần 49

3.2.2 Định lượng thành phần berberin trong các mẫu Dây hoàng liên 50

3.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 50

3.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 50

3.2.2.3 Định lượng berberin trong các mẫu 56

3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học của Dây hoàng liên 57

3.3.1 Tác dụng hạ đường huyết in vitro thông qua mô hình hoạt hoá AMPK của Dây hoàng liên 57

3.3.2 Thử độc tính cấp của Dây hoàng liên 58

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 60

4.1 Về đặc điểm thực vật và đa dạng di truyền 60

4.1.1 Về đặc điểm hình thái 60

4.1.2 Về đa dạng di truyền 60

4.2 Về thành phần hoá học 61

4.2.1 Về thành phần alcaloid có trong các mẫu nghiên cứu 61

4.3 Về tác dụng sinh học 63

4.3.1 Tác dụng hoạt hoá AMPK của các mẫu Dây hoàng liên 63

4.3.2 Độc tính cấp 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AMPK Adenosin monophosphat – activated protein kinase

HPLC High-Performance Liquid Chromatographic HPTLC High-Performance Thin Layer Chromatographic

MRC5 Medical Research Council cell strain 5

SCARs Sequence Characterized Amplified Region

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.2 Các hóa chất dung môi sử dụng trong HPLC 16

Bảng 2.4 Đặc điểm hình thái mô tả mẫu nghiên cứu 19

Bảng 3.1 Các đặc điểm phân biệt về hình thái về lá của mẫu

Bảng 3.2 Thống kê số băng ADN thu được của 8 mẫu loài Dây

Bảng 3.3 Bảng tóm tắt thống kê phân tích đa hình PCR-RAPD

Bảng 3.4 Số băng ADN thu được của 8 mẫu giống thuộc loài Dây

Bảng 3.5 Số băng ADN thu được của 8 mẫu giống loài Dây

Bảng 3.6 Số băng ADN thu được của 8 mẫu giống loài Dây

Bảng 3.7 Hệ số tương đồng di truyền giữa 8 mẫu loài Dây hoàng

Bảng 3.8 Thành phần hoá học của Dây hoàng liên 45 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký 51

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ và diện

AR1) Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 55

Bảng 3.13 Kết quả hàm lượng berberin trong các mẫu Dây hoàng

Bảng 3.14 Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK so với lô chứng 57 Bảng 3.15 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ 58 Bảng 3.16 Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.3 Công thức hóa học của các alcaloid chính trong

Hình 1.4 Công thức hóa học của các furanoditerpen đƣợc phân

Hình 3.1 Các đặc điểm hình thái của cây Dây hoàng liên 32 Hình 3.2 Hình dạng phiến lá của 8 mẫu loài Dây hoàng liên 33 Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân (A) và lá (B) của mẫu AR1 35 Hình 3.4 Đặc điểm bột thân của Dây hoàng liên 36

Hình 3.6 Ảnh điện di ADN tổng số của 8 mẫu giống loài Dây

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 8 mẫu Dây

hoàng liên với mồi OPN6 (M: marker 1kb) 40

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 8 mẫu giống

nghiên cứu với mồi OPF13 (M: marker 1kb) 41

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 8 mẫu giống

nghiên cứu với mồi S208 (M: marker 1kb) 43

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây quan hệ di truyền 8 mẫu loài Dây hoàng

Hình 3.13 Cây phân loại các mẫu Dây hoàng liên dựa vào thành

phần hoá học trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng 50

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu trắng (dung môi pha mẫu) (A), mẫu

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và

Hình 3.16 Hình ảnh mức độ biểu hiện của p-AMPK và β-actin 57

Hình 3.17 Số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô ủ với mẫu thử so

dê gồm có: Vàng đắng (Coscinium usitatum Pierre.), Hoàng đằng (Fibraurea tinctoria Lour.), chủ yếu được dùng để chiết xuất berberin

Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin có trong nhiều loài thực vật bậc cao và là hoạt chất được sử dụng lâu đời trong các nền y học truyền thống Ngoài các tác dụng thường được biết đến như tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng đơn bào, hạ huyết áp,… [3], [46], [66], berberin mới được chứng minh có tác dụng hạ đường huyết và chống lại một số dòng tế bào ung thư [37], [55], [61]

Dây hoàng liên (Arcangelisia flava (L.) Merr.) là một loài thuộc họ Tiết

dê, được ghi trong Sách đỏ Việt Nam [2] và đã được sử dụng nhiều trong các nền y học truyền thống và được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu Đây cũng là một trong các dược liệu có chứa berberin [55], [59] Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về loài này vẫn chưa được đầy đủ Bên cạnh đó, các nguồn dược liệu chứa berberin đang dần cạn kiệt do tình trạng khai thác một cách bừa bãi, ồ ạt

Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh

học của Dây hoàng liên (Arcangelisia flava (L.) Merr.)” được thực hiện với

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ

1.1.1 Đặc điểm chung của các cây thuộc họ Tiết dê

Họ Tiết dê (Dây mối, Phòng kỷ) – Menispermaceae Juss., 1789

Tên tiếng Anh: Moonseed family

Dây leo, rễ có khi phình thành củ Lá đơn, nguyên, mọc so le; gân hình chân vịt hay lọng; cuống lá thường phồng lên ở gốc Hoa nhỏ, đơn tính khác gốc, mẫu 3, xếp vòng Đài 6, xếp thành 2 vòng Tràng 6, xếp thành 2 vòng Hoa đực có 6 nhị, xếp thành 2 vòng; có khi bao phấn nằm ở mép một đĩa mật hình nấm Hoa cái có (1)-3-(6-32) lá noãn rời nhau Quả hạch hay quả mọng Hạt thường có hình móng ngựa, phôi cong

Hình 1.1 Họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.,)

1 Dạng sống, 2-3 Hoa cái, 4-7 Các dạng hoa đực, 8 Sơ đồ hoa, 9

nghiệp dược là Bình vôi, Dây đau xương, Hoàng đằng, Phòng kỷ, Vàng đắng [4]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari

Cây dây leo lớn hóa gỗ Lá có cuống dài, phiến lớn; gân gốc 3-5; gân lá hình chân vịt, gân giữa mang mỗi bên 1-2 gân Cụm hoa chùm ở nách lá, phân nhánh hình bông Hoa đực có 6 lá đài mà 3 cái ngoài nhỏ, 3 cái trong hơi lớn hơn các cánh hoa; cánh hoa 3; nhị 9-12, chỉ nhị không rõ, bao phấn dính nhau thành hình đầu, có 4 thùy ít phân biệt, mở ngang Hoa cái có bao hoa như hoa đực; lá noãn 3, mỗi cái chứa 2 noãn; đầu nhụy mập dày, có 3 góc Quả hạch

có vân lăn tăn hoặc bị gặm, hình trứng –trụ, có một rãnh vòng quanh, mặt ngoài có lông Vỏ quả ngoài dai, vỏ quả trong cứng Hạt có nhiều phôi nhũ quanh phôi; lá mầm nhỏ, không thẳng [76], [82], [85]

Số lượng loài và phân bố của chi Arcangelisia Beccari:

Hiện nay có 3 tên loài (IPNI) đã được biết đến trong chi Arcangelisia

Beccari bao gồm:

Arcangelisia flava (L.) Merr

Arcangelisia gusanlung H.S.Lo

Arcangelisia tympanopoda Diels

Loài Arcangelisia flava (L.) Merr phân bố rộng khắp vùng Đông Nam

Á, gặp nhiều ở Thái Lan, Việt Nam và Hải Nam (Trung Quốc) Ở nước ta cây mọc nhiều ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai Ngoài ra, người ta còn thấy loài này phân bố ở Sumatra, Java, Philippines, phía bắc Moluccas đến New Guinea [60]

1.1.3 Đặc điểm thực vật loài Arcangelisia flava (L.) Merr

Loài Arcangelisia flava (L.) Merr có tên là Cổ an, Dây hoàng liên, Vảy

đắng

Hình 1.2 Arcangelisia flava (L.) Merr

1 Cành mang lá và quả; 2 Hoa đực đã nở; 3 Nụ hoa đực

Dây leo to, có thể dài tới 20m, đường kính thân có thể lên tới 5cm; gỗ vàng tươi, mủ vàng; cành non không lông, đen, cũng như cuống lá Phiến to

hay trung bình, (10)-12-25 x (4,5)-8-19cm, dai cứng, không lông, gốc tròn hay hình tim, gân 5 từ đáy; cuống 3-15cm, phù 2 đầu, không có bẹ lá Chùy 10-50 cm; hoa đực nhỏ, 3 lá đài ngoài, 3-3 lá đài trong, nhị thành đầu tròn Hoa cái có 6 lá đài, nhị lép như vảy, 3 lá noãn Trái xoan, dài 2cm, vàng, trên

đế hoa phù rộng Hạt hình bầu dục với nội nhũ và lá mầm bẻ gập lại [10], [20]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Niwat Keawpradub và cộng sự (2005) [59] đã chiết xuất và phân lập

được các alcaloid thuộc nhóm protoberberin trong Arcangelisia flava (L.)

Merr với các hoạt chất chính là berberin, palmatin, jatrorrhizine

Hình 1.3 Công thức hóa học của các alcaloid chính trong

Arcangelisia flava (L.) Merr

Một số alcaloid khác nhƣ columbamin, dehydrocorydalmin,

homoaromolin và thalifendin cũng đƣợc phân lập từ thân của Arcangelisa

flava (L.) Merr [63]

Toshisada Suzuki và cộng sự (2011) [71] đã chứng minh trong rễ của

Arcangelisia flava (L.) Merr có chứa 2 hoạt chất thuộc nhóm furanoditerpen

là 2α,3α-epoxy-2,3,7,8α-tetrahydropenianthic acid methyl ester và 2α,3α epoxy-2,3-dihydropenianthic acid methyl ester Ngoài ra, có các chất khác nhƣ fibraurin, fibleucin, 2β,3α-dihydroxy-2,3,7,8α-tetrahydropenianthic acid-

2,17-lactone, p-hydroxy-benzaldehyd và vanillin cũng đƣợc chiết xuất và phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr

Hình 1.4 Công thức hóa học của các furanoditerpen đƣợc phân lập từ

Arcangelisia flava (L.) Merr

(1): 2α,3α -epoxy-2,3,7,8α -tetrahydropenianthic acid methyl ester;

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG

1.3.1 Tác dụng dược lý của Arcangelisia flava (L.) Merr

Niwat Keawpradub và cộng sự (2005) [59] trong nghiên cứu của mình

cũng đã chứng minh dịch chiết methanol và dịch chiết nước của Arcangelisia flava (L.) Merr có khả năng chống oxy hóa trong thử nghiệm dùng DPPH với

EC50 lần lượt là 25,7±1,7 μg/ml và 68,3±0,8 μg/ml Trong khi đó dịch chiết

chloroform và dịch chiết methanol của Arcangelisia flava (L.) Merr lại thể

hiện khả năng gây độc tế bào trong thí nghiệm trên dòng tế bào MCF-7 với

IC50 lần lượt là 8,6±1,0 μg/ml và 7,7±0,6 μg/ml

Nghiên cứu của Niwat Keawpradub và cộng sự cũng chỉ ra rằng các

hoạt chất thuộc nhóm protoberberin có trong Arcangelisia flava (L.) Merr

cũng có tác dụng gây độc tế bào tôm nước mặn và dòng tế bào MCF-7 với

LC50 và IC50 lần lượt nằm trong khoảng 37 – 206μg/ml (110 – 611μM) và 1 – 4μg/ml (3,0 – 11,5μM) Trong đó, đáng chú ý là berberin có khả năng gây độc

tế bào mạnh nhất với LC50 và IC50 lần lượt là 37,1μg/ml (110,4μM) và 1,0μg/ml (3,0μM)

Julie Nguyen-Pouplin và cộng sự (2007) [49] đã chứng minh trong số

38 loài cây trong cùng nghiên cứu, Arcangelisia flava (L.) Merr thể hiện tác

dụng chống sốt rét tương đối mạnh với IC50 nằm trong khoảng 0,4 – 1,1μg/ml

(nghiên cứu thực hiện trên chủng Plasmodium falciparum FcB1) Nghiên cứu

này cũng chứng minh khả năng gây độc tế bào của các phân đoạn chiết xuất

từ thân Arcangelisia flava (L.) Merr trên các dòng tế bào HeLa và MRC5

với IC50 lần lượt nằm trong khoảng 8,8 – 40,7μg/ml và 56,5 – 155,0μg/ml

Toshisada Suzuki và cộng sự (2011) [71] đã chứng minh các

furanoditerpen có trong cây Arcangelisia flava (L.) Merr có hoạt tính chống

nấm, trong đó chất 2β,3α-dihydroxy-2,3,7,8α-tetrahydropenianthic

acid-2,17-lactone thể hiện tác dụng chống nấm mạnh nhất trên hai chủng Trametes versicolor (48,6%) và Fomitopsis palustris (62,3%) ở nồng độ 100ppm

1.3.2 Tác dụng dược lý của berberin

Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin, có trong khoảng 150 loài thực vật bậc cao [8] Nó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyền thống trên thế giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính kháng khuẩn, nấm, đơn bào,…và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnh đang phát triển như tiểu đường, ung thư, tăng mỡ máu,… Các tác dụng đã được chứng minh của berberin bao gồm:

(1) Tác dụng kháng khuẩn: Berberin có phổ kháng khuẩn rộng đối với

một số chủng gram (+) và gram (-), như Streptococcus, Pneumococcus, Vibrio cholera, Bacillus anthracis, Streptococcua viridians, Sh shigae, Sh flexneri, Bacillus diphtheria, B subtilus, B typhoid, Tác dụng này có liên

quan đến tác dụng ức chế sinh tổng hợp RNA, ADN và protein của vi khuẩn

[3] Berberin có thể sử dụng để chống lại Staphylococcus aureus đã kháng

kháng sinh Methicillin [78]

(2) Tác dụng kháng nấm: Berberin sulfat ức chế sự sinh trưởng của

nhiều nấm, như Alternaria spp Aspergillus flavus, A fumigates, Candida albicans, Curvularia spp., Drechslera spp., Fusarium spp., Rhizopus oryzae, Scophulariopsis spp.,… [3]

(3) Tác dụng kháng đơn bào: Berberin bằng đường uống có tác dụng ức

chế sự sinh trưởng của amip, diệt Typanosoma brucei rhodesiense [3]

(4) Tác dụng chống ung thư: Ngày nay, berberin được chú ý rất nhiều

tới tác dụng chống ung thư [69] do nó có thể ngăn chặn nhiều loại tế bào ung thư như ung thư vú [50], bệnh bạch cầu, u ác tính [69], ung thư da, ung thư gan, ung thư tuyến tụy [58], ung thư miệng, ung thư lưỡi [46]

(5) Tác dụng hạ huyết áp: Berberin sulfat gây hạ huyết áp và làm chậm

nhịp tim Tác dụng này có thể do ức chế α –andrenoceptor chứ không phải do tác dụng giãn mạch [3]

(6) Tác dụng hạ đường huyết: Berberin đã được thử nghiệm và sử dụng

thành công trên thực nghiệm [73] và trên người mắc bệnh tiểu đường [44] Đặc biệt là tác dụng của berberin và các dược liệu chứa hoạt chất này trên đái tháo đường type 2 [64] Nghiên cứu của Chunhua Chen và cộng sự (2010) đã chứng minh berberin có khả năng ức chế hoạt động của enzym protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) và bắt chước hoạt động của insulin [38]

(7) Tác dụng chống loét đường tiêu hóa: Berberin có tác dụng ức chế sự hình thành loét và hiện tượng chảy máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [3]

(8) Tác dụng lợi mật: Berberin có tác dụng tăng cường sự phân tiết bilirubin mật, tiêm tính mạch với liều rất nhỏ cũng có tác dụng rõ rệt [3]

(9) Các tác dụng khác: Berberin có tác dụng an thần, tăng cường thời gian gây ngủ của phetobarbital, gây tê cục bộ, giảm tác dụng chống đông máu của heparin, ức chế kết tập tiểu cầu nhỏ [3]

Độc tính: Trên chuột cống trắng bằng đường uống, berberin sulfat có

LD50 = 1.000mg/kg, và bằng đường tiêm phúc mạc là 90 mg/kg Nghiên cứu

về tổ chức học cho thấy berberin không gây nên những thay đổi đáng kể về tổ chức học của các cơ quan trong cơ thể cả khi dùng berberin sulfat với liều lớn (50 mg/kg) trong 6 tuần lễ liên tục Berberin dạng tiêm có thể gây dị ứng [3]

Với các tác dụng truyền thống và các các tác dụng mới phát hiện trong điều trị tiểu đường và ung thư cũng như tính an toàn trong sử dụng, berberin ngày càng được sử dụng nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam với hàng chục sản phẩm đang được sản xuất tại các công ty Dược trong nước

1.3.3 Công dụng

Theo Y học cổ truyền, vị thuốc là thân leo và rễ của Dây hoàng liên có

vị đắng, tính bình, hơi có độc; có tác dụng thanh nhiệt giải độc, chữa sốt rét

và sốt không rõ nguyên nhân [10], [44], [62]

Ở Thái Lan, gỗ cây dùng lợi tiêu hoá, bổ huyết, làm thuốc điều kinh và trừ tiêu chảy Rễ được dùng làm thuốc nhuận tràng

Ở Philippines, Dây hoàng liên được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, nước sắc gỗ và thân leo được dùng để điều trị vết thương, vết loét, kích ứng

da, bệnh răng miệng, sốt, điều kinh, điều trị sảy thai,…[59]

1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN

Có 4 loại base nitơ gồm: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine), C (Cytosine) tương ứng với 4 loại nucleotide: dATP, dTTP, dGTP, dCTP

Mạch đơn tạo thành nhờ liên kết phospho-diester 3᾽-5᾽ giữa gốc phosphate ở đầu 5᾽ của nucleotide này với nguyên tử carbon 3᾽ ở gốc đường của nucleotide bên cạnh Hai mạch đơn liên kết với nhau bằng liên kết hydro giữa các nucleotide (giữa nhóm CO-NH2 và N-NH) theo nguyên tắc bổ sung như sau: A và T liên kết với nhau bằng 2 liên kết hydro, G và C liên kết với nhau bằng 3 liên kết hydro Nhờ nguyên tắc bổ sung này mà khi biết trình tự sắp xếp các nucleotide trên một mạch ta có thể biết trình tự trên mạch còn lại [28]

1.4.2 Quá trình sao chép ADN

Sao chép ADN là một quá trình phức tạp nhưng đều trải qua các giai đoạn sau:

- Các liên kết hydro giúp ổn định cấu trúc xoắn và gắn hai mạch đơn với nhau

bị phá vỡ và phân tử ADN tách thành hai sợ đơn Giai đoạn này gọi là giai đoạn biến ADN, cần có protein đặc hiệu nhận biết điểm khởi phát sao chép và enzym tháo xoắn

- Đoạn mồi (primer), tức đoạn ADN hay ARN mạch đơn ngắn, bắt cặp với mạch khuôn

- Đủ 4 loại nucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) bắt cặp bổ sung với các nucleotide mạch khuôn nhờ các enzym ADN-polymerase

- Mạch mới tổng hợp theo chiều 5᾽P →3᾽OH

- Các nucleotide mới được gắn lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo mạch mới

Mỗi bước được điều khiển bởi enzym đặc hiệu và được thực hiện một cách chính xác, nhanh chóng [28]

1.4.3 Các loại chỉ thị ADN

Thông tin di truyền được lưu trữ trong phân tử ADN là nguồn thông tin

để tổng hợp mọi protein của cơ thể, đồng thời là nguồn thông tin di truyền lại cho thế hệ sau Tính đa dạng của sinh giới có thể nói là hệ quả của sự đa dạng

về trình tự ADN Như vậy, muốn nghiên cứu và phân loại các sinh vật khác nhau, bên cạnh con đường truyền thống là dựa vào các đặc điểm hình thái, ta

có thể dựa trên các đặc điểm di truyền và ADN, coi đó như một chỉ thị phổ biến [31]

Các loại chỉ thị thường dùng trong kỹ thuật di truyền bao gồm: chỉ thị dựa cơ sở lai ADN (RFLP); chỉ thị dựa trên kỹ thuật PCR (STS, RAPD, AFLP, SSR)

1.4.4 Chỉ thị RAPD trong kỹ thuật PCR

Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic AND – đa hình các

đoạn AND khuếch đại ngẫu nhiên) được sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những đoạn ADN hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 6-12 nucleotide dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) Sản phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những alen ADN đặc trưng Khi phân tích phổ băng RAPD, nếu 2 mẫu có phổ băng giống nhau nhiều thì chúng có quan hệ di truyền gần gũi và ngược lại Hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt được thể dị hợp

tử Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ

ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi

thế của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự

- Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lượng

ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao

Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền

và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằng

thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Region)

- Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do

ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp

Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong việc phát hiện tính đa dạng của sinh vật Tại Việt Nam, nó đã được sử dụng để nghiên cứu đa hình di truyền của các loài như: ngũ gia bì [24], đậu xanh [19], [29], các

cây thuộc chi Gynostemma Blume [11], [15], các loài sâm bố chính [25]

- Những cải tiến của kỹ thuật RAPD

Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD được mô tả Kỹ thuật thứ nhất là

sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD thông thường Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số alen

so với khi sử dụng một primer Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn trước hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả Một là có thể làm giảm số lượng các alen khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn

1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG

HUYẾT IN VITRO THÔNG QUA MÔ HÌNH HOẠT HÓA AMPK

1.5.1 Vài nét về bệnh đái tháo đường

Theo quan điểm của Tổ chức y tế thế giới (WHO), đái tháo đường (ĐTĐ) là “một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose huyết do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc liên quan đến sự suy yếu trong hoạt động của insulin” [36]

Đái tháo đường là một rối loạn xảy ra trong cơ thể do cả yếu tố di truyền và yếu tố môi trường, đặc trưng bởi sự thay đổi chuyển hóa glucid, lipid và protein do sự thiếu hụt tương đối hoặc tuyệt đối insulin và do sự kháng insulin ở các mức độ khác nhau Ở những bệnh nhân bị ĐTĐ trong khoảng thời gian dài có thể gặp các biến chứng tiến triển dẫn đến sự thay đổi

và mất hoạt tính của nhiều cơ quan (đặc biệt ở bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin) như: ở mắt gây mất thị lực; thận gây suy thận; bệnh lý thần kinh ngoại vi; tim và mạch máu gây bệnh lý tim mạch sớm và nghiêm trọng, xơ vữa động mạch não, động mạch ngoại vi Đái tháo đường gồm nhiều bệnh lý lâm sàng với các nguyên nhân khác nhau nhưng đa phần đều có tăng đường huyết [35]

1.5.2 Vai trò của AMPK trong đái tháo đường

AMPK là một protein quan trọng trong điều hòa năng lượng của tế bào

và được coi như một yếu tố chính tham gia điều hòa chuyển hóa glucose và lipid ở nhiều cơ quan, đặc biệt là cơ vân và gan [35], [61]

Vai trò của AMPK trong cơ vân:

Cơ vân là nơi sử dụng glucose chính của cơ thể Có 2 con đường kích thích sự thu nhận glucose vào cơ vân là con đường phụ thuộc insulin và con

khuyết của cơ vân ở bệnh nhân ĐTĐ và chủ yếu do sự sai lệch trong quá trình truyền tín hiệu của insulin Tuy nhiên, hiện nay những biện pháp hữu hiệu để khắc phục những sai lệch này vẫn còn rất hạn chế Do đó, cải thiện quá trình

sử dụng glucose ở cơ vân theo con đường không phụ thuộc insulin được coi là biện pháp thay thế có hiệu quả

Các số liệu in vivo và ex vivo đã chứng minh rằng AMPK tác dụng lên

sự hấp thu glucose thông qua cả cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc insulin Nhiều nghiên cứu đã chứng minh giả thuyết cho rằng tập luyện có thể làm tăng sử dụng glucose trong cơ thông qua cơ chế không phụ thuộc insulin [34], [45] Sự co cơ làm tăng tỷ lệ AMP/ATP và Cr/pCr dẫn đến sự tăng mạnh mẽ hoạt tính của AMPK Như vậy, AMPK đóng vai trò quan trọng trong việc tăng sử dụng glucose khi co cơ AMPK còn thể hiện chức năng đồng hóa trong cơ vân thông qua hoạt hóa 2 enzym chính của chu trình acid citric là citrate synthase và succunat dehydrogenase [35]

Ngoài việc làm tăng vận chuyển glucose trong cơ, AMPK còn đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa chất béo ở cơ Hoạt hóa AMPK làm giảm tổng hợp acid béo tự do và làm tăng quá trình β-oxy hóa trong ty thể thông qua ức chế enzyme acetyl coenzyme A carboxylase (ACC) Do đó làm giảm nồng độ acid béo tự do và cải thiện sự kháng insulin [61]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu được sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm 8 mẫu Dây hoàng liên được thu thập ở các vùng sinh thái khác nhau trong khoảng thời gian từ tháng 12/2013 đến tháng 04/2016 Danh mục các mẫu nghiên cứu được tóm tắt trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục mẫu nghiên cứu T

4 AR4 HNIP/18120/15 Bến Cự - Vườn quốc gia Cát Tiên Đồng Nai

5 AR5 HNIP/18121/15 Vườn quốc gia Cát Tiên Đồng Nai

6 AR6 HNIP/18122/15 Bàu Sấu - Vườn quốc gia Cát Tiên Đồng Nai

7 AR7 HNIP/18147/15 Vườn quốc gia Cát Tiên Đồng Nai

8

AR8 HNIP/18148/15 Đèo Chuối – Bảo Lộc

Lâm Đồng Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền là lá tươi của 8 mẫu

Mẫu nghiên cứu thực vật được lấy cả thân, lá và cơ quan sinh sản (nếu có), tiêu bản cây khô được lưu tại phòng Tiêu bản – Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội

Mẫu nghiên cứu hoá học và tác dụng sinh học là phần thân, được thái phiến và xay nhỏ, sấy khô ở 55-60oC, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Nghiên cứu về đa dạng di truyền

Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Agarose, các mồi RAPD

Bảng 2.2 Các hóa chất dung môi sử dụng trong HPLC

3 Kali dihydrophosphat Merck, Đức Tinh khiết phân tích

4 Natri laurylsulfat Merck, Đức Tinh khiết phân tích

Bảng 2.3 Danh sách các mồi RAPD STT Tên mồi Trình tự STT Tên

mồi

Trình tự

19 OPO6 CCACGGGAA 44 S256 CTGCGCTGG A

- Nghiên cứu về thành phần hóa học

 Dung môi: cloroform, methanol, n-propanol, ethyl acetat, toluen, amoniac, nước cất, EtOH 90%, EtOH 25%, ether, n-buthanol

 Các hóa chất và thuốc thử: Bột Magie kim loại, dd HCl đặc, dd NH3 đặc,

dd NH3 6N, dd NaOH 10%, dd FeCl3 5%, dd NaOH đặc, dd acid sulfanilic, dd NaNO2 5%, dd NaNO2 10%, dd anhydrid acetic, dd H2SO4 đặc, dd H2SO4 1N, dd Pb(CH3COO)2 30%, dd Pb(CH3COO)2 10%,

Na2SO4 khan, dd H2SO4 đặc, dd acid Picric 1%, dd Natri nitroprussiat 0.5%, gelatin 1%, tinh thể Na2CO3, tẩy Javen, acid acetic, acid formic, xanh methylene, đỏ son phèn, dd TT Fehling A và TT Fehling B, dd Ninhydrin 3%, dd TT Mayer, dd TT Bouchardat, dd TT Dragendorff

 Chất chuẩn định tính: berberin clorid và palmatin clorid chuẩn: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương, tiêu chuẩn phòng thí nghiệm

 Chất chuẩn định lượng: berberin clorid C20H18NO4Cl hàm lượng 90.62%, hàm ẩm 10.56% Số kiểm soát QT 122030910 của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

- Nghiên cứu về tác dụng sinh học

Môi trường DMEM, DMSO, huyết thanh ngựa, huyết thanh bò (FBS) của hãng Invitrogen - Đức, penicillin 100UI/mL; streptomycin 0,1mg/mL,

CO2, phospho-AMPK, AMPK, phospho-ACC, ACC, HRP-gắn kháng thể IgG thỏ và HRP-gắn kháng thể IgG chuột, các kháng thể kháng AMPKα-Thr172,

kháng thể kháng β-actin của hãng Santa Cruz Biotechnology – Mỹ, màng nitrocellulose, các hóa chất khác: KH2PO4, NaOH, NaHCO3, KCl, NaCl, Tris-Cl,

2.1.3 Máy móc, thiết bị

- Nghiên cứu về thực vật

 Kính lúp soi nổi Nikon Eclipse Ci

 Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T

- Nghiên cứu về đa dạng di truyền

 Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức)

 Máy li tâm (Eppendorf 5415R); máy điện di (Consort EV222), bộ soi chụp gel (UVP Doc-It) (UV 254); máy PCR (Eppendorf), máy quang phổ Jenway - Model 6715 (UV 260/280nm)

 Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức)

- Nghiên cứu về thành phần hóa học

 Máy HPTLC Camag bao gồm: thiết bị chấm mẫu Linomat 5, thiết bị khai triển ADC 2, máy soi UV-visualizer, máy TLC scanner 4

 Máy HPLC: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 (Mỹ) với detector DAD, phần mềm điều khiển Chemstation

 Cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ), độ chính xác 0,01 mg

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Máy đo hàm ẩm Precisa HA60

 Cân phân tích Shimadzu

- Nghiên cứu về tác dụng sinh học

 Chai nuôi cấy, đĩa petri, đĩa 6 giếng,

 Pipet các cỡ, pipet điện

 Tủ cấy tế bào

 Tủ ấm CO2

- Tế bào d ng trong nghiên cứu Tế bào cơ vân nguyên phát của chuột nhắt

C2C12 được cung cấp bởi American Type Culture Collection (clone

CRL-1772)

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng từ

18-22g, khỏe mạnh, giống cái, do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

2.2.1.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái

Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích [1] Trong nghiên cứu, các đặc điểm được mô tả thuộc các nhóm: Dạng sống, Thân, Lá, Hoa, Quả, Hạt Dụng cụ sử dụng trong phân tích bao gồm: kính hiển vi, kính lúp soi nổi, máy ảnh kỹ thuật số chụp trực tiếp hoặc máy ảnh chụp qua kính lúp soi nổi

Bảng 2.4 Đặc điểm hình thái mô tả mẫu nghiên cứu

1 Dạng sống Dạng sống, chiều cao

2 Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non, màu sắc nhựa mủ

3 Lá Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng

mép, số cặp gân chính, kích thước chiều dài và chiều

4 Hoa Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, chiều dài cụm hoa, lá

bắc, đài (hình dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, bề mặt),

bộ nhị (số lượng, cách sắp xếp, hình dạng, kiểu mở và cách đính bao phấn), bộ nhụy (số lượng lá noãn, hình dáng, kích thước bầu, vòi, núm nhụy, cách đính noãn)

5 Quả Loại quả, hình dạng quả, kích thước chiều dài x chiều

2.2.1.2 Nghiên cứu về đặc điểm vi học

- Vi phẫu mẫu nghiên cứu được cắt, tẩy, nhuộm theo phương pháp nhuộm kép [5], [6], [27] ở các bộ phận lá (phiến lá) và thân cây Quan sát vi phẫu dưới kính hiển vi và xác định các đặc điểm vi phẫu mẫu nghiên cứu

- Bột dược liệu: Bột lá và thân đã tán nhỏ, làm tiêu bản dưới kính hiển vi và xác định các đặc điểm bột mẫu nghiên cứu [5]

2.2.2 Nghiên cứu về đa dạng di truyền

2.2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB của P Doyle and Doyle (1987) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết AND [41]

Quy trình:

Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C

(1) Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu, chày, cối được giữ trước ở - 80C)

(2) Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10% Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%

(3) Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút

(4) Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa Ly tâm

10500 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới

(5) Tiếp tục chiết lần 2 bằng Chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN (6) Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh Để ở -20C trong 1 giờ

(7) Ly tâm thu tủa 10500 vòng/phút trong 15 phút ở 4C

(8) Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE

(9) Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 37C trong 1 giờ

Các bước tiếp theo tương tự các bước 5-9

2.2.2.2 Khuếch đại ADN bằng PCR sử dụng chỉ thị RAPD

Các mẫu ADN tổng số được pha loãng với dung dịch đệm TE về nồng

độ 50 ng/µl để thực hiện phản ứng PCR Đã khảo sát các mồi khác nhau và cuối cùng lựa chọn sử dụng 26 mồi trong các phản ứng PCR có độ dài từ 9-10 nucleotit thuộc nhóm OPA, OPC, OPF, OPO, OPN, BIO và nhóm S của hãng Bioneer Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở bảng 2.5

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR-RAPD

Bảng 2.6 Chu trình chạy PCR-RAPD

Các bước Nhiệt độ(C) Thời gian

2.2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45-50C bổ sung 2,5l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm

Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4l loading dye và tra vào các giếng trên gel

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn, đặt 130V

Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr

2.2.2.4 Phương pháp phân tích số liệu

Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên nền Excel version 5.0

Các alen ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo thang ADN chuẩn (ADN marker), xuất hiện alen là “1”, không xuất hiện alen là “0’’ Xác định hệ số tương đồng di truyền

và thiết lập sơ đồ hình cây để so sánh mức tương đồng di truyền giữa 8 mẫu loài Dây hoàng liên dựa theo phương pháp UPGMA trong NTSYSpc 2.02 (Rohlf, 2000) [60]

Hệ số tương đồng di truyền được tính theo công thức của Nei M và Li W.H (1979) (hệ số Nei S):

S =

B

A N N

2

AB

N

Trong đó: S là hệ số tươngđồng di truyền

NAB là số băng AND có ở cả mẫu A và B

NA, NB lần lượt là số băng AND có ở mẫu A , mẫu B

2.2.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.3.1 Định tính các nhóm chất hóa học trong mẫu nghiên cứu

Định tính trong ống nghiệm các thành phần hóa học chính trong mẫu nghiên cứu dựa vào các phản ứng hóa học đặc trưng [13], [21], [22], [32]

2.2.3.2 Định tính thành phần berberin, palmatin trong dịch chiết alcaloid của mẫu nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng

a Chiết xuất alcaloid

Cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100: 1) Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100: 1), chiết lặp lại 2 lần Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn Hòa tan trong nước nóng 5 lần, mỗi lần 15ml, lọc lấy dịch chiết Cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn trong methanol, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm [16], [27]

b Khảo sát hệ dung môi sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị bản mỏng: Dùng bản mỏng Aluminum silica gel GF254, hoạt hóa bản mỏng ở 110oC trong 1 giờ, sau đó lấy ra bảo quản trong bình hút ẩm

để triển khai sắc ký

Chuẩn bị pha động: Khảo sát các hệ pha động sau để chọn ra hệ có khả năng tách tốt nhất để tiến hành định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng

- Hệ 1: n-butanol: acid acetic: H2O (7,0: 1,0: 2,0) [7], [27]

- Hệ 2: Chloroform: methanol (9,0: 1,0) [41]

- Hệ 3: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,0:7,0:1,0:2,0) [16]

- Hệ 4: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5: 5,5: 1,0: 2,0) [27]

- Hệ 5: n-propanol: nước: acid forrmic (90,0: 8,0: 0,4) [27]

Chuẩn bị dung dịch thử: dịch chiết alcaloid toàn phần các mẫu nghiên cứu

c Định tính các dịch chiết alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng

- Chất hấp phụ: bản mỏng Aluminum silicagel GF254, kích thước 10 x 20cm, hoạt hóa bản mỏng ở 110oC trong 1 giờ, sau đó lấy ra để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

- Hệ dung môi khai triển: lựa chọn hệ tách tốt nhất trong số các hệ đã khảo sát ở phần trên

- Tiến hành sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trên hệ thống máy HPTLC Camag

+ Phun mẫu bằng máy Linomat 5, thể tích phun mẫu là 3μl

+ Triển khai sắc ký trên máy ADC 2 trong điều kiện: Thời gian bão hòa

độ ẩm là 10 phút, thể tích dung dịch bão hòa là 800 ml MgCl2 Thể tích dung môi dùng để bão hòa là 25 ml, thời gian bão hòa dung môi là 20 phút Thể tích dung môi dùng để triển khai sắc ký là 10 ml Chiều dài quãng đường chạy của dung môi là 80 mm Thời gian làm khô dung môi sau khi triển khai là 5 phút

+ Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sau khi khai triển bằng máy Visualizer ở bước sóng 254 nm và 366 nm

TLC Xử lý kết quả thông qua sử dụng phần mềm WinCat

+ Xác định giá trị Rf bằng phần mềm WinCat

d Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học

+ Các giá trị Rf của các vết thu được trên sắc ký đồ được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu, xuất hiện vết là

“1”, không xuất hiện vết là “0’’ Xây dựng cây phân loại để so sánh mức tương đồng dựa trên thành phần alcaloid giữa 8 mẫu loài Dây hoàng liên bằng phép phân tích chùm Cluster trên phần mềm PC-ORD phiên bản 4.10

2.2.3.4 Định lượng berberin bằng HPLC

a Chuẩn bị dung dịch

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 22 mg berberin clorid (tương ứng với 20 mg berberin) hòa tan và pha loãng trong vừa đủ 100 ml hỗn hợp methanol – nước (1:1) Nồng độ berberin khoảng 0,2 mg/ml

- Các dung dịch xây dựng đường chuẩn: Từ dung dịch chuẩn ban đầu pha loãng chính xác thành các dung dịch chuẩn có nồng độ berberin chính xác khoảng 4 – 8 – 20 – 40 – 60 – 80 -100 g/ml bằng hỗn hợp KH2PO4 0,1M – acetonitril (6:4) Lọc qua màng lọc 0,45 m

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,10 g bột dược liệu (qua rây

có đường kính mắt rây 0,25 mm) vào bình định mức 25 ml Thêm 20 ml hỗn hợp KH2PO4 0,1M – acetonitril (6:4) Lắc nhẹ trong 1 phút Siêu âm 30 phút Pha loãng tới vừa đủ thể tích với cùng dung môi Lắc đều Ly tâm Lọc qua màng lọc 0,45 m [86]

Chú ý: Đối với mẫu thử có hàm lượng berberin thấp, thì lặp lại quá trình chuẩn bị dung dịch thử với lượng mẫu phù hợp sao cho nồng độ berberin trong dung dịch phân tích sắc ký nằm trong khoảng tuyến tính (5-

c Đánh giá kết quả

- Định tính

Định tính berberin trong mẫu thử dựa vào so sánh thời gian lưu của pic xuất hiện trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử với thời gian lưu tương ứng của pic này trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn

m

C t

Tính thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời

gian lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Yêu cấu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích ≤ 2,0%

Độ đặc hiệu: Tiêm lần lượt mẫu trắng (dung môi), mẫu thử, mẫu chuẩn

vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

Độ tuyến tính: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối

tương quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được y và nồng độ chất phân tích x) Xây dựng đường chuẩn 7 điểm x1 đến x7 của dung dịch chuẩn berberin ở trong khoảng nồng độ phù hợp Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của chất phân tích Yêu cầu: hệ số tương quan r ≥ 0,995

Độ chính xác (Độ lặp lại): Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết

quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định

Tiến hành: Thực hiện trên cùng 1 mẫu thử 6 lần phân tích lặp lại (chuẩn

bị 6 mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử và phân tích sắc ký, ghi lại sắc

ký đồ) Tính hàm lượng berberin trong mẫu thử Xác định độ lệch tương đối RSD% của kết quả phân tích

Yêu cầu: RSD đối với mỗi hoạt chất không lớn hơn 2,0%

Độ đúng: Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm thu

được với giá trị thực của kết quả

Tiến hành: Cân chính xác lượng mẫu thử thích hợp vào bình định mức, thêm lượng chuẩn thích hợp sao cho tổng hàm lượng berberin trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính, thêm dung môi, chiết mẫu Tiến hành 6 lần ở 1 mức nồng độ Xác định hàm lượng berberin Độ đúng xác định bằng hệ số thu hồi lượng chuẩn tìm được so với lượng chuẩn thêm vào Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong khoảng 98 – 102%

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu về tác dụng sinh học

2.2.4.1 Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng

a Chuẩn bị mẫu thử độc tính

Cân khoảng 1,0 kg bột dược liệu, đem nấu cao với khoảng 1,5 lít nước trong khoảng 6 tiếng, dịch chiết thu được đem cô cách thủy về thể tích 200 ml (cao lỏng 5:1)

Động vật: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, khỏe mạnh, giống cái, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

b Phương pháp nghiên cứu

Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp của Litchfield-Wilcoxon [12]

Chuột được nhịn đói 12h trước khi uống mẫu thử, nước uống bình thường Chuột được chia thành từng lô (mỗi lô 10 con), cho chuột uống mẫu thử Thể tích mẫu thử mỗi lần cho chuột nhắt uống là 0,2 ml/10g chuột, liều dùng là 100g dược liệu/kg thể trọng chuột/ngày

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động, ăn uống, bài tiết,

- Tỉ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ

- Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

2.2.4.2 Thử tác dụng hạ đường huyết in vitro trên mô hình hoạt hóa AMPK

a Chuẩn bị mẫu thử: Bột thân mẫu nghiên cứu được chiết với ethanol ở 2

nồng độ 450 và 700 theo phương pháp ngâm lạnh, mỗi 24h rút dịch chiết một lần và bổ sung dung môi mới, tiến hành rút dịch chiết 3 lần, gộp dịch chiết và

cô cách thủy tới cắn

b Phương pháp tiến hành: Đánh giá khả năng hoạt hóa AMPK của mẫu thử

thông qua đánh giá mức độ biểu hiện của AMPK đã phosphoryl hóa ở phân tử threonin 172 (viết tắt là p-AMPK) bằng kỹ thuật Western blot [24], [47], [67],

[72], [77] Các bước tiến hành cơ bản như sau:

- Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào C2C12 trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin 100UI/mL; streptomycin 0,1mg/mL ở 37o

C, 5% CO2

- Cấy chuyển vào đĩa 6 giếng Biệt hóa tế bào bằng huyết thanh ngựa 5%

trong 72h

- Chia các giếng tế bào thành các lô, mỗi lô 3 giếng, ủ với mẫu thử (hòa tan

trong DMSO) với nồng độ 100,00 µg/mL trong 1giờ Tiến hành song song với các giếng chứng (chỉ bổ sung DMSO) Xác định mức độ biểu hiện của p-AMPK và β-actin (protein đối chứng) bằng kỹ thuật Western blot

Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft

Excel 2007 Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p<0,05 Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (M ± SD)