Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng in vitro của hành tây ( allium cepa l )

Định tính các nhóm hợp chất trong hành tây bằng phản ứng hóa học .... Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong hành tây bằng phản ứng hóa học 45 6 Bảng 3.5.. Sơ đồ định tính các nhóm h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thu Hằng

HÀ NỘI- 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, phòng sau đại học đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

PGS.TS Nguyễn Thu Hằng (Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà

Nội), người thầy đã tận tình chỉ bảo, dồn hết tâm huyết truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm khoa học vô cùng quý báu Cô còn là người nhiệt tình dìu dắt, động viên, giúp đỡ, khích lệ tôi trong suốt quãng thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ tại bộ môn

Tôi cũng xin cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Tuấn, DS Nguyễn Ngọc Cầu,

NCS Nguyễn Thanh Tùng, những người đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ, động

viên tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn, các anh chị em chuyên ngành Dược học cổ truyền, các em sinh viên khóa 65, 66, 67 làm đề tài tại bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới gia đình, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và đạt kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 29 tháng 3 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Hiền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Về thực vật 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Allium L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Allium L 2

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Allium cepa L 3

1.2. Thành phần hóa học của loài Allium cepa L 5

1.2.1 Flavonoid 5

1.2.2 Tinh dầu 8

1.2.3 Các thành phần khác 9

1.3. Tác dụng sinh học của loài Allium cepa L 9

1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết 9

1.3.2 Tác dụng hạ lipid máu 10

1.3.3 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu 10

1.3.4 Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase (XO) và xanthin dehydrogenase (XDH) 11

1.3.5 Tác dụng chống oxy hóa và dọn gốc tự do 12

1.3.6 Tác dụng trên men gan 13

1.3.7 Tác dụng chống viêm 13

1.3.8 Tác dụng chống dị ứng 13

1.3.9 Tác dụng trên sự sản sinh của nguyên bào sợi của người và

nguyên bào sợi sẹo lồi 14

1.3.10 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 14

1.3.11 Tác dụng khác 15

1.4 Công dụng 16

1.5 Độc tính 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 19

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 19

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính enzym xanthin oxidase và đối với sự ngưng tập tiểu cầu in vitro 29

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 32

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 32

3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu 32

3.1.2 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu 35

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 42

3.2.1 Nghiên cứu tinh dầu 42

3.2.2 Định tính các nhóm hợp chất trong hành tây bằng phản ứng hóa học 43

3.2.3 Định tính các phân đoạn dịch chiết hành tây bằng sắc ký lớp mỏng 45

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính

enzym xanthin oxidase và đối với sự ngưng tập tiểu cầu in vitro 51

3.3.1 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro 51 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với sự ngưng tập tiểu cầu in vitro 54

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADP Adenosin diphosphat Adenosin diphosphat

ASAT Aspartat amino transferase Aspartat amino transferase ALAT Alanin amino transferase Alanin amino transferase AST Ánh sáng thường

DMSO Dimethyl sulfoxid Dimethyl sulfoxid

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EC50 Effective concentration 50%

Nồng độ tác dụng 50% (nồng độ tác dụng trung bình)

Gamma-L-glutamyl-trans-S-1-IC50 Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50% (nồng độ ức chế trung bình)

LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50%

(liều gây chết trung bình) NTTC Ngưng tập tiểu cầu

OECD Organization for Economic

Co-operation and Development

Tổ chức hợp tác và phát triển

kinh tế

PBS Phosphat buffered salin Đệm phosphat salin

PPP Platelet poor plasma Huyết tương nghèo tiểu cầu PRP Platelet rich plasma Huyết tương giàu tiểu cầu

UV Ultra violet spectroscopy

XO Xanthin oxidase Xanthin oxidase

XDH Xanthin dehydrogenase Xanthin dehydrogenase

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid trong hành tây (Allium cepa L.) 5

2 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu với đặc điểm mô tả trong các thực vật chí 26

3 Bảng 3.2 So sánh đặc điểm mẫu nghiên cứu với đặc điểm các thứ của loài Allium cepa L 30

4 Bảng 3.3 Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu thân hành hành tây bằng phương pháp GC/MS 35

5 Bảng 3.4 Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong hành tây bằng phản ứng hóa học 45

6

Bảng 3.5 Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết n- hexan

bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan-Aceton-Acid acetic

(2:1:0,1)

48

7

Bảng 3.6 Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết cloroform

bằng SKLM với hệ dung môi Toluen-

Cloroform-Methanol-Acid formic (2:5:1:0,5)

50

8

Bảng 3.7 Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết ethyl acetat

bằng SKLM với hệ dung môi Toluen- Ethyl acetat-

Methanol-Acid formic (7:4:1:1)

52

9 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro 54

10 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lớp vỏ ngoài thân hành hành tây đối với sự ngưng tập tiểu cầu

Hình 3.3 Ảnh chụp các đặc điểm bột lớp trong thân hành

hành tây dưới kính hiển vi 32

5

Hình 3.4 Ảnh chụp các đặc điểm bột lớp vỏ ngoài thân hành

hành tây dưới kính hiển vi 32

6

Hình 3.5 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất trong dịch chiết

cồn, dịch chiết nước và dịch chiết ether dầu hỏa của hành tây 37

7

Hình 3.6 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất khác trong hành

8

Hình 3.7 Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết n-hexan

với hệ dung môi n-hexan-Aceton-Acid acetic (2:1:0,1) 47

9

Hình 3.8 Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết

cloroform với hệ dung môi Toluen-

Cloroform-Methanol-Acid formic (2:5:1:0,5)

49

10

Hình 3.9 Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết ethyl

acetat với hệ dung môi Toluen- Ethyl acetat -Methanol-Acid

formic (7:4:1:1)

51

Ở Việt Nam, mặc dù hành tây được trồng rộng rãi song chưa được nghiên cứu về mặt dược liệu Để nâng cao giá trị làm thuốc của hành tây, đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng

in vitro của hành tây Allium cepa L.” được thực hiện với ba mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hành tây

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của hành tây

3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính

enzym xanthin oxidase và đối với sự ngưng tập tiểu cầu in vitro

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Về thực vật

1.1.1 Vị trí phân loại chi Allium L

Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [6], [46], [70], [81], chi Allium

L có vị trí phân loại như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Allium L

Cây thảo nhiều năm, có mùi đặc biệt; thân hành, hình cầu, hình cầu dẹp,

hình trụ, có áo mỏng bao ở ngoài hoặc một số ít có thân rễ [4], [20] Lá không

cuống, có màng mỏng bao bọc ở gốc [20], tập trung ở gốc [4], hình dải, phẳng,

dẹp hoặc hình trụ rỗng [4], [20] Cụm hoa tán, hình đầu [4], [20], trên một cuống

hoa chung, thẳng đứng, đặc hoặc rỗng [4] Lá bắc tổng bao dạng mo, mỏng [4],

[20], một - nhiều, tồn tại trước khi nở [20] (sớm rụng [4]) hoặc tồn tại [4] Trên

cụm hoa toàn bộ là hoa hoặc có cả các thân hành nhỏ lẫn hoa [4] Hoa nhỏ, màu

trắng, hồng, lục nhạt, tím nhạt, tím lam; đều [4], lưỡng tính [4], [20] (hiếm khi

đơn tính- khi cây đơn tính khác gốc [20]), cuống hoa trên tán dài ngắn khác

nhau [4] Bao hoa 6 mảnh, rời nhau hoặc dính nhau ít [4] (tạo thành một ống ở

gốc [20]), xếp 2 vòng [4] Nhị 6, xếp 2 vòng ở xung quanh bầu hoặc trên bao

hoa, chỉ nhị rời nhau hoặc dính nhau ở gốc, gốc chỉ nhị rộng ra ở 2 bên, có răng

hoặc không, bao phấn đính lưng, 2 ô, mở bằng khe dọc [4] Bầu thượng, đính

noãn trung trụ [4], 3 ô, mỗi ô nhiều noãn [4], [20]; vòi nhụy dài, mảnh; đầu nhụy

3

dạng đầu hoặc 3 thùy [4] Quả nang, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh [4] Hạt nhiều, màu đen, hình cầu hoặc hình thoi [20], có cạnh, dẹp hoặc có cánh, nội nhũ nạc [4]

Trên thế giới chi Allium L có khoảng 450 loài [4] (theo Thực vật chí

Trung Quốc [20] thì chi có 660 loài); phân bố ở Bắc bán cầu, chủ yếu ở châu Á

[4], [20], một số loài ở châu Phi, Trung và Nam Mỹ [20] Trung Quốc có 138

loài, được trồng từ rất lâu đời, hầu hết có thể ăn được [20] Việt Nam chi Allium

L có 8 loài, một số loài được nhập và trồng làm rau ăn và gia vị [4]

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Allium cepa L

Cây thảo nhiều năm, hơi có mùi thơm; thân hành (thường gọi là “củ hành tây”), thân hành đơn độc hoặc thành chùm [20], gần như hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹp [4], [20], đường kính 4-5 cm, có áo mỏng màu nâu đỏ, màu vàng nhạt bao ngoài [4] (vỏ áo ngoài mỏng màu đỏ tía, nâu đỏ, nâu đỏ nhạt, vàng nhạt [20]) Lá hình trụ, rỗng [4], hình ống, lá ngắn hơn cán hoa, lá rộng 0,5-2cm [20], dài 40-60 cm, phình to từ giữa trở xuống, nhọn dần về phía chóp lá [4] Cụm hoa tán, hình cầu [20] (hình đầu [4]), trên một cuống hoa chung [4], cán hoa phát triển hoặc không, nếu phát triển dài tới 1m, phồng lên từ giữa trở xuống, hình ống, được bao kín bởi lá ở gốc [20], thẳng đứng, rỗng [4] Lá bắc tổng bao dạng

mo, mỏng, xẻ 2-3 mảnh, ngắn hơn cụm hoa, tồn tại [4], [20] Trên cụm hoa toàn

bộ là hoa [4], [20], xếp xít nhau, có 30-40 hoa [4]; hoặc có thân hành nhỏ kèm một ít hoa [20] Hoa nhỏ, màu trắng phấn hoặc màu trắng [20], màu trắng hoặc tim tím [4], đều [4], [20], lưỡng tính, cuống hoa dài tới 2,5 cm [4], cuống nhỏ [20] Bao hoa 6 mảnh [4], hình mũi giáo hoặc hình trứng mác, dài 4-5 mm, rộng

2 mm [4], [20], có gân giữa màu xanh lá [4], [20], hoặc gân màu hơi đỏ [20], rời nhau hoặc dính nhau ít, xếp 2 vòng [4] Nhị 6, xếp 2 vòng [4], chỉ nhị dài hơn bao hoa [4], [20], chỉ nhị nhỏ, mảnh, đều [20], dính nhau ở gốc bằng 1/5 chiều

4

dài bao hoa và dính với bao hoa, gốc chỉ nhị vòng trong phình ra rất to, mỗi bên

có một răng, chỉ nhị vòng ngoài hình dùi [4], [20]; bao phấn đính lưng, 2 ô, mở bằng khe dọc [4] Bầu thượng, hình cầu, 3 cạnh, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn, vòi nhụy dài 4 mm [4], mảnh [20]; đầu nhụy 3 thùy ngắn [4] Quả nang, gần như hình cầu, vách ngăn dạng màng mỏng, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh [4] Hạt nhiều, dẹp, có cạnh; nội nhũ nạc [4]; 2n= 32 [20] Mùa hoa và quả tháng 5-6 [20]

Phân bố: Hành tây có nguồn gốc từ vùng Trung Á [11], [12], được trồng như rau ở Trung Quốc và nhiều nước trên thế giới [4], [20] Ở Việt Nam, cây được trồng ở một số địa phương, đặc biệt là miền Trung [4]

Cây được trồng trên ruộng đất màu, khô, bãi bồi ven sông, trong vườn Nhân giống chủ yếu bằng hạt [4]

 Các thứ của loài Allium cepa L gồm:

- Allium cepa var aggregatum G.Don [81], thân hành chùm, cán hoa không

phát triển (cây nhân giống bằng thân hành) [20]

- Allium cepa var cepa L.: nhóm hành tây phổ biến nhất [81], cụm hoa tán

gồm toàn bộ là hoa (trên cụm hoa không có thân hành nhỏ), bao hoa trắng phấn, gân màu xanh lá ở dọc cánh hoa [20]

- Allium cepa var proliferum (Moench) Regel [81], cụm hoa có thân hành

nhỏ, bao hoa trắng, gân hơi đỏ [20]

- Allium cepa var bulbiferum Regel [81]

- Allium cepa var multiplicans L.H.Bailey [81]

- Allium cepa var solaninum Alef [81]

- Allium cepa var viviparum (Metz) Mansf [81]

5

1.2 Thành phần hóa học của loài Allium cepa L

Theo các tài liệu thu thập được, các nhóm hợp chất được phát hiện trong

hành tây (Allium cepa L.) gồm flavonoid, tinh dầu và một số nhóm hợp chất

khác

1.2.1 Flavonoid

Các hợp chất flavonoid trong hành tây được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid trong hành tây (Allium cepa L.)

(3)

Quercetin-3-O-β-glucosid (Isoquercetin)

Thân hành [10], [71], [80]

 Bằng GC/MS đã xác định được các hợp chất sulfid trong hành tây: methyl propyl sulfid, diallyl sulfid, dipropyl sulfid, allyl methyl sulfid, allyl propyl sulfid, allyl propyl disulfid, allyl methyl disulfid, diallyl trisulfid, dimethyl trisulfid, allyl propyl trisulfid, allyl methyl trisulfid [43]

 Các hợp chất có sulfur là thành phần chính trong tinh dầu của hành: Các acid alk(en)ylsulfinothiotic và các ester của chúng; các thiosulfinat và ceparen

có vai trò quan trọng đối với tác dụng chữa ho của hành [10]

 Cystein sulfoxid toàn phần trong hành tây chiếm 0,25%, trong đó thành phần chính là isoalliin [43]

9

 Các alk(en)yl cystein sulfoxid: (+)-S-methyl-L-cystein sulfoxid (Methiin), (+)-S-propyl-L-cystein sulfoxid (propiin) và (+)-S-trans-1-propenyl-L-cystein sulfoxid (isoalliin) [29], [58]

 Các acid hữu cơ: acid ferulic [25], [79], acid myritic [79], acid gallic, acid protocatechuic [25]

 Các acid béo và dẫn chất: acid lauric, acid arachidonic, acid linolenic, acid linoleic, ethyl linoleat, acid oleic, methyl oleat, ethyl oleat, acid palmitic, acid palmitoleic, acid stearic, methyl hexadecanoat, ethyl hexadecanoat [15], [30]

 Các hợp chất steroid và triterpen [10]: sterol (β-sitosterol) [1], [79]

 Ngoài ra hành tây còn giàu đường; vitamin A, B, C; muối khoáng Na, K, P,

1.3.3 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu

 Dịch chiết nước ức chế sự ngưng tập tiểu cầu gây bởi adenosin diphosphat,

collagen, epinephrin và acid arachidonic in vitro Dịch chiết ethanol, butanol, cloroform của hành tây ức chế sự ngưng tập tiểu cầu của người in vitro do làm

giảm sự tổng hợp thromboxan (do các chất ajoen- ức chế lipoxygenase, methyl allyl trisulfid, dimethyl và diphenylthiosulfinat từ hành tây ức chế sự tổng hợp thromboxan) [10] Hợp chất thiosulfinat trong hành tây có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu [59]

 Hành tây sống có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro, tuy nhiên

hành đã đun sôi thì tác dụng giảm Các hợp chất có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu trong hành tây gồm: thiosulfinat, dialkyl polysulfid, prostaglandin A1, sulphonyldisulfid Dịch chiết hành tây ức chế cyclooxygenase, lipooxygenase (sản phẩm chuyển hóa acid arachidonic) Tinh dầu hành tây, dimethyl và diallyl trisulfid, sulphonyldisulfid ức chế tổng hợp thromboxan (13-18%) [65]

11

 Dịch chiết methanol toàn phần lớp vỏ màu nâu của hành tây (0,5-1,0 mg/ml)

có tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu cầu người in vitro lần lượt là 40,0-49,3%

với tác nhân gây ngưng tập tiểu cầu là collagen; 30,0-33,3% với tác nhân gây ngưng tập tiểu cầu ADP Quercetin ức chế nucleotid phosphodiesterase vòng và cyclooxygenase (đối kháng receptor thromboxan) [60]

 Hợp chất sulfur của hành tây có tác dụng như tác nhân chống đông máu tự nhiên [46]

1.3.4 Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase (XO) và xanthin dehydrogenase (XDH)

Enzym xanthin oxidase (XO) và xanthin dehydrogenase (XDH) xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric trong cơ thể, ức chế XO sẽ làm hạ acid uric máu Flavonoid trong hành (Quercetin [31])

có tác dụng ức chế XO in vitro và in vivo

Theo Shivraj Hariram Nile và Se Won Park, tác dụng ức chế xanthin oxidase

in vitro của lớp vỏ ngoài thân hành hành tây đỏ có IC50=14,2 µg/ml; hành vàng

có IC50=15,5 µg/ml; hành trắng là IC50=17,0 µg/ml; so sánh với chất đối chứng Allopurinol với IC50= 10,5 µg/ml [77]

Cả hành tây và Allopurinol ức chế enzym XO và XDH ở động vật có tăng acid uric máu mạnh hơn so với ở động vật bình thường (Fatemeh Haidari và

cộng sự (2008) đã nghiên cứu tác dụng ức chế XO và XDH của hành tây in vivo) [31], [32]

Theo Fatemeh Haidari và cộng sự (2008) nghiên cứu tác dụng ức chế XO và

XDH của hành tây in vivo (với p<0,05) [32], đối với động vật bình thường, hành

tây với liều 7g/kg có I% lần lượt là 11%; 6%, so với thuốc đối chứng Allopurinol (5mg/kg) có I% lần lượt là 12%; 10% Trong khi đó đối với động vật tăng acid uric máu, chất ức chế Kali oxonat kết hợp Allopurinol (5mg/kg) có I% lần lượt là 42%, 41%, khi sử dụng chất ức chế Kali oxonat kết hợp hành tây

12

(3,5g/kg) I% lần lượt là 31%; 25% và khi sử dụng chất ức chế Kali oxonat kết hợp hành tây (7g/kg) I% lần lượt là 36%; 33%

Theo Fatemeh Haidari và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế XO và XDH

của hành tây in vivo (với p<0,01) [31], đối với động vật bình thường, hành tây

(5g/kg) có I% lần lượt là 27,2%, 32,4%; khi sử dụng quercetin (5mg/kg) I% lần lượt là 7,2%; 17,1%; so với khi sử dụng thuốc đối chứng Allopurinol (5mg/kg) I% lần lượt là 53,2%; 61,3% Đối với động vật tăng acid uric máu, hành tây (5g/kg) I% lần lượt là 39,75%; 49,7%; khi sử dụng quercetin (5mg/kg) I% lần lượt là 34,5%; 41,9%; so với khi sử dụng thuốc đối chứng Allopurinol (5mg/kg) I% lần lượt là 57,8%; 66,75%

1.3.5 Tác dụng chống oxy hóa và dọn gốc tự do

 Tinh dầu hành tây ức chế DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) với IC50 là 20,19 mg/ml Tác dụng chống oxy hóa của tinh dầu hành tây là do các hợp chất sulfur (diallyl polysulfid) [26], [41]

 Các loại hành tây (đỏ, tím, trắng, xanh) có hàm lượng phenol toàn phần từ 4,6-74,1 mg/g tính theo acid gallic, tác dụng chống oxy hóa với I% là 13,6% -84,1%, tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl với IC50 là 0,1-15,2 mg/ml; EC50 là 4,3-660,8 mg/mg [25] Hợp chất phenolic toàn phần trong hành xanh 30mg/100g tươi, vàng 34,7/100g tươi; đỏ 44/100g tươi và tía 47,3mg/100g tươi Theo Benkeblia (2000), hàm lượng phenol toàn phần trong hành tây đỏ từ 18-20mg/100g khối lượng tươi [17], [56], [78]

 Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết nước của hành tây được đánh giá so sánh với chất đối chứng acid ascorbic với IC50 cho tác dụng dọn gốc tự do DPPH, hydroxyl, superoxid lần lượt là 195,2±0,2 µg/ml; 374,7±0,4 µg/ml; 182,5±1,7 µg/ml; trong khi đó với acid ascorbic kết quả IC50 lần lượt là 159,7 µg/ml; 244,3 µg/ml; 97,2 µg/ml [45]

13

1.3.6 Tác dụng trên men gan

 Dịch chiết nước của hành tây sau khi đun sôi làm tăng lượng aspartat amino transferase-ASAT (1077,3) so với chứng (395,03); trong khi đó dịch chiết nước hành tây để sống tăng ASAT không đáng kể (445,23) Với alanin amino transferase (ALAT), dịch chiết nước sau đun sôi là 242,2 so với chứng (109,67), dịch chiết nước để sống là 143,2 [36]

1.3.7 Tác dụng chống viêm

 Thành phần có hoạt tính chống viêm của hành tây là các flavonoid (quercetin

và kaempferol) Các flavonoid có tác dụng chống viêm là do ức chế tác dụng của protein kinase, phospholipase A2, cyclooxygenase và lipooxygenase đồng thời ức chế sự giải phóng những chất trung gian của phản ứng viêm từ bạch cầu [10]

 Hợp chất sulfur trong hành tây có tác dụng chống viêm bởi cơ chế ức chế tổng hợp thromboxan và ức chế hoạt động của tác nhân hoạt hóa tiểu cầu [59]

 Tác dụng chống viêm của hành tây là do thành phần vitamin C, quercetin và isothiocyanat trong hành tây [46]

 Cao nước hành tây 10% trong một thuốc thể keo đặc dùng tại chỗ có tác dụng

ức chế phù tai chuột nhắt trắng gây bởi acid arachidonic [10]

1.3.8 Tác dụng chống dị ứng

 Cho chuột lang uống dịch ép hoặc dịch chiết ether (100mg/kg) của hành tây

có tác dụng ức chế phản ứng dị ứng gây bởi yếu tố hoạt hóa dị ứng nguyên hoặc tiểu cầu, nhưng không ức chế phản ứng dị ứng gây bởi histamin hoặc acetylcholin Cao nước không có tác dụng Cao cloroform hành tây (20-25mg)

ức chế sự nghẽn phế quản gây bởi dị ứng nguyên hoặc yếu tố kết tập tiểu cầu ở chuột lang [10]

14

 Phản ứng da tức thì và muộn gây bởi tiêm kháng thể kháng IgE người của thỏ vào phía trước cẳng tay của 12 người tình nguyện khỏe mạnh, đã giảm khi bôi trước lên da cao cồn 50% hành tây [10]

 Sự nghẽn phế quản tức thì và muộn do hít dị ứng nguyên giảm đáng kể sau khi uống cao cồn 5% hành tây 1 giờ trước khi cho tác động dị ứng nguyên [10]

1.3.9 Tác dụng trên sự sản sinh của nguyên bào sợi của người và nguyên bào sợi sẹo lồi

 In vitro, cao nước hành tây 0,5% ức chế sự sản sinh của nguyên bào sợi của

người và nguyên bào sợi sẹo lồi được phân lập bằng men từ mô sẹo lồi Cao nước hành tây 1-3% ức chế sự tăng sinh các nguyên bào sợi nguồn gốc khác nhau như sẹo, sẹo lồi và mô phôi Sự ức chế mạnh nhất đối với nguyên bào sợi sẹo lồi là 65-73% so với ức chế nguyên bào sợi sẹo và mô phôi tối đa là 50% Ở nguyên bào sợi da người, cả cao nước, cao cloroform của hành tây và thiosulfinat ức chế hóa ứng động kích thích bởi yếu tố phát triển từ tiểu cầu và

ức chế sự tăng sinh của nguyên bào sợi của người và nguyên bào sợi sẹo lồi [10]

1.3.10 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

 Dịch chiết nước hoặc dịch ép củ hành tây có hoạt tính ức chế in vitro sự sinh trưởng của: Escherichia coli, Seraria marcescens, các chủng Streptococcus,

Lactobacillus odontolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhosa

[10], [69], [74], [75] Dịch chiết ether dầu hỏa của hành tây ức chế sự phát triển

in vitro của Clostridium parapurificum và Staphylococcus aureus [10] Dịch

chiết cồn có tác dụng trên Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus [59]

 Hợp chất Thiosulphinat (-S-(O)-S-) đóng vai trò rất quan trọng trong tác

dụng kháng khuẩn, đặc biệt vi khuẩn Staphylococcus aureus và Klebsiella

pneumoniae [49]; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhosa [46] Lượng lớn fructooligosaccharid trong hành tây tăng cường sự phát

15

triển của vi khuẩn có lợi và hạn chế vi khuẩn có hại trong bệnh ruột kết như

Bacillus subtilis, Salmonella typhosa, Escherichia coli [46]

 Tinh dầu hành tây ức chế nấm Aspergillus niger, Clodosporium werneckii,

Geotrichum candidum và Candida lipolytica [10], [76] Tinh dầu hành tây ức

chế vi khuẩn Staphylococcus aureus và Salmonella enteritidis rất tốt ở nồng độ

50ml/l; 100ml/l; 200ml/l; 300ml/l; 500ml/l với đường kính vòng vô khuẩn

>5mm; kháng nấm Aspergillus niger, Penicillium cyclopium, Fusarium

oxysporum ở liều 50 ml/l và 100 ml/l [16], [82] Saponin trong Hành tây có tác

dụng ức chế nấm Botrytis cinerea, Trichoderma atroviride [53]

1.3.11 Tác dụng khác

1.3.11.1 Tác dụng chống ung thư

 Hành tây có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u, giảm mức độ nguy hiểm của bệnh ung thư do tác dụng của thành phần diallyl sulfid và flavonol Hợp chất sulfid trong hành tây có tác dụng chống lại sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư dạ dày và ung thư ruột kết [46]

1.3.11.2 Tác dụng trên hệ xương

Hợp chất Gamma-L-glutamyl-trans-S-1-propylen-L-cystein sulfoxid (GPCS)

ức chế tế bào hủy xương và chống lại chứng loãng xương [46]

1.3.11.3 Tác dụng trên hệ tiết niệu

Hành tây có hiệu quả rất cao trong bệnh rối loạn hệ tiết niệu Tác dụng lợi tiểu: dịch ép hành tây phối hợp với 60g đường rất hiệu quả trong trường hợp bí tiểu [46]

Siro hành tây có tác dụng loại bỏ sỏi thận [46]

1.3.11.4 Tác dụng trừ giun sán

Dịch chiết nước ở liều 20mg/ml có tác dụng trừ giun sán rất mạnh [14]

16

1.4 Công dụng

 Hành tây là một loại rau được sử dụng phổ biến ở châu Âu trong bữa ăn hàng ngày Ở nước ta hành tây cũng được sử dụng như một thực phẩm, ngoài ra cũng được dùng để chữa ho, long đờm, làm ra mồ hôi, trị chứng bí tiểu, thủy thũng [5], [10], cúm, xơ vữa động mạch, đề phòng huyết khối, tiểu đường, viêm hạch,

kí sinh trùng đường ruột; dùng ngoài trị áp xe, mụn nhọt, trừ muỗi, vết thương, vết loét, mụn cóc [1], [11], [12]

 Ở Tunisie, hành tây sắc đặc chế thêm mật ong, uống mỗi buổi sáng một thìa được dùng làm thuốc bổ cho người mới ốm dậy Hành tây với hạt đậu mỏ

(Rhynchosia volubilis), sắc đặc, thêm mật ong chế thành siro, uống ngày 2 lần,

mỗi lần 1-2 thìa dùng phục hồi chức năng vận động cho bệnh nhân liệt nửa người [10]

 Rất nhiều bộ phận của cây hành tây được sử dụng làm thuốc theo quan niệm

cổ truyền: hạt hành tây có tác dụng làm tăng lượng tinh dịch, diệt sâu răng, bệnh đường tiết niệu; thân hành là nguồn năng lượng chứa vitamin A, vitamin B1 và vitamin C WHO khuyến cáo sử dụng chiết xuất hành tây tươi trong trường hợp

ho, cảm lạnh, hen suyễn, khàn tiếng [46]

1.5 Độc tính

Độc tính của liều cao hành tây không được ghi nhận nhưng có sự ảnh hưởng lên dạ dày và sử dụng hạt hành tây thường xuyên được thông báo như một tác nhân gây dị ứng tồn tại trong cơ thể [46]

Nghiên cứu độc tính cấp trên chuột thí nghiệm (18-22g, 90 ngày tuổi) theo hướng dẫn của OECD, động vật được chia làm 3 nhóm, được cho dùng liều 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg, 1000 mg/kg, 3000 mg/kg thể trọng theo đường uống các dịch chiết ether dầu hỏa, ether, cloroform và cloroform-nước Động vật được tiếp tục theo dõi sau 48 giờ và sau đó theo dõi hàng ngày trong 14 ngày sau khi dùng thuốc Kết quả cho thấy LD50 là 3000 mg/kg thể trọng theo đường uống ở tất cả các dịch chiết thử nghiệm [22]

 Mẫu cây có hoa được thu hái vào tháng 2 năm 2016

 Mẫu cây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng Tiêu bản- Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là HNIP/18150/16

 Xử lý mẫu: thân hành hành tây được phân làm 2 mẫu (lớp vỏ ngoài màu nâu

và lớp trong màu trắng), thái nhỏ, phơi khô, bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát

Hình 2.1 Ảnh chụp thân hành hành tây đã phơi sấy khô

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

2.1.2.1 Hóa chất: hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm:

- Các dung môi: Cồn 90o, n-hexan, methanol, cloroform, ether dầu hỏa, ethyl acetat, DMSO của hãng Sigma …

- Hóa chất vô cơ: NaOH, FeCl3, HCl, Mg,…

- Viên Aspirin ASS TAD 100mg của TAD Pharma GmbH (Số lô V17942)

- Dung dịch đệm pH= 7,4

18

- Enzym xanthin oxidase có Pcode 1001461189 của hãng Sigma

- Mẫu máu của người tình nguyện được đánh số THCH19

- Adenosin diphosphat (ADP)

- Bản mỏng Silica gel GF254 tráng sẵn (MERCK)

- Cân phân tích Sartorius TE 214S, độ chính xác 0,1mg

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 3102S, độ chính xác 0,01g

- Máy cất quay Buchi R-200 (Đức)

- Máy đo hàm ẩm Presica

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy ảnh Canon

- Đèn tử ngoại

- Máy siêu âm

- Máy ly tâm Universal

- Máy sắc ký khí AGILENT TECHNOLOGIES 7890A, detector khối phổ AGILENT TECHNOLOGIES 5975C tại Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay (Biotek) và máy ủ lắc khay (Awareness)

- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu tự động Chronolog (Mỹ) tại Khoa huyết học- Bệnh viện Bạch Mai

19

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học: Mẫu cây hành tây được

mô tả theo phương pháp mô tả phân tích, đối chiếu với khóa phân loại chi

Allium L., bản mô tả loài và các thứ của loài Allium cepa L trong Thực vật chí

Trung Quốc [20] và Thực vật chí Việt Nam [4] để xác định tên khoa học

 Soi bột: Sấy khô dược liệu (2 mẫu: lớp vỏ ngoài và lớp trong) trong tủ sấy ở

nhiệt độ 700C, sau đó dùng thuyền tán nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột

 Chụp ảnh bằng máy ảnh Canon

 Xử lý ảnh bằng phần mềm Adobe photoshop CS5

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Định lượng tinh dầu và xác định các thành phần của tinh dầu trong hành tây bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS)

 Định lượng tinh dầu

 Định lượng tinh dầu trong thân hành bằng phương pháp cất kéo hơi nước [3], [13]

 Chuẩn bị mẫu để cất tinh dầu

- Thân hành rửa sạch, bỏ lớp vỏ ngoài màu nâu, cắt bỏ rễ, cắt thành những đoạn nhỏ khoảng 0,5 cm

- Xác định độ ẩm mẫu dược liệu bằng máy đo độ ẩm Precisa

 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo qui định Dược điển Mỹ

 Thời gian cất: 4 giờ

 Hàm lượng tinh dầu được tính trên dược liệu khô tuyệt đối theo công thức: %X =

20

Trong đó : X: Hàm lượng % tinh dầu a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất b: Khối lượng dược liệu

h: Hàm ẩm của dược liệu

 Nghiên cứu thành phần tinh dầu hành tây bằng phương pháp sắc ký khí

kết hợp khối phổ (GC/MS)

Thí nghiệm được tiến hành trên máy sắc ký khí khối phổ AGILENT TECHNOLOGIES 7693 với các điều kiện như sau :

+ Cột sắc ký 1909 1 S – 433 HP – 5MS kích thước 30m × 250µm × 0,25 µm + Hệ thống tiêm mẫu tự động

+ Detector: Khối phổ AGILENT TECHNOLOGIES 5975C

+ Khí mang: Heli

- Chuẩn bị mẫu: Mẫu tinh dầu nghiên cứu được pha loãng ở nồng độ 0,1%

trong cloroform (MERCK) rồi cho vào lọ thủy tinh 2ml có nắp chuyên dụng, lắc đều, đậy nắp, đặt vào vị trí chứa mẫu trên khay của hệ thống tiêm mẫu tự động

- Khởi động thiết bị:

+ Mở bình khí Heli: mở van tổng và van bi

+ Bật công tắc điện khởi động GC, Bật máy tính, Khởi động MS

- Thiết lập phương pháp phân tích: Khởi động phần mềm INSTRUMENT I

và cài đặt các thông số:

+ Injector: Thể tích tiêm mẫu: 1µm

Trước khi tiêm mẫu: Rửa kim 3 lần với dung môi cloroform Rửa kim 3 lần với dung dịch mẫu

Sau khi tiêm mẫu: Rửa kim 3 lần với dung môi cloroform

+ Inlet: Khí mang Heli, Mode: Spilt (tiêm mẫu chia dòng)

Nhiệt độ: 250 ˚C , Áp suất: 12,361 psi

Tổng dòng: 101,55 ml/min, Tỷ lệ chia dòng: 100:1

21

+ Oven: Nhiệt độ ban đầu 40˚C trong 1 phút, sau đó tăng lên 100˚C với tốc độ 10°C/min, giữ trong 7 phút Sau khi ngừng phân tích, tăng lên 280˚C với tốc độ 4°C/min trong 72 phút Tổng thời gian phân tích mẫu 80 phút

+ Column: Nhiệt độ: 60˚C, Áp suất: 12,361 psi

Chế độ chạy đẳng dòng: 1,5ml/min

+ General Information: Tune File: Stune u, Acquistion mole: Scan

+ MS Information: Slovent Delay: 4,50 min ( thời gian cắt bỏ dung môi)

+ Scan parameters: Low Mass: 30,0, High Mass: 300,0

Lưu phương pháp đã thiết lập

- Xử lý kết quả: Sử dụng phần mềm DATA ANALYSIS Đối chiếu khối phổ của

các chất ghi nhận được với các thư viện phổ khối WILEY W9N08 để nhận dạng các thành phần của tinh dầu Hàm lượng % tương đối của các thành phần được tính dựa trên diện tích pic

22

Hình 3.5 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn, dịch

chiết nước và dịch chiết ether dầu hỏa hành tây

Hình 3.6 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất khác trong hành tây

 Tiến hành chiết xuất dịch chiết cồn để định tính flavonoid, coumarin

Cân khoảng 3g dược liệu đã làm nhỏ cho vào bình nón 100ml Thêm 50ml ethanol 90%, đun sôi cách thủy sôi trong 10 phút, lọc nóng Dịch lọc thu được

để nguội, đem định tính flavonoid, coumarin

 Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết cồn, thêm một

ít bột magnesi kim loại (~10mg) Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt) Để yên 1-2 phút Nếu dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ, phản ứng dương tính (+)

23

- Phản ứng với kiềm:

+ Phản ứng với NH 3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút Nếu màu vàng của vết dịch chiết tăng lên, phản ứng dương tính (+)

+ Phản ứng với dung dịch NaOH: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết

cồn Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Sau đó thêm 1ml nước cất Nếu sau khi thêm NaOH dung dịch xuất hiện kết tủa vàng, thêm 1ml nước cất thì tủa tan, màu vàng của dung dịch đậm lên, phản ứng dương tính (+)

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết

cồn Thêm 1-2 giọt dd FeCl3 5% Nếu dung dịch xuất hiện tủa màu xanh đen, phản ứng dương tính (+)

 Định tính coumarin

- Phản ứng mở, đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết cồn

Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát thấy:

Ống 1: Dung dịch trong suốt

Ống 2: Tủa đục

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc Nếu ống 1 đục như ống 2, phản ứng dương tính (+)

- Quan sát hiện tượng huỳnh quang

Nhỏ lên một khoanh giấy thấm 2 vết dịch chiết cồn (mỗi vết 2-3 giọt dịch chiết) Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên 2 vết dịch chiết Sấy nhẹ Che một

24

vết dịch chiết trên giấy thấm bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút Bỏ miếng kim loại ra Nếu vết dịch chiết không bị che có huỳnh quang sáng hơn vết dịch chiết bị che, phản ứng dương tính (+)

 Tiến hành chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính

tanin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccharid, đường khử

Cân khoảng 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50

ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội để làm các phản ứng

 Định tính tanin

Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml dịch lọc nước, làm các phản ứng sau:

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Ống 1 thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin

1% mới pha Nếu xuất hiện tủa bông trắng, phản ứng dương tính (+)

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Ống 2 thêm 2-3 giọt dd FeCl3 5% Nếu xuất hiện kết tủa màu xanh đen, phản ứng dương tính (+)

- Phản ứng với dung dịch chì acetat: Ống 3 thêm 2-3 giọt dung dịch chì acetat

10% Nếu xuất hiện tủa bông trắng, phản ứng dương tính (+)

 Định tính đường khử

Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch lọc thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml Fehling B, đun cách thuỷ 10 phút Nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch, phản ứng dương tính (+)

 Định tính polysaccharid

Lấy 2 ống nghiệm lớn, cho vào mỗi ống:

Ống 1: 3 ml dịch lọc và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 3 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 3: 3 ml dịch lọc

Nếu ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2 và ống 3, phản ứng dương tính (+)

25

 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm lớn 3 ml dịch lọc, thêm 1 ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm Nếu xuất hiện bọt khí bay lên, phản ứng dương tính (+)

 Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng định

tính sterol, chất béo, caroten

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml Đổ ngập ether dầu hỏa, chiết hồi lưu trong 1 giờ Lọc thu lấy dịch lọc để làm các phản ứng

 Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết

dung môi Nếu có vết mờ trên giấy lọc, phản ứng dương tính (+)

 Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thuỷ bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45º, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Nếu tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng tròn màu tím đỏ, phản ứng dương tính (+)

 Định tính caroten

Cho vào chén sứ nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thuỷ bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Nếu thấy xuất hiện màu xanh lá, phản ứng dương tính (+)

 Định tính saponin

- Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho khoảng 5 g bột dược liệu vào bình định mức 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% Đun cách thủy đến sôi trong 30 phút Lọc nóng Dịch lọc thu được đem cô cách thủy đến cắn Hòa tan lượng cắn thu được trong 5 ml nước nóng Lọc vào một ống nghiệm 1,6 cm x 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dung ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm

3 ống nghiệm:

- Ống 1: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer

Nếu ống nghiệm xuất hiện tủa trắng, phản ứng dương tính (+)

- Ống 2: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat

Nếu ống nghiệm xuất hiện tủa nâu, phản ứng dương tính (+)

- Ống 3: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff

Nếu ống nghiệm xuất hiện tủa vàng, phản ứng dương tính (+)

 Định tính anthranoid

Phản ứng Borntraeger:

Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml Thêm 10

ml dung dịch H2SO4 1N Đun sôi khoảng 15 phút Lọc dịch chiết nóng qua giấy lọc vào bình gạn dung tích 50 ml Để nguội Thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ, gạn

bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm phản ứng

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform, cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Nếu lớp nước chuyển sang màu đỏ sim, phản ứng dương tính (+)

 Định tính glycosid tim

Cân khoảng 3 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 200 ml Thêm 100 ml ethanol 25 % rồi ngâm trong 24 giờ Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ có dung tích 100ml Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc qua giấy

27

lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại, và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 125 ml Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp cloroform: ethanol (4:1), mỗi lần với 8 ml Gạn dịch chiết cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng của khung steroid

- Phản ứng Liebermann- Bouchardat: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml

anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 45º Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu ởgiữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ, phản ứng dương tính (+)

 Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

- Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90%

Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều Nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ cam, phản ứng dương tính (+)

- Phản ứng Baljet: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) Nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ cam, phản ứng dương tính (+)

 Phản ứng của phần đường

- Phản ứng Keller- Kiliani: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol

90o Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ, phản ứng dương tính (+)

28

2.2.2.3 Định tính các phân đoạn dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng

 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hành tây

Dược liệu (50g) được chiết hồi lưu với methanol, 3 lần Gộp các dịch chiết, cất thu hồi methanol dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đặc Phân tán dịch chiết đặc trong nước nóng rồi lần lượt chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, cloroform, ethyl acetat thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng là phân đoạn n-hexan, phân đoạn cloroform, phân đoạn ethyl acetat Cất thu hồi dung môi các phân đoạn dịch chiết dưới áp suất giảm và cô cách thủy thu được các cắn phân đoạn tương ứng là cắn n-hexan, cắn cloroform, cắn ethyl acetat

- Bản mỏng Silica gel GF254 đã hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ

- Chấm các dịch chiết lên bản mỏng và khai triển với hệ dung môi tương ứng

- Quan sát vết ở ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại (UV254 và UV366)

- Hiện vết bằng thuốc thử Vanillin-acid sulfuric

- Phân đoạn cloroform và ethyl acetat được chấm so sánh với Quercetin chuẩn

29

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính enzym xanthin oxidase và đối với sự ngưng tập tiểu cầu in vitro

2.2.3.1 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với hoạt tính

enzym xanthin oxidase in vitro

Thí nghiệm được tiến hành với 2 mẫu: lớp vỏ ngoài và lớp trong thân hành

hành tây

- Dược liệu được làm nhỏ, xác định hàm ẩm Cân chính xác một lượng dược

liệu, chiết bằng methanol sử dụng bộ dụng cụ soxhlet đến khi dịch chiết trong bình chứa dược liệu âm tính trong phản ứng với dung dịch kiềm Cô dịch chiết đến cắn, xác định hàm ẩm cắn

- Cắn toàn phần được pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau Đánh giá

tác du ̣ng ức chế enzym XO in vitro trên đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635

(Corning), đo độ hấp thụ ở 290 nm trên hệ thống ELISA gồm máy đọc khay (Biotek) và máy ủ lắc khay (Awareness), triển khai theo phương pháp của Noro

T [64] và Nguyen M T T [62] nhưng có điều chỉnh cho phù hơ ̣p với điều kiê ̣n

nghiên cứu Tiến hành song song với mẫu chứng

Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm Graphpad prism

I (% ức chế) được tính theo công thức:

2.2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hành tây đối với sự ngưng tập

tiểu cầu in vitro

Thí nghiệm được tiến hành với 2 mẫu: lớp vỏ ngoài và lớp trong thân hành

hành tây

Dược liệu được làm nhỏ, xác định hàm ẩm Cân chính xác 1 lượng dược

liệu đã làm nhỏ, chiết bằng methanol sử dụng bộ dụng cụ chiết soxhlet đến khi dịch chiết trong bình chứa dược liệu âm tính trong phản ứng với dung dịch kiềm

Cô dịch chiết đến cắn, xác định hàm ẩm của cắn Cân lượng cắn thích hợp, hòa tan trong lượng tối thiểu DMSO (nồng độ DMSO tối đa là 1%), từ đó pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau trong dung dịch đệm phosphat salin (PBS) pH=7,4 [39], [57], [60], [68]

- Tiến hành đo độ ngưng tập tiểu cầu của mẫu thử so với chứng âm trên máy đo

độ ngưng tập tiểu cầu tự động Chronolog Giá trị % ức chế (I%) được tính theo công thức :

(% Độ ngưng tập của chứng âm - % Độ ngưng tập của thử)

% Ức chế (I%) = ×100%

% Độ ngưng tập của chứng âm