Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và bước đầu đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của một loài ABRUS SP ở thanh hóa

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân cam thảo dây bằng phản ứng hóa học………..28 Bảng 3.2.. Các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu thành phần hóa học của rễ, thân, lá, hạt ca

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM

IN VITRO CỦA MỘT LOÀI ABRUS SP

Ở THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06 Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Hà

TS Hà Vân Oanh

HÀ NỘI 2016

ii

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học của Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu, cùng đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị

Hà và TS Hà Vân Oanh, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới TS Trần Thị Hiền, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển đã giúp đỡ tôi trong quá trình thử tác dụng sinh học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu và các thầy cô Bộ môn Dược liệu, Thực vật, Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Nghiên cứu này được Quỹ nghiên cứu khoa học cơ bản-Viện Dược liệu tài trợ (đề tài mã số VDL- ĐTCS.04 /2015-2016) Tôi cũng xin cảm ơn Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng-Viện Hoá học thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và TS Nguyễn Tiến Đạt đã giúp đo phổ khối của các hợp chất tinh khiết

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, thư viện Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Lời sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và chia sẻ giúp tôi đạt được những kết quả ngày hôm nay

Hà Nội, Ngày 4 tháng 5 năm 2016

Nguyễn Thị Ngọc Loan

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN……… ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ………vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ……… viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ……… ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại của chi Abrus 2

1.2 Chi Abrus 2

1.2.1 Đặc điểm thực vật……… 2

1.2.2 Phân bố……… 2

1.3 Cam thảo dây ……… 4

1.3.1 Đặc điểm thực vật 4

1.3.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 4

1.3.3 Thành phần hóa học ……… 4

1.3.3.1 Những nghiên cứu nước ngoài……… 4

1.3.3.2 Những nghiên cứu trong nước……… 8

1.3.4 Tác dụng sinh học……… 8

1.3.4.1 Tác dụng chống viêm……… 9

1.3.4.2 Tác dụng kháng khuẩn……… 9

1.3.4.3 Tác dụng chống oxy hoá……… 10

1.3.5 Bộ phận dùng……… 10

1.3.6 Tính vị, công năng ……… 11

1.3.7 Độc tính……… 11

1.4 Tổng quan về viêm và cơ chế chống viêm liên quan đến ức chế enzym COX-2 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 15

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu……… 15

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu……… 15

iv

2.1.2 Hóa chất, dung môi ……… 15

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị……… 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 17

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật……… 17

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học……… 17

2.2.2.1 Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ……… 17

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hợp chất từ một loài Abrus sp ở Thanh Hoá……….21

2.2.2.4 Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro……….22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……….24

3.1 Thực vật………24

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học loài Abrus sp……… 24

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu cây cam thảo dây……… 26

3.1.2.1 Vi phẫu thân cam thảo dây ……….26

3.1.2.2 Vi phẫu lá cam thảo dây ……….26

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu……… 27

3.1.3.1 Bột thân………27

3.1.3.2 Bột lá………28

3.2 Hóa học……….28

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân cam thảo dây ……… 28

3.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất thân cam thảo dây……….29

3.2.2.1 Chiết xuất……….29

3.2.2.2 Phân lập.……… 30

3.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất thân cam thảo dây……….35

3.2.3.1 Hợp chất AP1 ……… 35

3.2.3.2 Hợp chất AP3 ……… 36

3.3.2.3 Hợp chất AP4 ……… 37

3.3.2.4 Hợp chất AP5 39

v

3.3 Tác dụng chống viêm in vitro thân cam thảo dây……….41

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 44

4.1 Về thực vật……… 44

4.2 Về thành phần hóa học……… 44

4.2.1 Định tính 44

4.2.3 Phân lập các hợp chất……….45

4.3 Tác dụng chống viêm in vitro……… 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AP Abrus precatorius

APCI Atmospheric pressure chemical ionization

APH Cao phân đoạn n-hexan thân cam thảo dây

APE96 Cao chiết cồn 96% thân cam thảo dây

APE Cao phân đoạn ethyl acetat thân cam thảo dây

APW Cao phân đoạn nước thân cam thảo dây

COX-2 Cyclooxygenase-2

DMSO Dimethyl sulfoxid

GAE Đương lượng acid gallic

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H nuclear magnetic

resonance) HPLC High performance liquid chromatography

LD50 Lethal dose 50 (Liều gây chết 50% )

LPS Lipopolysaccharid

MCF7 Tế bào ung thư vú

MS Phổ khối (Mass spectrometry)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resource)

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Abrus……… 3

Bảng 1.2 Thành phần hoá học ……… 5

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân cam thảo dây bằng phản ứng hóa học……… 28

Bảng 3.2 Phổ 1D-NMR của hợp chất AP1……… 35

Bảng 3.3 Dữ liệu 1D-NMR của hợp chất AP3 36

Bảng 3.4 Dữ liệu 1D-NMR của hợp chất AP4 38

Bảng 3.5 Dữ liệu 1D-NMR của hợp chất AP5 39

Bảng 3.6 Các hợp chất tinh khiết phân lập được từ thân cam thảo dây 40

Bảng 3.7 Tác dụng ức chế COX-2 của cao cồn 96% và 03 cao phân đoạn 42

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một số hợp chất triterpenoid phân lập từ cam thảo dây

……… 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số hợp chất flavonoid phân lập từ cam thảo dây ……… 7

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học một số alkaloid phân lập từ cam thảo dây……… 7

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của abrin 12

Hình 3.1 Cây cam thảo dây chụp ở Thanh Hóa 23

Hình 3.2 Mẫu cam thảo dây thu tại ở Thanh Hóa 25

Hình 3.3 Hạt và lá cam thảo dây thu tại ở Thanh Hóa 25

Hình 3.4 Vi phẫu thân cam thảo dây……… 25

Hình 3.5 Vi phẫu lá cam thảo dây……… 27

Hình 3.6 Đặc điểm bột thân cam thảo dây……… 27

Hình 3.7 Đặc điểm bột lá cây cam thảo dây……… 28

Hình 3.8 Sơ đồ chiết xuất thân cam thảo dây……… 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ cao phân đoạn n-hexan thân cam thảo dây……… 31

Hình 3.10 Hình ảnh các chất AP1, AP3, AP4, AP5 33

Hình 3.11 Sắc ký đồ các chất AP1, AP3, AP4, AP5 33

Hình 3.12 Sơ đồ phân lập các chất trong phân đoạn n-hexan thân cam thảo dây 34

Hình 3.13 Hình ảnh so sánh tác dụng ức chế enzym COX-2 của mẫu đối chứng chuẩn, mẫu đối chứng dương và mẫu thử 42

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tiếp nối truyền thống tốt đẹp của cha ông ta, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học và kĩ thuật, chúng ta ngày càng có nhiều cơ hội để có thể khám phá, tiếp cận và tìm ra nhiều các tác dụng dược lý mới và thành phần hóa học của cây cỏ Việt Nam

Ở Việt Nam, chi Abrus có các loài: Kê cốt thảo (Abrus pulchellus Wall ex Thw subsp cantoniensis (Hance) Verdc), cườm thảo mềm (Abrus mollis Hance), cam thảo dây (Abrus precatorius Linn), cườm thảo chồi, dây cam thảo chồi (Abrus pulchellus Wall ex Thwaites subsp pulchellus) [5], [6] Các cây thuộc chi Abrus

thường có vị ngọt, tính mát, nhạt, có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, giảm đau Kê cốt thảo dùng toàn cây để điều trị viêm gan cấp và mạn tính, viêm nhiễm đường tiết niệu, đái ra máu; phong thấp đau nhức xương khớp Rễ của cườm thảo chồi, dây cam thảo chồi dùng trị cảm mạo, viêm gan thể hoàng đản Cam thảo dây dùng điều hòa các vị thuốc khác, chữa ho, giải cảm, trị hoàng đản do viêm gan siêu vi trùng Cườm thảo mềm dùng thay thế cam thảo dây nhưng tác dụng không mạnh bằng, rễ dùng trị cảm mạo, viêm gan thể hoàng đản [2], [5], [4], [11]

Các cây thuộc chi Abrus có rất nhiều công dụng chữa bệnh nhưng hiện nay

vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng

dược lý của chi này Hơn nữa, các cây thuộc chi Abrus có khả năng sinh trưởng và phát triển dễ dàng ở nước ta Đặc biệt, tác dụng nổi bật của chi Abrus là tác dụng

theo hướng chống viêm

Xuất phát từ cơ sở này, chúng tôi đã xây dựng đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và bước đầu đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của một loài Abrus sp ở Thanh Hóa” được thực hiện với các mục tiêu:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 3-5 chất

- Thử tác dụng ức chế enzym COX-2 trên in vitro của cao chiết tổng và cao chiết

phân đoạn.

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Vị trí phân loại của chi Abrus

Theo hệ thống phân loại về nghành Ngọc Lan (Magnoliophyta) của tác giả A.Takhtajan, chi Abrus có vị trí phân loại như sau:

Giới Thực vật: Plantae

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta

Lớp Ngọc Lan: Magnoliopsida Phân lớp Hoa hồng: Rosidae

Bộ Đậu: Fabales

Họ Đậu: Fabaceae Phân họ Đậu: Faboideae

3

tất cả các vùng nhiệt đới trên khắp thế giới, phổ biến nhất ở Florida và Hawaii, châu Phi, Nam Mỹ và phương Tây Ấn Độ [2], [4], [17]

Bảng 1.1: Danh sách các loài thuộc chi Abrus

Yemen

11 Abrus precatorius Cam thảo dây Ấn Độ, Việt Nam,

Trung Quốc

12 Abrus pulchellus Wall ex Thw

subsp cantoniensis (Hance)

Verdc

Kê cốt thảo Trung Quốc, Thái

Lan, Việt Nam

13 Abrus pulchellus Wall ex

Thwaites subsp pulchellus

Cườm thảo chồi, dây cam thảo chồi

Việt Nam, Thái

Quốc…

mềm

Việt Nam, Trung Quốc

4

Tuy nhiên, tham khảo tài liệu [96] công bố về các loài thuộc chi, tính cả các loài có tên khoa học đã được thông qua và chưa được thông qua chính thức, trên thế giới có khoảng 77 loài như liệt kê trong phụ lục 1

1.3 Cam thảo dây

Tên khoa học: Abrus precatorius L

Tên khác: tương tư tử, tương tư đậu, tương tư đằng, dây cườm, dây chi chi, ang krang, angkreng (Cămpuchia)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Dây leo, thường xanh Thân cành mỏng, có lông rất nhỏ Lá kép lông chim chẵn, mọc so le, dài 5-10 cm, mang 8-15 đôi lá chét to dần về phía ngọn, hình bầu dục, thuôn, đầu tù có mũi nhọn ngắn, gốc tròn, mặt trên xanh lục, mặt dưới xám nhạt, hai mặt đều có lông Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm, dài 3-6 cm,; hoa màu hồng, xếp rất sít nhau Qủa loại đậu, hơi dày, có lông nhỏ, hai đầu hơi vát, 3- 7 hạt, hạt hình trứng có vỏ cứng, màu đỏ chói, trơn bóng, một đốm đen ở quanh rốn hạt [2], [5], [6]

1.3.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Cam thảo dây là loài cây liên nhiệt đới, mọc trên các đồi cỏ, đất trồng, rừng còi,

rừng thưa mọc hoang trong rừng thưa vùng núi thấp đến trung du và miền núi đến

độ cao 1500 m [5], [6]

Cam thảo dây phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Nội, Hải Dương,

Hưng Yên, Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh, Đồng Nai, Cà Mau Ngoài ra, cam thảo dây cũng được trồng ở

nhiều nơi [2], [5], [6]

1.3.3 Thành phần hóa học

1.3.3.1 Những nghiên cứu nước ngoài

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều công bố về thành phần hóa học cam thảo dây Các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu thành phần hóa học của rễ, thân, lá, hạt cam thảo dây Thành phần hoá học chính của cam thảo dây gồm các

2 Hạt - Acid amin thiết yếu như serin, alanin, valin, cholin và

methyl ester

- Abrin (15), abralin (16), abrasion (17), abricin (18), acid abrusgenic (19), acid abrusgenic-methyl-ester (20), abruslacton (21), acid abrussic (22), anthocyanin (23), campesterol (24), cycloartenol (25), delphinidin (26), acid gallic (27), hypaphorin, N, N-dimethyl-tryptophan (28), N, N-dimethyltryptophan-metho-cation-methyl-ester (29), P-coumaroyl alloyl gluco delphinidin (30), hypaphorin (31), picatorin (32), acid olygalacturonic (33), precatorin (34) và protein trigonellin (35) [74]

- Abrus-saponin I và II (36), abrisapogenol (37), β-amyrin (38), squalen (39), abridin (40), cycloartenol (41), campesterol (42), cholesterol (43), -sitosterol (44), protein-abrin I (45), II (46) và III (47), flavonoid precatorin I, II, III (48-50), và anthocyanin-abrectorin (51), dimethoxycentaureidin-rutinosid (52), và xyloglucosyl-delophinidin (53) [59], [95]

6

xylose (64) Hợp chất nitơ precatorin (65), trigonellin (66), cholin (67) [59], [95]

Nhóm triterpenoid

Năm 2012, nhóm tác giả Trung Quốc đã phân lập từ lá và thân của cam thảo

dây thu hái tại đảo Hải Nam, Trung Quốc một saponin triterpenoid mới có tên β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl subprogenin D (68), và 6 hợp chất

3-O-triterpenoid: subprogenin D (69), acid abrusgenic (70), acid triptotriterpenic B (71), abruslacton A (72), abrusogenin (73) và abrusosid C (74) Cấu trúc của các hợp chất được xác định dựa trên các dữ liệu phổ 1D, 2D NMR và MS đồng thời so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố [88]

Năm 2012, 3 hợp chất triterpenoid mới được phân lập từ cao methanol của

lá cam thảo dây gồm: (20S, 22S)-3-β, 22-dihydroxycucurbita-5, acid

24-dien-26,29-dioic δ-lacton (75), 3-O-(6'-methyl-β-D-glucuronopyranosyl)-3-β, 22

β-dihydroxyolean-12-en-29- methyl ester (76) và

3-O-β-D-glucuronopyranosylsophoradiol methyl ester (77) [20], [35]

68 R = β-D-glu2-β-D-glu

69 R = H

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học một số hợp chất triterpenoid phân lập từ cam thảo

dây Nhóm flavonoid

Theo cuốn Những Cây thuốc và Động vật làm thuốc Việt Nam của Đỗ Huy Bích và cộng sự, rễ cam thảo dây có các chất flavonoid: abruquinon A (8),

7

abruquinon B (7, 8-methoxya-bruquinon A), abruquinon C (8) [4] Lá và thân còn

có flavonoid: luteolin (78), abrectorin (79), orientin (80), isoorientin (81), vitexin (82), taxifolin -3-glucosid (83) [2] Năm 2014, Yoshie Hata và cộng sự đã phân lập được 5 flavonoid từ dịch chiết cây cam thảo dây gồm: abruquinon A (6), abruquinon D (84), abruquinon J (85), abruquinon K (86), abruquinon L (87) [88]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một số hợp chất flavonoid phân lập từ cam thảo

dây Nhóm alcaloid

Theo cuốn Cây thuốc và Động vật làm thuốc Việt Nam, lá và thân, rễ cam thảo dây có hypaphorin (88), trigonellin (89) Hạt cam thảo dây có abrin (15), abralin (16), N-dimethyl tryptophan methyl este (29)… [2], [6]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số alcaloid phân lập từ cam thảo dây

8

1.3.3.2 Những nghiên cứu trong nước

Hiện nay, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi

Abrus, mới chỉ có 2 nghiên cứu mới được công bố về thành phần hóa học của hạt

cam thảo dây

Năm 2013, Phạm Thị Cẩm Lai đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết hạt cam thảo dây Quế Sơn – Đà Nẵng và bằng phương pháp GC-MS

đã xác định thành phần hóa hoc của dịch chiết cảm thảo dây: dịch chiết n-hexan

gồm hydrocarbon mạch dài, hydrocarbon thơm; dịch chiết ethyl acetat gồm acid hữu cơ, ester, terpen, steroid; dịch chiết chloroform gồm lacton, ether, ancol, ester của acid béo; dịch chiết methanol gồm alkaloid, phenol, flavonoid, ester, acid hữu

cơ Cũng trong nghiên cứu này, tác giả có đề nghị: mặc dù hạt cam thảo dây có chứa một số chất ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người như abrin, m-xylen, p- xylen, acid adipic, reten, acid palmitic ethyl ester, tuy nhiên nó vẫn có một số hợp chất ứng dụng trong y học như squalen, tocopherol, campesterol, butyrolacton… nên vẫn cần nghiên cứu phương pháp chiết tách các hợp chất tiềm năng đồng thời thử hoạt tính sinh học của các chất tách được để có cái nhìn tổng thể về hóa thực vật cũng như hoạt tính sinh học của hạt cam thảo dây, góp phần làm tăng giá trị sử dụng cũng như chữa bệnh của hạt cam thảo dây trong các bài thuốc dân gian [10]

Năm 2012, Mạc Thị Phước Hải đã nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết ethanol của hạt cam thảo dây và xác định có 15 hợp chất Trong đó có 4 hợp chất đã xác định được cấu trúc chiếm 9,26% gồm 3-metyl quinol, γ- tocopherol, stigmasterol, γ- sitosterol [7]

1.3.4.Tác dụng sinh học

Theo các công bố trên thế giới, cam thảo dây có tác dụng điều trị sốt rét [52], miễn dịch [72], [73], [84], kháng vi khuẩn, kháng nấm, gây độc khối u [21], [82], [68], giảm đau, chống viêm [38], [83], chống co thắt [75], điều trị tiểu đường [59,60], hỗ trợ cải thiện trí nhớ [89], chống đau nửa đầu [71], tim mạch [27], chống

dị ứng [65], bao gồm cả điều trị viêm, loét, vết thương, vết trầy xước cổ họng và lở

tương lai [15], [66]

Năm 2013, tác giả Khadse sàng lọc sơ bộ tác dụng chống viêm in vitro cao

phân đoạn methanol: nước (9: 1) và cao phân đoạn methanol: nước (1: 9) liều 400 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm trên mô hình chuột gây viêm bằng caragennan

(p < 0,001) làm giảm đau trong viêm khớp dạng thấp phụ thuộc vào liều, độc tính

thấp hơn APR và ức chế đáng kể phát triển bệnh viêm khớp qua phân tích hình ảnh

X quang Tác dụng chống viêm của APW tương đương với indomethacin (10 mg/kg/ngày) [54] Từ những kết quả trên, có thể kết luận APW có tác dụng chống viêm mạnh và giảm bớt mức độ của phản ứng viêm, do đó APW có thể được lựa chọn để điều trị lâu dài bệnh viêm mãn tính như loét dạ dày Tuy nhiên cơ chế tác dụng của cam thảo dây chưa rõ ràng, cần được nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ cơ chế chính xác của các cao chiết cam thảo dây [57]

1.3.4.2 Tác dụng kháng khuẩn

10

Cao chiết n-hexan, cloroform, methanol hạt cam thảo dây có tác dụng kháng

10 chủng vi khuẩn: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococus luteus, Lactobacillus fermentum, Klebsilla pneumonia, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa bằng mô hình khuếch tán trên đĩa thạch Hoạt tính kháng

khuẩn của các cao chiết đã được so sánh với streptomycin (10 μg/đĩa) Cao chiết hexan và cloroform thử nghiệm với nồng độ 500, 250, 100, 75, 50, 35, 25 và 12 µg/ml; cao chiết methanol được thử ở nồng độ từ 500µg/ml đến 4µg/ml Kết quả cho thấy, cao chiết methanol kháng khuẩn mạnh hơn so với cao chiết hexan và cloroform Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học chứng minh tác dụng kháng khuẩn dùng trong y học cổ truyền của cam thảo dây Kết quả này có thể là tiền đề cho các định hướng nghiên cứu phát triển thành thuốc từ cam thảo dây để điều trị nhiễm khuẩn gây ra bởi các chủng đa kháng thuốc của các vi khuẩn [13], [12], [22], [32], [69], [70], [90]

1.3.4.3 Tác dụng chống oxy hoá

Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật đặc biệt là polyphenol và flavonoid gần đây đã thu hút sự chú ý bởi các tác dụng chống ung thư, đái tháo đường, kháng khuẩn, bảo vệ thần kinh và bảo vệ tim mạch, chống lão hóa…[41], [53], [75], [77] Hàm lượng phenolic tổng số trong cao chiết lá cam thảo dây được định lượng theo phương pháp Folin-Ciocalteu Hàm lượng phenolic tổng số khác nhau khi chiết xuất lá cam thảo dây bằng các dung môi khác nhau Các kết quả chỉ

ra rằng cao chiết nước lá cam thảo dây có hàm lượng phenolic là 25,48 ± 0,62 mg

GAE/g tính theo dược liệu khô tuyệt đối Cao chiết ethanol và n-hexan có giá trị

thấp hơn so với cao chiết nước; lần lượt là 7,44 ± 0,10 mg GAE/g và 1,65 ± 0,22

mg GAE/g tính theo dược liệu khô tuyệt đối Cao chiết nước lá cam thảo dây cũng chứa lượng đáng kể các hợp chất flavonoid Hàm lượng flavonoid tổng số tính theo quercetin của cao nước và cao ethylacetat lần lượt là 6,20 ± 0,41 và 17,16 ± 1,04 mg/g tính theo dược liệu khô tuyệt đối

1.3.5 Bộ phận dùng

11

Cam thảo dây có bộ phận dùng là thân, rễ và lá; thu hái tốt nhất vào lúc mới

ra hoa, thái ngắn, phơi khô Hạt chín, phơi khô, đôi khi cũng được dùng [2], [4], [5], [6]

và được sử dụng trong các bệnh khác nhau để chữa bệnh đau đầu, bị rắn cắn, ung thư, lạnh, đau bụng, viêm kết mạc, co giật, ho, tiêu chảy, sốt, viêm dạ dày, bệnh lậu, bệnh vàng da, sốt rét, viêm mắt, bệnh thấp khớp, tiểu đường và viêm thận mãn tính [2], [5], [6], [24], [29], [36]

1.3.7 Độc tính

Theo tài liệu công bố, hạt cam thảo dây có abrin là thành phần gây độc tính Abrin (15) là một indol alkaloid có độc tính cao dạng bột màu trắng vàng, công thức phân tử C12H14N2O2 [5], [6], [8]

mg thể hiện liều gây độc mạnh [7] LD50 của cam thảo dây trắng và đỏ được xác định lần lượt là 6400 mg/kg và 2500 mg/kg, không gây tử vong sau 72 h [57]

Liều ngộ độc

Với liều 0.5 mg abrin đã gây tử vong cho người trưởng thành Mức độ nghiêm trọng của ngộ độc abrin tùy thuộc vào cách thức tiếp xúc [7], [10]

Triệu chứng:

Nếu đem hạt giã nhỏ, hòa với nước uống sẽ bị ngộ độc với triệu chứng biếng

ăn, ăn mất ngon, mệt mỏi, đau đầu dữ dội, huyết áp hạ, mất thăng bằng cơ thể, chân tay run rẩy, nôn mửa, tiêu chảy Thời kỳ tiền ngộ độc kéo dài ít nhất vài giờ trước khi xuất hiện triệu chứng ngộ độc Nước ngâm hạt cam thảo dây bôi vào chỗ da bị xước sẽ gây loét tại chỗ, nhỏ vào mắt sẽ gây phù tấy kết mạc dẫn đến hỏng giác mạc Hạt cam thảo dây được một số dân tộc vùng Tây Ấn Độ dùng đầu độc [7], [10]

Điều trị khi bị ngộ độc abrin

Khi bị ngộ độc hạt cam thảo dây có các triệu chứng như nôn mửa, viêm dạ dày, tiểu trường, co giật, xuất huyết nhiều, giảm huyết áp, dùng 50-60 g cam thảo bắc sắc uống, hoặc hòa thêm bột đậu xanh nghiền sống, uống càng nhiều càng [6]

Sử dụng thuốc bismuth trisilicat giảm mức độ ảnh hưởng đến đường tiêu hóa Nếu

Định nghĩa viêm: Viêm là một đáp ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước

sự tấn công của một tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn) Đây là một đáp ứng miễn dịch tự nhiên Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ

và đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu đến nơi tổn thương Các bạch cầu cũng theo mạch máu xâm nhập vào mô, tiết các chất prostaglandin, cytokin nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn thương Viêm có thể được phân ra thành viêm cấp tính hoặc mãn tính Viêm cấp tính là phản ứng ban đầu của cơ thể đối với tác nhân kích thích có hại và có thể đạt được bởi sự chuyển động tăng của huyết tương và bạch cầu đến các mô tổn thương Một chuỗi các hoạt động sinh hóa truyền đi và chuyển thành đáp ứng viêm, liên quan đến hệ thống mạch máu, hệ thống miễn dịch, và các tế bào khác nhau trong các mô bị thương Viêm kéo dài, được gọi là viêm mãn tính được đặc trưng bởi sự phá hủy đồng thời bên trong tế bào và ngăn cản quá trình chữa lành các mô bị tổn thương [93]

Cơ chế thuốc chống viêm: Hiện nay, thuốc chống viêm điển hình có 2 nhóm là

thuốc chống viêm không steroid (NSAIDS) và thuốc chống viêm steroid (glucocorticoid) Glucocorticoid ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin làm giảm tổng hợp acid arachidonic, do đó làm giảm tổng hợp leucotrien và prostaglandin vì vậy ức chế phản ứng viêm NSAIDS gắn vào vị trí hoạt động dành cho acid arachidonic trên COX gây ức chế enzym COX làm cho acid arachadonic không chuyển hoá thành prostaglandin-chất trung gian hoá học gây viêm nên NSAIDS ức chế phản ứng viêm Các thuốc này có nhiều tác dụng không mong muốn, gây viêm loét đường tiêu hóa, ảnh hưởng quá trình đông máu, xốp xương…gây nguy hiểm cho các bệnh nhân đặc biệt là các bệnh nhân viêm mạn tính

14

Ức chế COX-2 và bệnh ung thư: Thuốc NSAIDS ức chế chọn lọc COX-2 đang

được quan tâm sử dụng do hạn chế tác dụng không mong muốn trên vì COX-2 là một hình thức cảm ứng được gây ra bởi gen gây ung thư, yếu tố tăng trưởng, các cytokin, nội độc tố hoặc este phorbol [19], [39], [40], trong khi đó COX-1 có chức năng như một gen quản gia và được cấu thành trong hầu hết các mô của con người

Sự biểu hiện quá mức của COX-2 đã được chứng minh là có liên quan đến viêm mãn tính, các vấn đề của hệ mạch và ung thư [39], [40], [85] Gần đây theo nhiều tài liệu công bố, bệnh viêm mãn tính có liên quan đến bệnh ung thư Sự biểu hiện quá mức của COX-2 không thể phát hiện được ở đại tràng bình thường nhưng tăng đến 40% ở các bệnh nhân bị ung thư khác và 85% ở ung thư đại trực tràng Sự tăng quá mức enzym COX-2 cảnh báo tuổi thọ ngắn đối với bệnh nhân ung thư đại trực tràng Phát hiện này cho thấy các thuốc ức chế đặc hiệu trên COX-2 vừa có tác dụng giảm đau chống viêm và giảm nhiều các tác dụng không mong muốn như viêm loét đường tiêu hóa, ảnh hưởng quá trình đông máu, xốp xương…, trong tương lai, chúng có thể phát triển thành thuốc ngăn ngừa điều trị ung thư [31]

Cho đến nay, cơ chế chống viêm của cam thảo dây vẫn chưa được rõ ràng [15], [33], [48] Năm 2007, M Sudaroli và cộng sự đã làm sáng tỏ hơn cơ chế chống viêm của hạt cam thảo dây: hạt cam thảo dây dây ức chế chọn lọc con đường COX-2 hoặc LOX (Lipoxygenase) và ức chế giải phóng yếu tố trung gian gây viêm leukotrien từ acid arachidonic [57] Để làm sáng tỏ hơn nữa cơ chế chống viêm của cam thảo dây, và theo một số tài liệu công bố về mô hình thử nghiệm trên COX-2 [56], nhóm nghiên cứu chọn mô hình thử nghiệm trên đích tác dụng COX-2 và đã đánh giá sự ảnh hưởng của cao chiết tổng, cao phân đoạn và trên sự ức chế COX-2

ở tế bào ung thư vú MCF7gây kích thích viêm bởi lipopolysaccarid

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là thân loài Abrus sp thu tại Trung tâm

nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ - phố Thành Trọng, phường Quảng Thành, thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hoá Nguyên liệu sau khi thu hái được tách riêng

lá, thân Thân cây được rửa sạch, thái mỏng sau đó sấy ở 50°C tới khô, bảo quản trong túi PE và bao bì kín

2.1.2 Hóa chất, dung môi

+ Hóa chất nghiên cứu thực vật:

Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: javen, acid acetic, xanh methylen,

đỏ son phèn và nước cất

+ Hóa chất nghiên cứu thành phần hóa học:

- Dung môi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nước cất, Pb(CH3COO)2

30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling

B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussiat 0,5%, Na2SO4 khan, tinh thể

Na2CO3, bột magie kim loại, (CH3CO)2O, dung dịch gelatin 1%, CHCl3, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5%) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

- Dung môi hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập (EtOH 96%, n-hexan

(Hx), ethyl acetat (EtOAc), đạt tiêu chuẩn công nghiệp Ngoài ra, các dung môi như ethanol, n-hexan, ethyl acetat, acetonitril dùng trong sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao đều đạt tiêu chuẩn của hóa chất phân tích

- Silica gel sử dụng trong tách chiết là loại Merck cỡ hạt 63−200 μm Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien cũng sử dụng của công ty Merck loại số 60 F254 và RP-18 F254 Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch vanilin, dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH 96%

hơ nóng để phát hiện vết chất

16

+ Hóa chất và nguyên liệu nghiên cứu tác dụng sinh học:

+ Mẫu thử: Các mẫu chế phẩm được chiết và phân lập từ thân loài Abrus sp

- Mẫu 1: Cao cồn 96% thân cam thảo dây

- Mẫu 2: Cao phân đoạn n- hexan của cao cồn 96% thân loài Abrus sp

- Mẫu 3: Cao phân đoạn ethyl acetat của cao cồn 96% thân loài Abrus sp

- Mẫu 4: Cao phân đoạn nước của cao cồn 96% thân loài Abrus sp

+ Chất gây viêm: lipopolysaccharid (LPS) mua từ hãng Sigma (St Louis, MO)

+ Tế bào ung thư vú MCF7 được đặt mua từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD)

- Kháng thể β-actin được mua từ Sigma (St.Louis, MO)

- Huyết thanh bò được muatừ Gibco BRL (Grand Island, NY)

- COX-2 mua từ Viện công nghệ sinh học Santa Cruz (Santa Cruz., CA)

- Kháng sinh penicillin, streptomycin (100 µg/ml), NaCl, Tris, NP40 mua hãng Sigma (St Louis, MO)

- Kháng thể ngựa thứ cấp peroxidase-liên hợp (Beverly, MA)

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Kính hiển vi, kính lúp soi nổi

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA60

- Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Memmert, tủ sấy FD115, Máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), Máy siêu âm Power sonic 405, cột thủy tinh các loại

Binder Máy UVBinder VIS 1800 dải đo 190nmBinder 800nm, hãng Shimadzu, Nhật Bản

- Máy đo độ nóng chảy Kofler micro-hotstage

- Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap, Mỹ

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer,

Mỹ với chất chuẩn nội là TMS

17

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10tvp, detector diod array SPD-M10Avp, Nhật Bản

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu dựa trên quan sát và mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích, nghiên cứu đặc điểm hiển vi: làm

vi phẫu các bộ phận của cây theo phương pháp cắt ngang, nhuộm kép Soi bột dược liệu, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi [3]

- Giám định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu đặc điểm hình thái với khóa phân loại thực vật, các bộ thực vật chí và đối chiếu với các mẫu tiêu bản được lưu trữ tại phòng Tiêu Bản - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược

Hà Nội

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ

Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong thân loài Abrus sp bằng các phản

ứng hóa học đặc trưng [5]

- Chuẩn bị dịch chiết ethanol: Cho 20 g dược liệu vào bình nón dung tích 100

ml, thêm 50 ml EtOH 700, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng

- Chuẩn bị dịch chiết n-hexan: Cho 10 g dược liệu vào bình nón dung tích 50

ml, đổ ngập n-hexan, ngâm qua đêm, lọc Dịch lọc dùng để làm các phản ứng

- Chuẩn bị dịch chiết nước: 20 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng

Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm dung dịch H2SO4 2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4

mỏ dung tích 250 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với CHCl3: MeOH (4:1) mỗi lần 8 ml Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc cỏ mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann-Burchardt: cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Quan sát hiện tượng và kết luận

- Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 80% Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, quan sát hiện tượng và kết luận

- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 80% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, quan sát hiện tượng và kết luận

Định tính anthranoid

19

Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 10 ml dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút

Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml hexan Lấy 1 ml dịch

n-hexan cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, lắc kỹ, quan sát màu của lớp KOH và kết luận

Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin: cho 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 − 5 giọt) Để yên một vài phút, quan sát màu của dung dịch và kết luận

- Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt NaOH 10%, quan sát xem có kết tủa hay không, sau đó thêm nước, quan sát màu của dung dịch

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol Thêm vào 2 − 3 giọt dd FeCl3, quan sát màu của dung dịch và kết luận

- Phản ứng với thuốc thử diazo: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol, thêm

vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo, quan sát và mô tả hiện tượng

Định tính saponin

- Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to sạch 2 ml dịch chiết nước, thêm 10

ml nước cất Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống nghiệm, để yên, quan sát thấy bọt bền sau 10 phút

20

- Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết ethanol cho vào bình nón và thêm 10

ml H2SO4 loãng Đun sôi cách thủy vài phút Để nguội, chiết với cloroform Lấy khoảng 2 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, quan sát hiện tượng và kết luận

- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết cloroform ở trên cho vào

1ống nghiệm rồi cô tới cắn Cho vào cắn 0,5 ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 450 rồi thêm 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng trong ống nghiệm và nhận xét

Định tính tannin

Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau:

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm dịch chiết 2 − 3 giọt dung dịch FeCl3 5%, quan sát hiện tượng và kết luận

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2 − 3 giọt dung dịch gelatin 1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết, quan sát hiện tượng và kết luận

- Phản ứng với chì acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết thân loài Abrus sp 2 −

3 giọt dung dịch chì acetat 10%, quan sát hiện tượng và kết luận

- Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết thân loài Abrus

sp. 2 − 3 giọt đồng acetat, quan sát hiện tượng và kết luận

Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước thân loài Abrus sp một ít tinh thể

Na2CO3, quan sát hiện tượng và kết luận

Định tính acid amin

Lấy 2 ml dịch chiết nước thân loài Abrus sp vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2

– 3 ml giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút, quan sát hiện tượng

và kết luận

Định tính đường khử

Lấy 2 ml dịch chiết nước thân loài Abrus sp., thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling

A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút, quan sát hiện tượng và kết luận

21

Định tính polysaccharid

Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống:

Ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 4 ml dịch chiết thân loài Abrus sp và 5 giọt thuốc thử Lugol, quan sát

hiện tượng và kết luận

Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi,

quan sát hiện tượng và kết luận

Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi dung môi đến khô Thêm

vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 450 nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Quan sát giữa 2 lớp chất lỏng và kết luận

Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi cách thủy đến cắn,

thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, quan sát hiện tượng và kết luận

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hợp chất trong thân loài Abrus sp ở Thanh Hoá

- Phương pháp chiết xuất: Dược liệu được chiết dưới áp suất giảm với dung môi ethanol 96 % trong thời gian 3h x 3 lần; tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1:10 sử dụng máy cất quay Buchi công nghiệp Rotavapor® R-250; phân đoạn bằng dung môi

công nghiệp theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan, ethyl acetat và phần nước

22

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro

Cơ chế: Chiết xuất protein từ tế bào ung thư vú MCF7, sau đó protein chạy trên

bản gel, nếu vết protein COX-2 các mẫu thử nhạt hơn với vết protein COX-2 của lipopolysaccarid gây kích thích viêm thì kết luận mẫu thử có tác dụng ức chế COX-

2 Vết protein β- actin là gen đối chứng, không bị ảnh hưởng bởi các chất, đánh giá

độ ổn định của phương pháp thử

Chuẩn bị mẫu để thử nghiệm:

+ Mẫu thử: Các mẫu cao, các hợp chất phân lập được pha trong dimethyl sulfoxid (DMSO)

+ Mẫu đối chứng dương: LPS dùng trong các thí nghiệm pha với DMSO + Mẫu chứng chuẩn: không có LPS và phân đoạn

Tiến hành:

Bước 1: Nuôi cấy tế bào

Tế bào ung thư vú MCF7 nuôi cấy ở đĩa 6 giếng ở 37°C, 5% CO2 trong môi trường có chứa 10% huyết thanh bào thanh bò (FBS), 1% kháng sinh penicillin (100 units/ml) và streptomycin (100 µg/ml) Đối với tất cả các thí nghiệm, các tế bào được nuôi đến mật độ 80% -90% và chịu không quá 20 lần phân chia tế bào Bước 2: Thử nghiệm

Phương pháp thử được tiến hành theo phương pháp phân tích Western blot dựa

trên mô hình nghiên cứu của Min-Jin Kim và các cộng sự [56] được trình bày ở hình 1.4:

Các mẫu đối chứng chuẩn,

mẫu đối chứng dương,

Chuyển sang màng nitrocellulose

Ủ với COX-2 hoặc -actin (kháng thể chuột)

Ủ với kháng thể ngựa thứ cấp peroxidase-liên hợp

Đun sôi Điện di

24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.Thực vật

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học loài Abrus

Căn cứ vào mẫu nghiên cứu, có sự so sánh, đối chiếu với khóa phân loại và bản

mô tả trong các tài liệu tham khảo [5], [6], [11], [13], [43], [64], [80] cùng với sự giúp đỡ của Ths Nghiêm Đức Trọng (Bộ môn Thực Vật- Trường Đại học Dược Hà

Nội), chúng tôi đã giám định được tên khoa học của loài Abrus sp như sau:

Tên khoa học: Abrus precatorius L

Tên tiếng Việt phổ thông: Cam thảo dây

Họ thực vật: Họ Đậu (Fabaceae)………

25

Hình 3.1: Cây cam thảo dây chụp ở Thanh Hóa

Hình 3.2: Mẫu cam thảo dây thu tại Thanh Hóa

Hình 3.3: Hạt và lá cam thảo dây thu tại Thanh Hóa

26

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu cây cam thảo dây

3.1.2.1 Vi phẫu thân cam thảo dây

Vi phẫu thân hình tròn Biểu bì gồm một lớp tế bào sống hình chữ nhật, vách hóa cutin dày Mô mềm vỏ cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào hình đa giác xếp lộn xộn, ở giữa có khoảng gian bào Sợi cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào có khoang tế bào hẹp, vách dày hoá gỗ Bó libe gỗ xếp thành vòng tròn đầy đủ, libe ở phía ngoài, gỗ

ở phía trong ở hình 3.4

Hình 3.4 Vi phẫu thân cam thảo dây (Kính hiển vi sinh học Leica) 1- Biểu bì; 2- Mô mềm vỏ; 3- Sợi, 4- Libe; 5- Gỗ; 6- Mô mềm ruột

3.1.2.2 Vi phẫu lá cam thảo dây

Gân giữa lồi lên ở cả hai mặt, ngoài cùng là hai lớp biểu bì trên và dưới cấu tạo bởi những tế bào kéo dài theo chiều dọc của gân giữa Dưới biểu bì có một lớp mô dày cấu tạo bởi những tế bào có vách dày bằng celulose làm nhiệm vụ nâng đỡ Xung quanh bó libe gỗ có vòng mô cứng làm cho gân giữa thêm cứng rắn Các bó libe gỗ xếp thành hình cung ở hình 3.5

27

Hình 3.5: Vi phẫu lá cam thảo dây

1- Biểu bì trên; 2- Mô dày trên; 3- Sợi; 4- Gỗ, 5-Libe; 6- Mô dày dưới; 7- Biểu

Hình 3.6: Đặc điểm bột thân cam thảo dây

(Kính hiển vi sinh học Leica, độ phóng đại 400) 1- Lông che chở; 2- mảnh mô mềm; 3- Sợi; 4- Mảnh mạch điểm

Hình 3.7 Đặc điểm bột lá cây cam thảo dây

(Kính hiển vi sinh học Leica, độ phóng đại 400) 1,2- Biểu bì mang lỗ khí; 3- Sợi; 4- Lông che chở; 5,6- Mạch xoắn

3.2 Hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân cam thảo dây

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của thân cam thảo dây cho thấy sự

có mặt của các nhóm chất flavonoid, saponin, tanin, acid amin, đường khử và sterol thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân cam thảo dây

Phản ứng Liebermann-Burchardat -

5 Coumarin Phản ứng mở và đóng vòng lacton - Không

Ghi chú: (-) : âm tính, (+): dương tính, (++): dương tính rõ

3.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất thân cam thảo dây

3.2.2.1 Chiết xuất

6,2 kg dược liệu khô thân cam thảo dây được chiết hồi lưu với ethanol 96% (3 lần, mỗi lần 3 giờ) Lọc, gộp dịch chiết và cô dưới áp suất giảm đến cao đặc (434,99 g) Cao đặc được hòa trong nước và lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

+ Định tính phân đoạn n-hexan bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Mục đích: Khảo sát sắc ký lớp mỏng với một số hệ dung môi khác nhau để

lựa chọn hệ dung môi thích hợp cho quá trình phân lập các chất bằng sắc kí cột

- Tiến hành: Hòa tan lượng nhỏ cắn của phân đoạn hexan trong 1ml

n-hexan Tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng với bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254

(Merck) đã hoạt hóa

Tiến hành khảo sát với các hệ dung môi sau:

H1: n-hexan - EtOAc = 5: 1

H2: CHCl3 - MeOH = 10: 1

Kết quả: Hệ H1 tách được nhiều vết nhất, các vết tách nhau rõ ràng thể hiện qua bản mỏng hình 3.9

6,2 kg dược liệu khô

 Chiết hồi lưu với EtOH 96%

(3 lần, mỗi lần 3 giờ)

 Lọc, gộp dịch chiết

 Cô dưới áp suất giảm

434, 99 g cao cồn

 Hòa tan với nước

 Lắc lần lượt với n- hexan, ethyl acetat

 Thu hồi dung môi

150,53 g cao nước

80 g cao n-hexan 171,53 g cao ethyl acetat