Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học hoa sứ vàng (plumeria rubba f tricilor)

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị.. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của c

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT

SỐ LOẠI CAO CHIẾT VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH TÍNH

THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOA SỨ VÀNG

(PLUMERIA RUBRA F TRICILOR)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt

TP Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình

TP HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

LỜI CẢM ƠN

Để có kiến thức và bài báo cáo tốt nghiệp ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ sinh học trường HUTECH đã giảng dạy những kiến thức cơ bản và bổ ích cho em

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt đến thầy ThS Phạm Minh Nhựt đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy phụ trách phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt quá trình thực hành

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm qua và trong quá trình thực hiện đồ án này

Em cũng xin cảm ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này

Và em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này

Lời cuối cùng em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô

Tp Hồ Chí Minh, 27 tháng 07 năm 2016

Sinh viên thực hiện

ĐINH VŨ NGHỊ

i

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về Hoa Sứ vàng 3

1.1.1 Nguồn gốc và tên gọi 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

1.1.4 Phân bố 5

1.1.5 Tác dụng dược lý 5

1.1.6 Công dụng 5

1.1.7 Thành phần hóa học và dược chất 6

1.2 Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 7

1.2.1 Khái niệm và phân loại 7

1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 7

1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng 8

1.2.3.1 Alkaloid 8

1.2.3.2 Flavonoid 10

1.2.3.3 Tinh dầu 11

1.2.3.4 Saponin 12

1.2.3.5 Tannin 13

ii

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam 14

1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 15

1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 15

1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 15

1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella 16

1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 17

1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn Shigella spp 18

1.3.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 20

1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 20

1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis 21

1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.1.1 Địa điểm 25

2.1.2 Thời gian 25

2.2 Vật liệu 25

2.2.1 Vật liệu 25

2.2.2 Chủng vi sinh vật 25

2.2.3 Môi trường nuôi cấy và hóa chất 25

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ 26

2.2.4.1 Thiết bị 26

2.2.5.2 Dụng cụ 26

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật 27

2.3.2 Phương pháp tăng sinh 27

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 27

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 27

iii

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 28

2.3.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào 28

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu 28

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 29

2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học 29

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 32

2.4 Bố trí thí nghiệm 32

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng 36

2.4.3 Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ vàng 40

3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị 41

3.2.1 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 41

3.2.2 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp 44

3.3.3 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp 46

3.3.4 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp 48

3.3.5 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp 50

3.3.6 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại 53

3.3.7 Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh 55

iv

3.3 Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ

vàng từ ethanol 70% 59

Kết luận và kiến nghị 62

1 Kết luận 62

2 Kiến nghị 62

Tài liệu tham khảo 63

Phụ lục 1

v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

NA: Non activity

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) các loại cao chiết khác nhau từ Hoa

Sứ vàng đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị 55Bảng 3.2 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Hoa Sứ vàng từ ethanol 70% 59

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hoa Sứ vàng 3

Hình 1.2 Cây Hoa Sứ vàng 4

Hình 1.3 Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid 6

Hình 1.4 Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử 16

Hình 1.5 Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.6 Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử 18

Hình 1.7 Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử 19

Hình 1.8 Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử 20

Hình 1.9 Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử 22

Hình 1.10 Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử 23

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33

Hình 2.2 Quy trình tách chiết và thu cao Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi khác nhau 34

Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ vàng với các chủng vi khuẩn chỉ thị 36

Hình 2.4 Quy trình định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ vàng 38

Hình 3.1 Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ vàng với các loại dung môi 40

Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 42

Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp 44

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp 46

Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp 49

Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp 51

Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn còn lại 53

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước tính Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% Kết quả điều tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc Trong thời gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng năm Như vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang được các nước trên thế giới hết sức quan tâm

Cây thuốc được coi là di sản quý báu của dân tộc ta.Từ xa xưa, cây thuốc gắn liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh Tuy chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con người nhưng chúng được sử dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ, độc hại cho người sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống.Hiện nay, hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng được nghiên cứu và phát triển nhiều hơn bởi các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang lại cho việc điều trị bệnh Trong thời đại mà việc sử dụng thuốc kháng sinh không còn hiệu quả thì thảo dược tự nhiên là câu trả lời đáng tin cậy và dài hạn cho việc ức chế vi sinh vật có hại và nâng cao đề kháng, hỗ trợ tốt cho quá trình điều trị bệnh Theo một số nghiên cứu, các loại thảo dược điển hình như Trầu Không (Piper betle L.), Sống Đời (Kalanchoe pinnata (Lam) Pers.), Lô hội (Aloe barbadensis), Dâu Tằm (Morus acidosa Griff), Khổ Qua (Momordica charantia L.)… đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất

mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp

… Chính vì thế mà ngày nay, không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, các nhà

2

khoa học không ngừng nghiên cứu và tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật.Điều này giúp họ sử dụng hiệu quả hơn các nguồn dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh

Plumeria là một loài thực vật khá phổ biến ở Việt Nam Trong đó, ngoài giá trị làm cảnh trang trí thì nó còn được sử dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như viêm ruột, lỵ, khó tiêu, nhiễm khuẩn, viêm gan… Thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học của Plumeria đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, nhiều hợp chất có hoạt tính tốt đã được công bố Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu về cây này vẫn chưa có tài liệu nào được công bố rộng rãi

Từ những vấn đề trên tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn của một số cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F Tricilor)” để thực hiện đồ án tốt nghiệp

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ vàng

- Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong cao chiết

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết Hoa Sứ vàng từ 4 dung môi EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 96% và nước

- Xác định thành phần hóa học của cao chiết

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về Hoa Sứ vàng

1.1.1 Nguồn gốc và tên gọi

Xuất xứ của hoa sứ từ Trung mỹ và Caribe Ngày nay hoa sứ được tìm thấy nhiều ở các hải đảo Thái Bình Dương, các quốc gia Nam Á, Ɖông Nam Á, Trung và Nam Mỹ Hoa sứ là quốc hoa của Lào và của Nicaragua, nơi hoa sứ được gọi

là Sacuanjoche Quốc hiệu Champa mà ta gọi là Chiêm Thành có gốc tiếng Ấn Ɖộ

(Hindi) có nghĩa là cây hoa sứ

Tên khoa học của cây hoa sứ là Plumeria rubra thuộc họ Apocynaceae của trúc đào Chữ Plumeria là tên của nhà thực vật học Pháp Charles Plumier vào thế kỷ XVII Người Anh gọi hoa sứ là temple tree vì ở Ấn Ɖộ và Sri Lanka cây hoa sứ được

trồng quanh các đền Ấn Giáo và chùa Phật Giáo Nó cũng được trồng trong các nghĩa

địa Ở Sri Lanka nó được xem là sinh mộc Hoa sứ cũng còn được gọi là frangipani do tên của hầu tước Ý Muzio Frangipani mà ra Người Ấn Ɖộ gọi hoa sứ là Champa; Lào:Champa; Sri Lanka tức đảo Ceylon: Champey; Indonesia: Kampoja; Trung Hoa: Dai Ji Hua (Ɖại Cát Hoa); Khmer: Champei krahom (hoa sứ đỏ); tiếng Tagalog (Phi Luật Tân): Kalasusi, v.v

Tên khoa học: Plumeria rubra L tricilor

Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại,…

Hình 1.1 Hoa Sứ vàng

4

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây cao khoảng 2-3m, có khi cao đến 7m Thân tròn mập, phân cành nhiều nhánh, dài, khẳng khiu, cong, xù xì Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá để lại Cây có nhựa mủ

Hình 1.2 Cây Hoa Sứ vàng

Lá cây Sứ thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu Lá có màu xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và các gân viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để lại sẹo lớn ở cành

Cây Sứ ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30-50cm, phân nhánh

ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng Các hoa có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp vặn, nở bung thì có màu trắng ở viền của cánh hoa, tâm màu vàng cùng nhị đính trên ống tràng và phía sau cánh hoa có những đường sọc màu hồng Hoa nở quanh năm và mang mùi thơm thoang thoảng Cây Sứ có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 – 15cm Quả chứa các hạt có cánh nhưng ít gặp vì Sứ Đại khó đậu trái

Cây Sứ có tốc độ sinh trưởng nhanh Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì Sứ có khả năng chịu hạn cao

5

1.1.4 Phân bố

Cây được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu đô thị, khu công nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân vườn… Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất nhiều

1.1.6 Công dụng

Công dụng làm cảnh: Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ nhứng cây nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công nhà,…cho tới những cây lớn được trồng trong sân vườn, công viên, đình chùa,….đem lại vẻ đẹp hương thơm từ hoa nở quanh năm và bóng mát từ tàn cây rộng

Công dụng làm thuốc: Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây hoa sứ

có thể dùng làm thuốc như vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa Toàn cây có chứ một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát tiển của một số vi khuẩn

Mycobacterium tuberculosis Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng

khác nhau:

Hoa dùng trong các trường hợp như say nắng; viêm ruột, lỵ; khó tiêu, kém hấp

và kém dinh dưỡng ở trẻ em; nhiễm khuẩn, viêm gan; viêm phế khí quản, ho Người ta còn dùng hoa Sứ làm thuốc chữa bênh ưa chảy máu có kết quả tốt Ngày dùng 10-15g dạng thuốc sắc Không dùng cho người suy nhược toàn thân, ỉa chảy và phụ nữ có thai

Nhựa cũng dùng được như vỏ, còn dùng chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt dưới dạng nhũ dịch, thường dùng bôi Ở Ấn Độ, người ta còn dùng như chất gây sung huyết để trị thấp khớp và còn dùng sổ

Lá chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt, thường dùng giã đắp ngoài, không kể liều lượng Ở Papua Niu Ghinê dịch lá đùng đắp vết thương rắn cắn hoặc dùng nhựa cây đắp vào chỗ đau

1.1.7 Thành phần hóa học và dược chất

Tinh dầu hoa có hàm lượng 0,04-0,07%; trong tinh dầu có geraniol, citroneellal, farnesol, linalol và aldehyd, fulvoplumierin, chất nhựa quercetin, vết kaempferol và cyanidin, diglycosid Vỏ ngoài chứa fulvoplumierin và plumierid, agoniadin, acid plumieric, acid cerotinic, lupeol Lá chứa 0,83% plumierid, acid resinic Nhựa chứ acid plumieric

Hình 1.3 Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid

7

Fulvoplumierin có tác dụng ức chế các chủng khác nhau của Mycobacterium tuberculosis ở nồng độ 1 - 5mg/1ml Plumierid là iridoid glycosid có tác dụng lên vi

khuẩn gram âm và gram dương

Nghiên cứu tại Trường Dược Illinois (Chicago), ghi nhận hoạt chất loại iridoid: fulvoplumierin trích từ Sứ có khả năng ức chế men reverse transcriptase của siêu vi HIV-1 nơi người (Journal of Natural Products Số 54 (Jan-Feb)-1991)

1.2 Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

1.2.1 Khái niệm và phân loại

Các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus Các hợp chất kháng khuẩn thường có tác dụng khá đặc hiệu lên các loài vi khuẩn khác nhau

ở một nồng độ thường là rất nhỏ Những chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như alkaloid, các hợp chất quinone, flavonoid, tinh dầu v.v…

Ngày nay người ta chia các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ra làm 2 nhóm sau:

Nhóm bay hơi: gồm những chất do thực vật tiết ra có khả năng khuếch tán vào không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của virus, vi khuẩn

Nhóm không bay hơi: gồm những chất ở sâu trong các tế bào thực vật, không

có khả năng khuếch tán vào không khí Muốn sử dụng nó, phải dựa vào đặc điểm, tính chất của từng loại kháng sinh thực vật Thường người ta hay sử dụng chúng dưới các dạng: Giã nát lấy nước cốt, ngâm, sắc hoặc chiết bằng các dung môi thích hợp

1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế bào Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary

8

metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013)

1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng

1.2.3.1 Alkaloid

a) Khái niệm về alkaloid

Năm 1819, Wilhelm Meissner đề nghị xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật

ra thành một nhóm riêng và gọi tên là alkaloid Ông là người đầu tiên đưa ra khái niệm

về alkaloid: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy

từ thực vật

Theo Polonopski: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid

b) Tính chất chung của alkaloid

Đặc điểm lý học:

Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa

là trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2)… Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng Ví dụ như: Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2 ) Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu

Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaixin, piperin…

Đặc điểm hóa học: Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất

có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu như cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp

Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức

Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid

c Vai trò của alkaloid

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc Tác dụng của alkaloid thường khác nhau Nhiều alkaloid có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương gây ức chế như morphin, codein, scopolamin, reserpin hoặc gây kích thích như strychnin, cafein, lobelin Nhiều chất tác dụng lên hệ thần kinh giao cảm gây kích thích: Ephedrin, hordenin, làm liệt giao cảm, ergotamin, yohimbin hoặc kích thích phó giao cảm: pilocarpin, eserin; có chất gây liệt phó giao cảm: hyoscyamin, atropin; có chất phong bế hạch giao cảm: nicotin, spartein, coniin

10

Trong số alkaloid có chất gây tê tại chỗ, có chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt Có alkaloid làm tăng huyết áp (ephedrin, hydrastin), có chất làm hạ huyết áp trên tim như ajmalin, quinidin và α-fagarin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim Có alkaloid diệt ký sinh trùng: Quinin độc đối với ký sinh trùng sốt rét; emetin và conexin độc đối với amip dùng để chữa lỵ Isopelletierin, arecolin dùng để trị sán

1.2.3.2 Flavonoid

a Khái niệm chung về flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon, cần chú ý

để khỏi nhầm lẫn

b Tính chất chung của flavonoid

Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất thuôc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu

Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác

Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycoside và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi

11

hữu cơ, không tan trong nước Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng

c Vai trò của flavonoid

Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây

ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzyme oxy hoá - khử Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, các bệnh trong nhãn khoa Các dẫn chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc

Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác) Flavonoid còn có tác dụng thông tiểu, chống loét chữa đau dạ dày, chống viêm điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị, điều hòa nhịp tim

Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-b-Dgalactopyranosid

1.2.3.3 Tinh dầu

a Khái niệm về tinh dầu

Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước

b Tính chất chung của tinh dầu

Thể chất: Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn: Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin

Vị: cay, một số có vị ngọt: Tinh dầu quế, hồi

Bay hơi được ở nhiệt độ thường

Tỷ trọng: Đa số nhỏ hơn 1 Một số lớn hơn 1: Quế, đinh hương, hương nhu

c Vai trò của tinh dầu

Tinh dầu đóng vai trò quyến rũ côn trùng giúp cho sự thụ phấn của hoa Một số nghiên cứu khác cho rằng tinh dầu bài tiết ra có nhiệm vụ bảo vệ cây, chống lại sự xâm nhập của nấm và các vi sinh vật khác

Tinh dầu và các dược liệu chứa tinh dầu có một phạm vi sử dụng rất rộng lớn trong đời sống hàng ngày của con người, trong nhiều ngành khác nhau thể hiện qua những tác dụng:

Tác dụng trên đường tiêu hoá: Kích thích tiêu hoá, lợi mật, thông mật

Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinh dầu bạch đàn, bạc hà Tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa cây Barosma betulina

Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh dầu giàu anethol: Đại hồi

13

Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao

b Tính chất chung của saponin

Saponin có một số tính chất đặc biệt: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng; có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác

Saponin gây độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

Saponin đa số có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất

c Vai trò của saponin

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn, Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu

Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể) Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid

1.2.3.5 Tannin

a Khái niệm chung về tannin

Từ "Tanin" được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền Do đó, tanin được định nghĩa là những hợp chất

14

polyphenol có trong thực vật có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn

b Tính chất chung của tannin

Tanin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ

Kết tủa với gelatin Dung dịch tanin (0,5-1%) khi thêm vào dung dịch gelatin 1% có chứa 10% natrichlorid thì sẽ có tủa Acid gallic và các pseudotanin khác cũng làm kết tủa gelatin nhưng với dung dịch tương đối đậm đặc

Kết tủa với các alkaloid Tanin tạo tủa với các alcaloid hoặc một số dẫn chất hữu cơ có chứa nitơ khác như hexamethylen tetramin, dibazol

Kết tủa với muối kim loại Tanin cho tủa với các các muối kim loại nặng như chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt

Phát hiện acid chlorogenic Dịch chiết có acid chlorogenic khi thêm dung dịch ammoniac rồi để tiếp xúc không khí dần dần sẽ có màu xanh lục

c Vai trò của tannin

Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây

Dung dịch tanin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu Tanin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy

Tanin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam

Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới

15

 Năm 2010, Ajay Singh Baghel và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng

khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L bằng các loại dung môi nước,

ethanol, etyl acetate, chloroform

 Năm 2015, Lawal và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất

tinh dầu từ lá Plumeria rubra L trồng ở Nigeria

 Năm 2012, Ramproshad và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất etanol thô của

Plumeria rubra cho thấy có hoạt tính chống oxy hoá mạnh và có hoạt tính kháng khuẩn trung bình Hoạt động giảm đau của Plumeria rubra đã được

thử nghiệm bằng mô hình xoắn gây axit axetic ở chuột Chiết xuất này gây

ra sự ức chế đáng kể ở liều 500mg/kg-thể trọng Chiết xuất thô của

Plumeria rubra trong thí nghiệm cho thấy nó có hoạt tính giảm đau mạnh

 Năm 2014, Muruganantham và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng

khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra

 Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn

từ chiết xuất tinh dầu của Plumeria rubra

Tình hình nghiên cứu về cây Sứ tại Việt Nam đặc biệt là Hoa Sứ vàng hiện còn chưa có tài liệu và nghiên cứu được công bố rộng rãi

1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh

1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli

a) Đặc điểm

Escherichia là trực khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào

tử Nhiệt độ thích hợp 37oC, pH 7,2 – 7,4 Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của người và động vật Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa (Trần Văn Cường, 2009)

Đặc điểm sinh hóa của Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên dòng Escherichia cụ thể là E coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, fructose,

16

glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường dulcitol, saccharose và salicin Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn

Cường, 2009)

b) Khả năng gây bệnh

Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, vertoxin, neurotoxin Mỗi

loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009)

1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella

a) Đặc điểm

Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí tùy nghi, hình que, có khả năng di

động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC, pH 7,6 (Trần Văn Cường, 2009)

7,2-Hình 1.4 7,2-Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử

17

Hình 1.5 Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử

b) Khả năng gây bệnh

Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá

hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – độc tố không chịu nhiệt) và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn Cường, 2009)

1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp

a) Đặc điểm

Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, hình cong, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6 μm

Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh, kỵ khí tùy nghi Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thường và

môi trường kiềm (pH >7) Vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần Dễ bị diệt bởi

nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit nhiệt độ thích hợp là 37oC, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5- 9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) (Triệu Anh Tuấn, 2013)

18

Hình 1.6.Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính (Triệu Anh Tuấn, 2013)

b) Khả năng gây bệnh

Vibrio cholearae gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen) Đây là nội độc tố có

cấu trúc gồm đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao)

và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat) Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo (Triệu Anh Tuấn, 2013)

19

Trong môi trường lỏng làm đục đều Trên môi trường đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2 mm, tròn lồi mặt nhẵn bờ đều Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei

lên men lactose nhưng chậm, không sinh H2S, Urease âm tính, phản ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrate âm tính (Chang Tran, 2014)

b) Khả năng gây bệnh

Các chủng Shigella đều có độc tố ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2

chúng làm thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng

tiết dịch Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng

tính kháng nguyên yếu Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột Ngoại

độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm

có thể gây thành các vụ dịch địa phương Thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài

nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu Shigella gây bệnh bằng cơ chế

Hình 1.7 Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử

20

xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ

chức ruột Các Shigella đều có nội độc tố Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc

tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của

Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn

Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014)

1.3.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

a) Đặc điểm

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Đặc điểm hình thái học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

Hình 1.8 Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử

Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, hiếu khí Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 – 42oC,

pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 Trên môi trường đặc:

21

khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên

môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β)

Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa: không lên men

glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate (+) oxidase (+), sản xuất hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate, sử dụng glycerol, succinate, L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Nguyễn Thị Như Yến

và ctv, 2011)

b) Khả năng gây bệnh

Độc tính của Pseudomonas aeruginosa chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao

gồm loài Pseudomonas aeruginosa đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi

cũng như lòai sâu bọ cánh phấn Pseudomonas aeruginosa gây chết loài muỗi ở giai

đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố

như của P aeruginosa đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat

động trên protein tan huyết Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất của P aeruginosa tiết ra như là phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011)

1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis

a) Đặc điểm

Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát

triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, một số phát triển được ở 10 tới 40oC (Dương Văn Sĩ, 2010)

22

Hình 1.9 Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử

Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu thì khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong Có phản ứng catalase và oxidase

âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường (Dương Văn Sĩ, 2010)

b) Khả năng gây bệnh

Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng

1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus

Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường

kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm:

Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius

Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri

a) Đặc điểm

23

Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Staphylococcus có khả năng phát triển được ở

khoảng nhiệt độ dao động từ 10 tới 45oC và môi trường có nồng độ muối cao tới 10%

Hình 1.10 Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử

Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau 24

giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng (đối với các loại Staphylococcus khác)

Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có

màu vàng Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng

và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm,

có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc một số dòng S.aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012)

b) Khả năng gây bệnh

Một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào Nhờ chất

25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nhóm vi khuẩn Shigella spp gồm: S boydii, S flexneri và S sonnei

Nhóm vi khuẩn Vibrio spp gồm: V cholerae, V harveyi, V alginolyticus và V parahaemolyticus

Nhóm vi khuẩn Salmonella spp gồm: S dublin, S enteritidis, S typhi và S typhimurium

Nhóm vi khuẩn Listeria spp gồm Lis innocua và Lis monocytogenes

Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác bao gồm : Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis

2.2.3 Môi trường nuôi cấy và hóa chất

Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ)

Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ)

Ethanol (Việt Nam)

26

DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc)

Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner, Ninhidrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic anhydride, gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc

Máy chưng nước cất

Efpendoff Que trang Dao cấy Cây đục lỗ Đèn cồn Bông không thấm Bông thấm

Parafim

Mẫu tươi được rửa sạch loại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khô, sau đó xay thành dạng bột Bột Hoa Sứ sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với dung môi trong 24 giờ và lặp lại 3 lần Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách

cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo quản ở nhiệt độ 4oC

2.3.2 Phương pháp tăng sinh

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật

mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa

vi sinh vật và môi trường

Cách tiến hành: Môi trường TSB được sử dụng để làm môi trường tăng sinh Môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút ở 1 atm Thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng, lấy 100µl sinh khối của chủng vi khuẩn thử nghiệm bằng micropipet cho vào chai môi trường có 20ml TSB, lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm chính

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn

28

được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần

Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào

Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol

Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Evaluation of Cameroonian plants towards experimental bone regeneration Văn Hợp, 2007)

2.3.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức MacFahrland):

Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (CFU/ml)

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật Việc pha loãng mẫu ở các nồng

độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân

bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu

29

Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa

9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013)

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị Nếu cao chiết có khà năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch

Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

Cách thực hiện: Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ thích hợp cho vào môi trường TSA và tiến hành trang đều cho tới khô Sau đó, dùng một ống trụ kim loại có đường kính 6 mm tạo các giếng trên đĩa thạch và nhỏ 100µl dịch cao chiết

ở nồng độ khảo sát vào, giữ yên trong vòng 1 giờ để dịch cao chiết có thể khuếch tán vào môi trường thạch Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) ( Ramakrishnan, 2011)

2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ Hoa

Sứ vàng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để

sơ bộ hóa thành phần hoạt chất (Lâm Văn Tiến và cộng sự, 2015)

Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến

hành lọc và thu dịch lọc Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng

a) Định tính carbohydrate

30

Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho

5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào

và đọc kết quả Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím

Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt

1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của CuO

Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc

kết quả Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch

b) Định tính alkaloid

Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành

Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam

Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng

Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung

2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả Kết quả dương tính là khi hình thành kết

tủa màu nâu đỏ

c) Định tính saponin

Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc

mạnh và đọc kết quả Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định

d) Định tính cardiac glycoside