Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm di truyền và thành phần hóa học của các giống mạch môn ở một số địa phương miền bắc việt nam

NGUYỄN THỊ CẨM VÂN MSV: 1101596 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC GIỐNG MẠCH MÔN Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆ

NGUYỄN THỊ CẨM VÂN

MSV: 1101596

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC GIỐNG MẠCH MÔN Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

NGUYỄN THỊ CẨM VÂN

MSV: 1101596

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC GIỐNG MẠCH MÔN Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS TS Trần Văn Ơn

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Thực vật – Trường ĐH Dược Hà Nội

2 Phòng Kiểm nghiệm Mỹ phẩm – Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

HÀ NỘI - 2016

gia đình, thầy cô và bạn bè

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Trần Văn Ơn, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Th.S Phạm Hà Thanh Tùng, DS Phạm Thị Linh Giang, toàn thể Thầy cô giáo và các chị kĩ thuật viên Bộ môn Thực Vật đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn đến Công ty TNHH MTV Dược Khoa (DKPharma) đã giúp đỡ em trong việc thu thập mẫu, cũng như hỗ trợ các điều kiện

để em có thể hoàn thành khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Phòng Kiểm nghiệm Mỹ phẩm – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã tạo điều kiện giúp đỡ để em hoàn thành khóa luận đúng hạn

Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời gian qua

Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Cẩm Vân

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm của chi Ophiopogon Ker Gawl 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl 2

1.1.2.2 Phân biệt chi Ophiopogon và một số chi khác về đặc điểm hình thái và giải phẫu 3

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và phân bố 5

1.1.4 Tác dụng dược lý và công dụng của Mạch môn 5

1.1.4.1 Tác dụng dược lý 6

1.1.4.2 Công dụng 6

1.1.5 Đa dạng về di truyền 7

1.2 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl và Ophiopogonin D 8

1.2.1 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl 8

1.2.2 Tổng quan về Ophiopogonin D 11

1.2.2.1 Đặc tính lý hóa 11

1.2.2.2 Tác dụng 11

1.2.2.3 Hàm lượng của Ophiopogonin D trong củ Mạch môn 12

1.3 Phương pháp HPLC – ELSD 12

1.3.1 Nguyên tắc hoạt động 12

1.3.2 Ưu – nhược điểm của detector ELSD 13

1.4 Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding) và trình tự di truyền đoạn ADN Ribosom nhân cùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của Mạch môn 14

1.4.1 Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding) 14

1.4.2 Trình tự di truyền đoạn ADN ribosom nhân vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của cây Mạch môn 14

2.1.2 Dung môi, hóa chất 16

2.1.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 16

2.1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 17

2.1.2.3 Nghiên cứu trình tự rADN vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 17

2.1.3 Máy móc, thiết bị 17

2.1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi phẫu 17

2.1.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 17

2.1.3.3 Nghiên cứu đặc điểm di truyền 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 18

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và giải phẫu 18

2.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 18

2.2.3.1 So sánh vân tay sắc ký lớp mỏng của các mẫu củ Mạch môn 18

2.2.3.2 So sánh hàm lượng Ophiopogonin D trong các mẫu củ Mạch môn bằng phương pháp HPLC – ELSD 19

2.2.4 Nghiên cứu trình tự di truyền 22

2.2.4.1 Tách chiết ADN toàn phần 22

2.2.4.2 Khuếch đại ADN (PCR) 23

2.2.4.3 Điện di ADN trên bản gel agarose 1% 24

2.2.4.4 Giải trình tự ADN 24

2.2.4.5 So sánh trình tự ADN 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Đặc điểm thực vật của các mẫu Mạch môn 25

3.1.1 Đặc điểm hình thái 25

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu M1 25

3.1.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu M2 – M6 26

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu 27

3.2 Đặc điểm vân tay sắc ký lớp mỏng của các mẫu Mạch môn 29

3.3 Định lượng Ophiopogonin D trong các mẫu Mạch môn 29

3.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 32

3.3.2.1 Đánh giá tính thích hợp của hệ thống 32

3.3.2.2 Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp 32

3.3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 33

3.3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) của phương pháp 33

3.3.2.5 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 34

3.3.2.6 Đánh giá độ đúng của phương pháp 35

3.3.3 Định lượng Ophiopogonin D trong các mẫu Mạch môn 35

3.4 So sánh trình tự ADN vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 36

3.4.2 Khuếch đại ADN (PCR) 36

3.4.3 Giải và so sánh trình tự ADN 37

3.5 Bàn luận 38

3.5.1 Về đặc điểm thực vật 38

3.5.1.1 Về đặc điểm hình thái 38

3.5.1.2 Về vi phẫu lá, rễ 41

3.5.2 Về đa dạng di truyền vùng IST1 – 5.8S – ITS2 41

3.5.3 Về thành phần hóa học 42

3.5.3.1 Vân tay sắc ký lớp mỏng 42

3.5.3.2 Hàm lượng Ophiopogonin D 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AOAC Association of Official Analytical

Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

BOLD Barcode of Life Database

dNTP Deoxyribonucleotide triphotphates

EDTA Ethylenendiaminetetraacetic acid

ELSD Evaporative Light Scattering Detector Detector tán xạ bay hơi

ER Endoplasmic – reticulum Mạng lưới nội chất

ERK Extracellular signal – regulated kinase

HPLC High performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial

Cells

Tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người

ICH International Conference on

Harmonization

Hội đồng hòa hợp quốc tế ITS Internal transcribed spacer Vùng phiên mã nội

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

NF – κB Nuclear Factor – kappa B Yếu Tố Nhân kappa B

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen

rbcL Ribulose bisphosphate carboxylase ADN lục lạp

RSD Relative standard devition Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin layer chomatography Sắc ký lớp mỏng

USFDA Food and Drug Administration Cục quản lý thuốc và thực

phẩm Hoa Kỳ

Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt Liriope và Ophiopogon theo Guy L Nesom 4 Bảng 1.3 Một số flavonoid có trong rễ củ Ophiopogon japonicus 9 Bảng 1.4 Một số saponin có trong rễ củ Ophiopogon japonicus 10 Bảng 2.1 Ký hiệu, nguồn gốc và mã số tiêu bản của các mẫu nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR 23 Bảng 3.1 Đặc điểm khác biệt của các mẫu từ M2 – M6 27 Bảng 3.2 Đặc điểm sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của các mẫu 29 Bảng 3.3 Khảo sát các chương trình của pha động 31

Bảng 3.5 Đánh giá tính thích hợp của hệ thống 32 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc vào diện tích pic sắc ký vao nồng độ Ophiopogonin D 33 Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 34 Bảng 3.8 Độ lặp lại của phương pháp trên mẫu M3 34 Bảng 3.9 Độ thu hồi chuẩn trong quá trình phân tích 35 Bảng 3.10 Kết quả đo nồng độ Ophiopogonin D trong các mẫu 36 Bảng 3.11 Khảo sát thành phần tham gia phản ứng khuếch đại ADN của M1 37 Bảng 3.12 Mã số lưu trữ trên Genbank của các mẫu nghiên cứu 37 Bảng 3.13 Đặc điểm phân biệt loài Liriope gramifolia và Liriope spicata 39 Bảng 3.14 Đặc điểm phân biệt O longifolius và O japonicus 39

Hình 1.1 Ophiopogonin D 11

Hình 1.3 Cấu trúc của vùng rADN – ITS và các mồi thường sử dụng 15

Hình 3.5 Kết quả sắc ký quan sát ở bước sóng 254 29 Hình 3.6 Sắc ký đồ biểu diễn độ đặc hiệu của phương pháp 32 Hình 3.7 Tương quan giữa nồng độ Ophiopogonin D và diện tích pic 33 Hình 3.8 Sắc ký đồ của mẫu M3 khi pha loãng bốn lần 34

Hình 3.13 Đặc điểm thân rễ của hai loài O longifolius và O japonicus 39

Hình 3.14 Tiêu bản loài Liriope graminifolia 40

Hình 3.15 Tiêu bản loài Ophiopogon longifolius 40 Hình 3.16 So sánh trình tự ADN vùng IST1 – 5.8S – ITS2 của các mẫu 41

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, ở một số tỉnh trung du, miền núi phía Bắc, cây Mạch môn được người dân xem là cây trồng đa mục đích, có thể trồng xen dưới tán các loại cây trồng lâu năm để bảo vệ và cải tạo đất, làm cảnh và cho thu nhập cao Củ Mạch môn là vị thuốc chính trong nhiều bài thuốc cổ truyền của Việt Nam và Trung Quốc, thường được sử dụng để chữa ho khan, viêm họng, lao phổi, thổ huyết, chảy máu cam, hen phế quản, khó ngủ, trong các bệnh về tim mạch, cao huyết áp, xơ vữa động mạch,…[2], [5], [8], [47]

Trong quá trình trồng và sử dụng Mạch môn, người ta thấy có sự tương đồng

về hình thái của thân, lá hoặc củ của cây Mạch môn với một số loài thuộc chi

khác như Liriope, Peliosanthes, Aspidistra Việc này dẫn đến việc rất nhiều loài

khác nhau được dân gian trồng với tên gọi “Mạch môn” cũng như trên thị trường cũng xuất hiện nhiều loại củ với tên gọi chung là “Mạch môn” Một vấn đề được đặt ra là cần phân biệt được các mẫu Mạch môn được trồng trong cộng đồng về đặc điểm thực vật, đặc điểm di truyền, thành phần hóa học cũng như chất lượng của chúng

Từ lý do trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm di truyền và thành phần hóa học của các giống Mạch môn ở một số địa phương miền Bắc Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Phân biệt các loại Mạch môn dựa trên đặc điểm thực vật, trình tự di truyền

và vân tay sắc ký lớp mỏng

2 Xác định hàm lượng Ophiopogonin D trong củ của các mẫu Mạch môn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm của chi Ophiopogon Ker Gawl

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật bậc cao của Takhtajan A.L (1996), vị trí

của chi Ophiopogon Ker Gawl trong hệ thống phân loại được sắp xếp như sau:

28 thứ [63] Ở Việt Nam, chi Ophiopogon đã được mô tả trong Thực vật chí Việt Nam, tập 8 bao gồm 15 loài, 1 thứ và 1 dạng [3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl

Theo tác giả Nguyễn Thị Đỏ (2007) [3], chi Ophiopogon có các đặc điểm

thực vật như sau: Cây cỏ nhiều năm Thân rễ mập hay mảnh, mọc trườn và có thể phân nhánh Rễ chùm dạng sợi, đôi khi rễ chùm nổi lên mặt đất thành rễ chống, có lông phủ hoặc không Thân trên mặt đất mọc đơn độc hoặc mọc thành cụm, có đốt hoặc không Lá mọc tập trung ở ngọn Lá có cuống hoặc không; phiến lá hình dải, hình mũi giáo, hình trứng hoặc hình tim, chất dai, mỏng Hoa mọc đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa chùm, bông, mọc ở đầu cành hoặc nách lá Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính Bao hoa 6 hoặc 4 mảnh, một số ít có 9 mảnh, rời hoặc phần dưới dính nhau thành ống, hình chuông, phần trên có 6 thùy, xếp 2 vòng, bằng nhau hoặc gần bằng nhau Nhị 6, một số ít 4 hoặc 8 đính ở gốc mảnh bao hoa hoặc trên vòng tràng phụ hoặc trên họng ống bao hoa, thò ra ngoài hoặc

ẩn trong bao hoa; chỉ nhị rời, dạng sợi hoặc dạng bản dính liền nhau thành một vòng; trung đới không kéo dài hoặc kéo dài thành dạng mào; bao phấn đính gốc hoặc đính lưng, 2 ô, hướng trong, mở dọc Bầu trên hoặc bầu giữa, 3 hoặc 4 ô, mỗi ô có 2 hay nhiều noãn; vòi nhụy dạng cột hoặc sợi, mảnh, một số ít gần như không có; núm nhụy dạng đầu, đĩa hoặc chia 3 thùy Quả mọng, vỏ quả dai, một

số nứt trước khi chín để lộ hạt ra ngoài Hạt 1 hoặc nhiều, một số ít mọng nước, hình cầu, hình trứng, nội nhũ to, phôi nhỏ hơn

1.1.2.2 Phân biệt chi Ophiopogon và một số chi khác về đặc điểm hình thái và giải phẫu

 Sự khác biệt về đặc điểm hình thái

Tác giả Nguyễn Thị Đỏ trong Thực vật chí Việt Nam đã chỉ ra rằng nhiều

loài trong chi này có hình dạng bên ngoài rất dễ nhầm với một số loài trong chi

Aspidistra, Liriope, Peliosanthes nếu mẫu không có hoa [3] Đặc biệt, sự tương đồng về hình thái của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes đã được rất

nhiều tác giả bàn luận, thậm chí có những tác giả còn cho ý kiến về việc gộp ba chi này thành một chi [22], [25], [44], [56] Các đặc điểm của ba chi được tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc điểm của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes

Đặc

điểm

Rễ Các loài trong cả ba chi đều có thân rễ ngắn, dày với các sợi, đôi

khi mọng nước

Lá Thường hẹp, có khi giống như cỏ; tuy

nhiên với lá của loài O dracaenoides

có thể rộng đến 50 mm

Chiều rộng khoảng 8 – 60

mm, có thể lên tới 85 mm,

có hình mũi giáo

Hoa Hoa rủ xuống,

bao hoa rời,

bầu giữa, chỉ

nhị tự do

thẳng đứng, hướng lên trên, bao hoa rời, bầu trên, chỉ nhị

tự do

Hoa hướng lên trên hoặc uốn ngược lại, bao hoa dính nhau, bầu giữa, chị nhị dính nhau thành hình chuông

Các đặc điểm về hình thái ít có sự khác biệt giữa Liriope và Ophiopogon

Một số loài có sự tương đồng về hình thái giữa hai chi và dẫn đến sự tranh cãi của các nhà khoa học khi đưa các loài này vào hệ thống phân loại thực vật

Maximowicz đã gộp cả hai chi Liriope và Ophiopogon lại thành Ophiopogon,

tuy nhiên, ý kiến này không được đông đảo các tác giả đồng thuận [30] Bailey khi bàn luận về lịch sử của hệ thống phân loại của các chi đã cho rằng không có

sự chắc chắn về sự tồn tại riêng biệt giữa hai chi này [12] Guy L Nesom đã dựa vào đặc điểm của hoa và quả để phân biệt hai chi này [35] Những đặc điểm này được trình bày cụ thể trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt Liriope và Ophiopogon theo Guy L Nesom

Hoa thẳng đứng, nằm ở phần

cuối cùng của cuống hoa, tràng

hoa xếp xen kẽ; bầu trên; bao

phấn tự do, thuôn dài, đỉnh tù, nứt

ở đỉnh, chỉ nhị dài hơn hoặc bao

phấn; đầu nhụy liền thành một

khối; quả màu đen

Hoa rũ xuống, trên một cuống hoa/ống hoa uốn ngược, tràng hoa hình chuông; bầu dưới hoặc bầu giữa; bao phấn đồng sinh, hình mũi mác hẹp, đỉnh nhọn và hẹp, nứt dọc, chỉ nhị ngắn hơn nhiều so với bao phấn; đầu nhụy chia làm 3 thùy; quả thường màu xanh, đen

Ở Việt Nam, tác giả Nguyễn Thị Đỏ đã phân biệt hai chi này dựa vào đặc

điểm của bầu và chỉ nhị, trong đó Liriope có chỉ nhị dài hơn hoặc bằng bao phấn

và bầu trên còn Ophiopogon thì chỉ nhị ngắn hơn bao phấn nhiều và bầu giữa

[3]

 Sự khác biệt về đặc điểm giải phẫu

Về đặc điểm giải phẫu của các bộ phận của các loài của các chi này cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu, tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào nghiên cứu đầy đủ cho tất cả các loài của các chi trên [16], [17] Các kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt giữa các chi về đặc điểm của các lỗ khí trên bề mặt lá, hình thái và hướng quay của các bó libe – gỗ trong vi phẫu lá

Năm 1992, Cutler đã nghiên cứu so sánh về đặc điểm thực vật, giải phẫu lá giữa ba chi trên [16] Ông cũng đồng ý quan điểm với Jessop [22] về sự khác biệt của 3 chi về sự phân phối các tế bào lỗ khí và sự xuất hiện các nhú xung quanh lỗ khí ở biểu bì dưới của lá: các tế bào lỗ khí có mật độ dày đặc, có các

nhú xung quanh đối với Ophiopogon và Liriope; còn với Peliosanthes thì mật độ

các tế bào lỗ khí thưa thớt hơn và không có các nhú xung quanh Ông cũng nhận thấy có sự khác biệt về sự định hướng của các bó mạch trong vi phẫu lá của các chi Phần lớn các loài có bó mạch ngoài cùng xoay 90o so với trục, và đỉnh libe

hướng ra biên, trừ các loài thuộc chi Peliosanthes và O latfolius thì góc quay

này khá nhỏ (chỉ lên tới 45o), các bó mạch có đỉnh gỗ hơi hướng về bó mạch bên

cạnh Ở hai chi Ophiopogon và Liriope, các bó mạch có kích thước lớn, và có sự quay về phía trục của các cực gỗ trong các bó mạch, trong khi ở chi Peliosanthes

lại có một bó mạch nhỏ ở dưới biểu bì, có cấu trúc xoay ngược lại với các bó mạch khác

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Cây mọc riêng lẻ hay thành từng bụi trên đất ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nơi ẩm và bóng, thường mọc dưới tán rừng kín, rừng tre nứa, trên núi đất hoặc núi đá granit ở độ cao 800 – 1300 mét so với mặt nước biển Cây ra hoa và quả hàng năm, tái sinh bằng hạt Thời kỳ ra hoa vào khảng tháng 6 – 7, quả tháng 9 –

12 [49]

Chi Ophiopogon có sự phân bố rải rác từ vùng ôn đới ấm đến vùng nhiệt đới

thuộc khu vực Đông Á và Đông Nam Á, trong đó tập trung nhiều ở Đông Nam

Á [3], [10], [13]

Ở Việt Nam, Mạch môn được trồng ở một số nơi để lấy củ làm thuốc như Phùng (Hà Tây), Nghĩa Trai (Hưng Yên), Ninh Hiệp (Hà Nội), Phú Thọ [5] 1.1.4 Tác dụng dược lý và công dụng của Mạch môn

1.1.4.1 Tác dụng dược lý [8]

Thuốc có tác dụng tăng huyết lượng động mạch vành, bảo vệ bệnh thiếu máu cơ tim, cải thiện lực co bóp cơ tim và chống rối loạn nhịp tim, trên thực nghiệm, thuốc còn có tác dụng an thần

Trên thực nghiệm, tiêm bắp cho thỏ nước sắc Mạch môn làm tăng đường huyết, nhưng cũng có báo cáo nói hạ đường huyết

Thuốc có tác dụng ức chế mạnh tụ cầu, trực khuẩn đại trường, trực khuẩn thương hàn

Tác dụng kháng khuẩn: Bột Mạch môn có tác dụng ức chế Stapylococus albus và E Coli

Tác dụng nội tiết: Dùng nước sắc hoặc cồn chiết xuất Mạch môn pha vào dịch truyền chích cho thỏ, thấy đảo Langerhans phục hồi nhanh, tăng lưọng dự trữ glycogen so với lô đối chứng

Tác dụng chống viêm: Tác dụng chống viêm rõ rệt đối với viêm cấp tính và mạn tính Dịch chiết với ethanol của Mạch môn thí nghiệm trên chuột cống trắng gây phù chân bằng carragenin có tác dụng ức chế phù

1.1.4.2 Công dụng [2], [5], [8]

Rễ củ Mạch môn được dùng để chữa ho khan, viêm họng, lao phổi nóng ấm

ỉ về chiều, sốt cao, tâm phiền khát nước, thổ huyết, khái huyết, chảy máu cam, hen phế quản, khó ngủ Ngoài ra, Mạch môn còn được dùng để lợi tiểu và chữa thiếu sữa, điều hòa nhịp tim khỏi hồi hộp, chữa táo bón, lở ngứa

Trong y học Trung Quốc, rễ củ Mạch môn thường được dùng trị các bệnh về tim mạch, cao huyết áp, xơ vữa động mạch, loạn thần kinh mạch máu, loạn thần kinh thực vật, khí hư và mất ngủ Mạch môn còn được dùng phối hợp với các dược liệu khác trị viêm dây thần kinh

Ở Ấn Độ những rễ củ có chất nhầy của Mạch môn có thể ăn được và được dùng thay thế Nhân sâm

Ở các nước Campuchia, Lào, rễ củ Mạch môn được dùng làm thuốc chữa sốt

và lợi sữa, trị viêm phổi và một số bệnh về gan, thận và ruột

1.1.5 Đa dạng về di truyền

Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy có sự đa dạng về dữ liệu di truyền

giữa các loài và giữa các chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes

Nghiên cứu về nhiễm sắc thể của Ophiopogon cũng cho thấy sự đa dạng

giữa các loài này Tổng số nhiễm sắc thể đã được báo cáo cho khoảng 45 loài

Ophiopogon Số cặp nhiễm sắc thể cơ bản: x = 18 là phổ biến trong hầu hết các loài, và x = 17 chỉ có ở một số loài đại diện như O clarkei Hook f., O intermedius D Don, O japonicus (L f.) Ker Gawl., O ohwii (L f.) Ker Gawl.,

và loài O umbraticola Hance [51] Ngoài ra, số lượng nhiễm sắc thể của loài còn có thể rất khác so với những loài khác trong cùng chi như: O variegatum (2n = 38) [46], O clarkei (2n = 38) [45] và O japonicus (2n = 67) [55] Phần lớn

là nhiễm sắc thể tồn tại dạng lưỡng bội, ngoại trừ 12 loài đa bội [51], [60] Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013) cũng đã chỉ ra rằng có sự khác biệt về

kích thước của các nhiễm sắc thể giữa các loài chi Ophiopogon (4,77 µm ở O chingii var glaucifolius và 1,66 µm ở O bodinieri var pygmaeus) [51]

Năm 2014, Wang và cộng sự đã sử dụng dữ liệu trình tự ADN có nguồn gốc

từ vùng phiên mã nội (ITS) và một số ADN vùng lục lạp (psbA – trnH, matK, rbcL, và trnL – F) để phân tích sự đa dạng loài một cách toàn diện của chi

Ophiopogon Trong nghiên cứu này, ADN được tách bằng phương pháp CTAB

của Doyle and Doyle (1987) và kit tách ADN thực vật (Bioteke, Bắc Kinh, Trung Quốc) Tác giả đã đưa ra hệ thống dữ liệu ADN của 91 mẫu lấy từ 43 loài thuộc cả ba chi và mối quan hệ về loài giữa chúng Kết quả của nghiên cứu tương đối đồng nhất với các kết quả nghiên cứu trước đây về sự phân loại giữa

ba chi về đặc điểm thực vật và giải phẫu Ông đề nghị nên giữ cả ba chi

Ophiopogon, Peliosanthes và Liriope [19]

Michiho Ito và cộng sự (2015) đã tiến hành so sánh ADN của các mẫu thuộc

hai chi Ophiopogon và Liriope ở Nhật Bản Kết quả nghiên cứu cho thấy không

có sự khác biệt giữa hai chi về dữ liệu vùng ITS nhưng lại có sự khác biệt về dữ liệu vùng rbcL giữa hai chi này Ông cho rằng có thể dùng dữ liệu vùng rbcL để phân biệt sản phẩm của hai chi này khi bị dùng lẫn trên thị trường [32]

Ở Việt Nam, cho đến nay, chúng tôi chưa tìm thầy tài liệu nào công bố về dữ

liệu di truyền chi Ophiopogon

1.2 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl

và Ophiopogonin D

1.2.1 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl Các công trình nghiên cứu về hóa học chi Ophiopogon được bắt đầu từ

những năm 1960 Đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về hóa học của

chi này Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào loài Ophiopogon japonicus, còn số ít còn lại nghiên cứu về các loài khác

Thành phần hóa học chính của loài Ophiopogon japonicus gồm có: saponin

steroid, homoisoflavonoid, ngoài ra còn có các thành phần khác như polysaccharid, sesquiterpen, sitosterol, stigmasterol,… [2], [5], [8], [33], [36], [37], [47], [57] (Bảng 1.3 và 1.4)

Một số loài khác như Ophiopogon ohwii và Ophiopogon jaburan cũng được

xác định có các hợp chất homoisoflavonoid [52]

Bảng 1.3 Một số homoisoflavonoid có trong rễ củ Ophiopogon japonicus

O OHC

O OHC

O OHC

O C

H3

OCH3OCH3

OH

Ophiopogonanon E

Bảng1.4 Một số saponin có trong rễ củ Ophiopogon japonicus

O

O

O H

Glu Xyl Rha(OCOCH3)

OH

O Glu Rha

OH

CH 3 O Glu

O

O Glu Rha

OH

CH3O

CH3fruc

Xyl

Ophiopogonin D

O

.

O

O Glu Rha

OH

CH3O

Ophiopojaponin D O

1.2.2 Tổng quan về Ophiopogonin D

Ophiopogonin D là một saponin steroid có trong củ của các loài thuộc chi

Ophiopogon, được phát hiện ở loài Ophiopogon japonicus vào năm 1968 bởi

Kato và cộng sự [24] Tuy nhiên, đến năm 1973 cấu trúc của chất mới được làm sáng tỏ bởi Akihiro Tada và cộng sự [48]

1.2.2.1 Đặc tính lý hóa

Ophiopogonin D có công thức phân

tử là C44H70O16.4H2O, góc quay cực [α]14

D = -107,9o (dung môi pyridin) Ophiopogonin D là một ruscogenin triglycosid với các phân tử đường là D – fructose, L – rhamnose và D – xylose [48]

1.2.2.2 Tác dụng

Ophiopogonin D được cho là một trong những thành phần có hoạt tính trong

củ Mạch môn Theo kết quả nghiên cứu của Su Hyun Park và cộng sự (2014), Ophiopogonin D có khả năng làm tăng PMA – một sản phẩm được làm ra từ mucin, qua đó gợi ý đến Ophiopogonin D có khả năng làm kích thích sản xuất mucin đường thở (mucin là một trong những thành phần chính của chất nhày do niêm mạc đường hô hấp tiết ra, có vai trò ngưng kết các hạt bụi, vi khuẩn, vi rút… và tạo môi trường thuận lợi cho hoạt động của transferrin, globulin, lysozym… ngoài ra chúng còn giúp ngăn sự tiếp xúc giữa các chất kích thích hít vào với niêm mạc đường thở) [40] Ophiopogonin D được nghiên cứu là có tác dụng chống viêm [8], [15], [26] Đây có thể là một căn cứ của việc sử dụng củ

của Ophiopogon japonicus để chữa các bệnh liên quan đến viêm phổi trong dân

gian và Y học cổ truyền

Các nghiên cứu gần đây cho thấy, Ophiopogonin D còn có tác dụng lên tim mạch Ophiopogonin D ngăn chặn H2O2 – yếu tố oxi hóa gây tổn thương nội mạc mạch máu – một trong những nguyên nhân gây nên các bệnh về tim mạch

Trong nghiên cứu của mình, Qian và cộng sự (2010) đã chứng minh được tác dụng ức chế của Ophiopogonin D đối với H2O2 được sinh ra khi làm tổn thương các tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người (HUVECs) Nó ức chế theo liều lên mARN của các gen quy định các chất chống oxy hóa, gây viêm, và gen quy định quá trình chết theo chu trình của tế bào ở HUVECs H2O2 – được sinh ra từ quá trình peroxid hóa lipid, carbonyl hóa protein, các phản ứng oxy hóa trong ty thể

và quá trình chết theo chu trình của tế bào, đều giảm khi điều trị bằng Ophiopogonin D Hơn nữa Ophiopogonin D còn khôi phục hoạt tính của các tế bào chống oxy hóa và ức chế sự giải phóng của các cytokin gây viêm, ngăn chặn hoạt động của NF – κB và ERK [42] W You và cộng sự (2016) qua nghiên cứu của mình cũng đã kết luận rằng Ophiopogonin D là một chất có khả năng cung cấp lợi ích trị liệu khi điều trị các bệnh tim mạch liên quan đến rối loạn của cân bằng nội môi của Ca 2+ và stress ER [58]

Ngoài ra, Ophiopogonin D còn được nghiên cứu là có tác dụng chống loãng xương, chống ung thư, chống lại sự di căn của khối u, tác dụng chống đông máu [21], [27], [47], [61] Ophiopogonin D còn được chứng minh tác dụng trên invitro và invivo về hạn chế độc tính trên tim mạch của doxorubixin – một trong những hóa trị liệu điều trị ung thư [62]

1.2.2.3 Hàm lượng của Ophiopogonin D trong củ Mạch môn

Hàm lượng Ophiopogonin D trong củ của Ophiopogon japonicus khá dao

động, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như địa điểm trồng, thời điểm thu hái, các bảo quản, chế biến, phương pháp chiết tách,…

Ophiopogonin D đã được phân lập từ củ của loài Ophiopogon japonicus với

lượng là 5,7 mg từ 9,7 kg nguyên liệu thô, đạt tỷ lệ là 0,00006% [43] Trong một nghiên cứu khác, Lu Kegang và cộng sự đã dùng hệ thống sắc kí cột silica gel sephadex LH – 20 phân lập Ophiopogonin D từ củ Mạch môn đạt tỷ lệ 0,005% [29]

1.3 Phương pháp HPLC – ELSD

1.3.1 Nguyên tắc hoạt động

Hình 1.2 Cấu tạo của detector ELSD

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn) Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6], [7]

Các chất sau khi tách ra khỏi nhau được hóa hơi nhờ nhiệt độ tạo thành các hạt sương có kích thước nhỏ tại buồng hóa hơi, sau đó đi qua một đường ống dài (driff) và dưới tác dụng của dòng khí, dung môi được làm bay hơi để lại các hạt chất tan được làm khô Dòng hạt này làm tán xạ chùm ánh sáng chiếu tới, cường

độ của tia tán xạ đo được tỷ lệ tương ứng với nồng độ chất phân tích

1.3.2 Ưu – nhược điểm của detector ELSD

Ưu điểm

- Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện

thấp (cỡ nanogam)

- Có thể phát hiện được các chất

bay hơi kém hơn pha động, các chất

không có khả năng hoặc ít hấp thụ bức

xạ UV – VIS

- Không có đáp ứng với dung môi

- Ít hoặc không bị nhiễu trong quá trình pha động thay đổi theo gradient

- Thích hợp với các dung môi pha động dễ bay hơi

Nhược điểm

- Chỉ thích hợp với các dung môi dễ bay hơi và các chất định lượng có khả năng bay hơi kém hơn dung môi

Trên thế giới, đã có một số tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC – ELSD

để định lượng hàm lượng Ophiopogonin D và một số thành phần khác trong rễ

củ Mạch môn [20], [23], [29], [52], [53], [59] Ngoài ra, phương pháp này còn được các tác giả kết hợp với phương pháp HPLC – UV để đánh giá chất lượng của Mạch môn [28], [39], [52]

1.4 Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding) và trình tự di truyền đoạn ADN Ribosom nhân cùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của Mạch môn

1.4.1 Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding)

Năm 2003, Paul Hebert đã đề xuất "Mã vạch ADN" (ADN Barcoding) như

là một cách để xác định loài Phương pháp mã vạch sử dụng một đoạn trình tự gen rất ngắn lấy từ một vị trí chuẩn của hệ gen Cách dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách phân biệt các mã vạch màu đen đặc trưng cho từng sản phẩm Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mẫu trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, nhưng phương pháp mã vạch ADN có thể phân biệt được [70]

Phương pháp ADN barcoding gồm 4 phần cơ bản:

• Mẫu: Từ các viện bảo tàng, phòng tiêu bản, vườn thú, hồ, mô đông lạnh, ngân hàng giống, các mẫu thu hái được,…

• Phân tích trong phòng thí nghiệm: Các phòng thí nghiệm sinh học phân tử làm theo các quy trình chuẩn để tạo ra trình tự mã vạch ADN Các dữ liệu này sau đó được đặt trong một cơ sở dữ liệu để phân tích tiếp

• Cơ sở dữ liệu: Một trong những phần quan trọng nhất của sáng kiến Mã vạch là việc xây dựng một thư viện tham khảo chung để xác định các loài chưa biết dựa trên các loài đã biết Hiện nay, trên thế giới, có hai cơ sở dữ liệu mã vạch chính là: Ngân hàng gen (Genbank) và Barcode of Life Database (BOLD)

• Phân tích dữ liệu: Mẫu vật được xác định bằng cách tìm các báo cáo tham khảo trùng hợp nhất trong cơ sở dữ liệu Từ đó so sánh, đối chiếu đoạn ADN được mã hóa của mẫu chưa biết với đoạn trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu [64]

1.4.2 Trình tự di truyền đoạn ADN ribosom nhân vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của cây Mạch môn

Khoảng hơn một thập kỷ trở lại đây, trình tự di truyền đoạn ADN ribosom nhân vùng phiên mã nội (rADN – ITS) là đoạn gen phổ biến trên ADN được sử dụng trong các nghiên cứu tiến hóa về phân loại các nhóm thực vật Cấu trúc của rADN – ITS gồm 3 tiểu phần: tiểu đơn vị 5.8S – trình tự có tính bảo tồn cao trong tiến hóa và 2 vùng phiên mã nội ITS1 và ITS2 Độ dài trình tự tiểu phần 5.8S gần như không khác nhau (163 – 164 bp), trong khi đó độ dài vùng phiênmã nội ITS có sự khác nhau: ITS1 (187 bp đến 298 bp) và ITS2 (187 bp

đến 252 bp) Toàn bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới 700 bp [11], [19]

Hình 1.3 Cấu trúc của vùng rADN – ITS và các mồi thường sử dụng

Có 4 lý do để ITS ngày càng trở nên phổ biến:

(i) Tính sẵn có của một số bộ mồi PCR phổ biến (hoặc tương tự) áp dụng với một lượng lớn của các nhóm loài;

(ii) Cấu trúc đa sao chép tạo điều kiện khuếch đại PCR thậm chí từ mẫu tiêu bản;

(iii) Các kích thước vừa phải của ITS (dưới 700 bp) thường cho phép khuếch đại và giải trình tự mà không cần nội mồi, ngoại lệ với nhiều nhóm thực vật hạt trần;

(iv) Do mức độ của sự biến đổi, ITS thường cung cấp đủ các marker phân tử thích hợp cho các nghiên cứu tiến hóa ở cấp độ loài, như nguồn gốc của các loài

đa bội, lai tạo, biến đổi gen, suy luận phát sinh loài [38]

Với chi Ophiopogon, trên thế giới có rất nhiều công bố về trình tự đoạn

ADN ribosom nhân vùng phiên mã nội (rADN – ITS1 – 5.8S – ITS2) Các đoạn trình tự này đã được công bố trên Ngân hàng gen thế giới Genbank [65] Đây là

cơ sở của việc nghiên cứu xác định đoạn trình tự của mẫu nghiên cứu ở Việt Nam và so sánh với các trình tự đã so sánh trên thế giới

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu nghiên cứu được thu thập tại 4 tỉnh, gồm: Lào Cai, Phú Thọ, Yên Bái

và Tuyên Quang (Bảng 2.1) Để hạn chế sự sai khác do điều kiện sinh thái, mùa vụ, toàn bộ các mẫu này được trồng trong cùng điều kiện tại trại GAP của DKPharma ở xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên Mã số tiêu bản của các mẫu này được trình bảy ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Ký hiệu, nguồn gốc và mã số tiêu bản của các mẫu nghiên cứu

M6 Thị trấn Sơn Dương, huyện Sơn Dương, Tuyên Quang HNIP/18229/16 Mẫu nghiên cứu về đặc điểm thực vật: Toàn cây, được thu tại Trại GAP của DKPharma tại tỉnh Thái Nguyên (M1 – M6) Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Tiêu bản của Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP)

Nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học: Mẫu củ của các mẫu M2, M3, M4, M6 được thu tại Trại GAP của DKPharma tại tỉnh Thái Nguyên Các mẫu được rửa sạch, sấy ở nhiệt độ 60oC đến khô, xay nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín Ngoài

ra còn có các mẫu được gọi là “Mạch môn Bắc” (MB), “Mạch môn Nam” (MN) và

“Thiên môn” (TM) thu được trên thị trường (phố Lãn Ông, Hoàn Kiếm, Hà Nội) Mẫu dược liệu Mạch môn chuẩn được sử dụng do Viện Dược liệu cung cấp (MC) Nguyên liệu nghiên cứu trình tự di truyền đoạn ADN ribosom vùng ITS1 – 5.8S – ITS2: Lá non của các mẫu Mạch môn tại Trại GAP của DKPharma tại tỉnh Thái Nguyên (M1 – M6)

2.1.2 Dung môi, hóa chất

2.1.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu

- Dung dịch Javen, dung dịch acid acetic, xanh methylen, đỏ carmin (Son phèn), nước cất làm tiêu bản, glycerin

2.1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

- Cloroform, methanol, toluen, acid acetic, n – butanol, ete dầu hỏa (30 – 60) (Trung Quốc)

- Acetonitril, methanol, acid formic (Merck), nước cất hai lần dùng cho HPLC

2.1.2.3 Nghiên cứu trình tự rADN vùng ITS1 – 5.8S – ITS2

- Gel agarose 1%: 0,5g agarose pha trong 50mL đệm TAE 1x, đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn tạo dung dịch trong suốt (khoảng 2 phút) Để nguội đến khoảng 60˚C, thêm 2 µL ethidium bromide (EB): 10 mg/mL (Sigma) rồi đổ ra khay

đã có lược để tạo giếng Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng

- Thang ADN chuẩn 1kp (Ladder 1kb), 100bp(Ladder 100bp) (Thermo)

- Mồi (Intergrated ADN Technologies):

Mồi xuôi: ITS1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’)

Hoặc ITS 5 (5’ – GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG – 3’),

Mồi ngược: ITS4 (5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’)

2.1.3 Máy móc, thiết bị

2.1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi phẫu

- Kính lúp soi nổi Leica EZ4, Kính hiển vi Leica CME

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon, thước kẻ, đĩa petri, kim mũi mác, dao,…

2.1.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, detector tán xạ bay hơi (ELSD)

- Cột sắc ký: C18 (150 × 4,6 mm, 5µm)

- Bộ chiết hồi lưu: bình cầu, ống sinh hàn

- Bếp điện

- Máy chấm sắc ký Linomat 5.0

- Hệ thống triển khai bản mỏng ADC2

- Máy soi UV Camag TLC Visualizer và hệ thống máy tính kết nối với máy soi

- Cân phân tích Metter Toledo (Thụy Sĩ) (có độ chính xác 0,1 mg)

2.1.3.3 Nghiên cứu đặc điểm di truyền

- Thiết bị bảo quản mẫu: tủ lạnh sâu - 22˚C (Biomedical Freezer – Sanyo)

- Dụng cụ tách chiết ADN từ mẫu: chày, cối, kéo, máy votex IKA, máy ly tâm

để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu, ống eppendorf (2,0 mL, 1,5 mL),

bể ổn định nhiệt Memmert WNB10, micropipette (1000, 100, 20, 10)

- Dụng cụ điện di: Máy điện di Consort EV222, máy soi chụp ảnh ADN UVP Gel – docIt, lò vi sóng Saiko

- Dụng cụ PCR: Máy PCR Eppendorf Mastercycler Pro S

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

Mô tả đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích và mô tả chẩn đoán [1] Phân tích hoa và quan sát trên kính lúp soi nổi Leica Z24

Tên khoa học được xác định bằng phương pháp so sánh hình thái, dựa trên đặc điểm của mẫu nghiên cứu so với bộ khóa phân loại và mô tả đặc điểm trong các tài liệu phân loại thực vật trong nước [3], [4] và nước ngoài [13], [14], [35]

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu

Làm vi phẫu rễ và lá của mẫu nghiên cứu theo phương pháp nhuộm kép [1] Soi

vi phẫu trên kính hiển vi Leica CME

2.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.3.1 So sánh vân tay sắc ký lớp mỏng của các mẫu củ Mạch môn

Tiến hành chiết và sắc ký theo chuyên luận Dược điển Trung Quốc [41]

Chuẩn bị dung dịch thử: Cân mỗi mẫu khoảng 2,0 g bột củ Ngâm mẫu trong ba giờ với 20 ml dung môi (cloroform : methanol (v:v) = 3 : 1) Sau đó, các mẫu được đem đi chiết siêu âm trong 30 phút Lọc, cô thành cắn rồi hòa tan cắn trong 1ml cloroform để dùng làm dịch chiết thử

Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu: Thay mẫu thử bằng mẫu dược liệu chuẩn (do Viện dược liệu cung cấp, được ký hiệu là MC), rồi tiến hành chiết theo quy trình trên

Hệ dung môi: Toluen : Methanol : Acid acetic = 80 : 5 : 0,1 (v:v:v)

Sắc ký đồ của các mẫu được quan sát và chụp ảnh ở bước sóng 254 nm và được

xử lý bằng phần mềm WINCATS

Sắc ký đồ của các mẫu được dùng để so sánh với nhau và so sánh với sắc ký đồ của mẫu Mạch môn chuẩn do Viện Dược liệu cung cấp khi tiến hành sắc ký ở cùng một điều kiện

2.2.3.2 So sánh hàm lượng Ophiopogonin D trong các mẫu củ Mạch môn bằng phương pháp HPLC – ELSD

Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,0000 g bột dược liệu chiết hồi lưu với 100 ml methanol trong 1 giờ và lọc qua vải lọc Dịch chiết được cất quay chân không ở 65oC Cắn được hòa tan lại bởi 40 ml nước Lắc dịch chiết với

20 ml ether dầu hỏa Phần ether dầu hỏa được loại bỏ, phần còn lại lắc với 90 ml n – butanol bão hòa nước (chia 3 lần, mỗi lần 30 ml) Dịch chiết n – butanol được cất quay chân không ở 65oC Hòa tan cắn trong chính xác 3,0 ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm, dùng chấm sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn Ophiopogonin D (dung môi methanol) có nồng độ lần lượt là 30 µg/ml, 40 µg/ml, 50 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml 1 ml dung dịch chuẩn 80 µg/ml được pha loãng 10 lần để làm dung dịch chuẩn thêm vào mẫu thử khi kiểm tra độ đúng của phương pháp

Khảo sát một số điều kiện để tối ưu hóa quá trình sắc ký

 Khảo sát chương trình pha động

 Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi

Đánh giá phương pháp phân tích

Theo quy định của USFDA, AOAC và ICH đối với các phương pháp phân tích các thông số cần thẩm định bao gồm các chỉ tiêu chính sau [9]:

(1) Khảo sát tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành: Tiêm lặp lại một mẫu chuẩn ít nhất 6 lần

Đánh giá: Kết quả được đánh giá dựa vào độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của

diện tích pic và thời gian lưu giữa các lần đo RSD (%) phải nhỏ hơn 2,0 %

RSD (%) được tính theo công thức sau:

(2) Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp

Nguyên tắc: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác

định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử

Tiến hành: Thực hiện sắc ký với 3 mẫu sau: mẫu trắng, mẫu thử, dung dịch

chuẩn 50 µg/ml

Đánh giá: So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên, mẫu

trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

(3) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

Nguyên tắc: Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc

tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan r

Tiến hành: Khảo sát trên một dãy chất chuẩn có nồng độ như đã pha ở phần

“chuẩn bị dung dịch chuẩn” Tiêm lần lượt các dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống

(2.1)

sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Ghi các giá trị diện tích pic đo được ứng với các nồng độ của dung dịch trên

Đánh giá: Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng

phương trình hồi quy tuyến tính Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính giá trị r phải đạt yêu cầu sau: 0,995 ≤ r≤ 1 hay 0,99 ≤ r2 ≤1

(4) Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Nguyên tắc: Độ lặp lại được tiến hành qua phân tích một mẫu 6 lần song song Tiến hành: Tiến hành chiết, sắc ký song song ít nhất 6 lần với một mẫu bất kì Đánh giá: Xác định kết quả và tính độ lệch chuẩn tương đối giữa nồng độ chất

phân tích có trong mẫu giữa các lần phân tích để đánh giá độ lặp lại Giá trị của RSD (%) không được quá 5,3 % [9]

(5) Khảo sát độ đúng của phương pháp

Nguyên tắc: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa

giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận

là đúng Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định độ đúng thông qua việc đo độ thu hồi

Tiến hành: Thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn đã biết trước

hàm lượng sao cho dung dịch cuối cùng có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát, xác định phần trăm tìm lại

Tiến hành phân tích kết quả sắc ký để khảo sát độ đúng Tỷ lệ thu hồi được tính theo công thức:

TỶ LỆ PHẦN TRĂM

CHUẨN TÌM LẠI (%)

(C MẪU THỬ THÊM CHUẨN - CMẪU THỬ X K) X 100%

CCHUẨN THÊM VÀO

Trong đó K là hệ số hiệu chỉnh theo khối lượng, K = mthử thêm chuẩn/mthử

Đánh giá: Độ tìm lại 90 – 107% [9]

(6) Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu

có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử

mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

(2.2)

=

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được tính bằng phương pháp tính độ lệch chuẩn trên mẫu thử

Làm 6 lần song song Nên chọn mẫu thử có nồng độ thấp (trong khoảng 5 đến 7 lần LOD ước lượng)

Tính LOD: Tính giá trị trung bình x, và độ lệch chuẩn SD

Đánh giá LOD đã tính được: tính R= x / LOD (2.4)

Nếu 4<R<10: nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy Nếu R<4: Phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm chuẩn vào dung dịch thử đã dùng là làm lại, tính lại R

Nếu R>10: Phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung dịch thử đã dùng, làm lại thí nghiệm và tính lại R

Giới hạn định lượng: LOQ = 10 x SD

 Định lượng hàm lượng Ophiopogonin D trong các mẫu

Tiến hành chiết và sắc ký theo quy trình đã được thẩm định ở trên Nồng độ Ophiopogonin D trong mẫu được tính theo công thức sau:

Nồng độ Ophiopogonin D (µg/g) = ồ độ ị ế

( )/

Trong đó, m (g) là khối lượng cân của mẫu, B (%) là hàm ẩm của mẫu

2.2.4 Nghiên cứu trình tự di truyền

2.2.4.1 Tách chiết ADN toàn phần

Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kit chiết tách ADN thực vật GeneJET (Thermo Scientific) Quy trình bao gồm các bước như sau:

#1 Lấy 1 lá bánh tẻ còn tươi của mỗi mẫu, cắt và nghiền mẫu trong nitơ lỏng

#3 Thêm 50 µL Lysis Buffer B và 20 µL RNase A Lắc nhẹ

#4 Ủ ở 65˚C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc ống trong lúc ủ

#5 Thêm 130 µL Precipitation Solution và lắc đảo ống 2 – 3 lần Ủ trong đá 5

phút

#6 Ly tâm với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 8 phút Thu dịch nổi và chuyển

sang ống eppendorf 1,5 mL mới Thêm 400 µL Plant ADN Binding Solution và 400

µL ethanol 96% và trộn đều

#7 Chuyển hỗn hợp trên vào một ống spin column được cung cấp sẵn Ly tâm

với tốc độ vòng 8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch

#8 Thêm 500 µL Wash Buffer I đã được thêm ethanol 96% vào ống spin

column Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch nổi Column chuyển sang, đặt trong ống eppendorf mới

#9 Thêm 500 µL Wash Buffer II đã được thêm ethanol 96% Ly tâm với tốc độ

13.200 vòng/phút trong 6 phút Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi Colunm chứa ADN được chuyển sang đặt trong eppendorf mới

#10 Thêm 100 µL Elution Buffer để hòa tan ADN, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ

phòng Sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ column, thu ống eppendorf có chứa ADN đã được hòa tan

#11 Kiểm tra quá trình chiết ADN trên bản gel agarose 1%

#12 Bảo quản ADN ở nhiệt độ - 20˚C để thực hiện các bước tiếp theo

2.2.4.2 Khuếch đại ADN (PCR)

Phản ứng PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR

1 phản ứng

Thể tích (µL)/ mẫu TN

Dung dịch đệm cho Taq ADN polymerase (10x) 1,00 5,00

Tiến hành PCR với các cặp mồi ITS1 – ITS4 Dung dịch đệm sử dụng là Dream Taq Buffer (chứa 20 mm MgCl2)

• Khuếch đại: 72˚C trong 50 giây

• Pha tổng hợp cuối cùng: 72˚C trong 8 phút

2.2.4.3 Điện di ADN trên bản gel agarose 1%

#1 Đặt bản gel agarose 1% đã được thêm EB vào trong máy điện di có dung

dịch đệm TAE 1x

#2 Pha mẫu theo tỷ lệ: 2 µL chỉ thị Dye trộn đều với 2 µL sản phẩm PCR Làm

tương tự với Ladder

#3 Chạy điện di với hiệu điện thế 90V trong vòng 30 phút

#4 Quan sát bản gel dưới ánh sang đèn tử ngoại bước sóng 302 nm

#5 Cắt lấy đoạn gel chứa ADN nhỏ nhất và nhẹ nhất có thể, cho vào trong ống

Trình tự ADN của các mẫu được so sánh với nhau và so sánh với một số trình

tự ADN vùng này ở một số loài thuộc chi Ophiopogon được công bố trên Genbank

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm thực vật của các mẫu Mạch môn

3.1.1 Đặc điểm hình thái

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu M1

Cây cỏ, mọc thành bụi, cao 15 – 20 cm Thân rễ rất ngắn Rễ phân nhánh, dạng sợi, không phình củ Lá đơn, mọc so le, hình dải, dài 13 – 40cm, rộng 0,5 – 0,9cm, màu xanh đậm và nhẵn cả hai mặt; gân 8 – 13, song song Cụm hoa chùm, mọc ở đỉnh, dài 13 – 15 cm Cuống cụm hoa dài 15 – 18 cm, nhẵn Hoa 5 trên 1 lá bắc Lá bắc rộng, ôm lấy các hoa khi còn nụ, dài 2 – 3 mm, rộng 3 – 4 mm, màu nâu, nhẵn

cả hai mặt Hoa đều, lưỡng tính, màu trắng, trên cuống hoa dài 2 mm, đường kính 0,5 mm, thẳng, không chia đốt, màu trắng, nhẵn

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của mẫu M1

1 Toàn cây; 2,3 Một phần cụm hoa; 4 Một hoa nguyên vẹn; 5 Một thùy bao hoa; 6 Bộ nhị cho thấy chỉ nhị; 7 Bầu cắt dọc; 8 Bầu cắt ngang

Bao hoa 6 mảnh, xếp 2 vòng, mỗi mảnh hình ovan, khum, mép nguyên, ngọn thuôn đều, dài 2 mm, rộng 1 mm, màu trắng, nhẵn cả hai mặt Nhị 6, xếp 2 vòng, đính ở gốc mảnh bao hoa, ngắn hơn bao hoa Chỉ nhị dài hơn bao phấn, rời, nhẵn Bao phấn thuôn về phía đỉnh, đính gốc, 2 ô, dài 1mm, rộng 0,5 mm, hướng trong

Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên, đường kính 1,5 mm, 3 ô, mỗi

ô 2 noãn Vòi nhụy dẹt, dài 1,5 mm, rộng 0,5 mm, trắng, nhẵn, không chia thùy; núm nhụy thuôn nhọn (Hình 3.1) Quả chưa thấy

Tên khoa học của mẫu M1: Mẫu có đặc điểm tương đồng với loài Liriope graminifolia (L.) Baker được mô tả trong Thực vật chí Việt Nam [3]

3.1.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu M2 – M6

Các mẫu từ M2 – M6 đều có đặc điểm chung gần như nhau: Cây cỏ, mọc thành bụi, cao 10 – 20 cm Thân rễ rất ngắn Rễ dạng sợi, có thể phình củ ở giữa hoặc chóp rễ Lá đơn, mọc so le, hình dải, dài 13 – 41cm, rộng 0,3 – 1,0 cm, màu xanh đậm và nhẵn cả hai mặt; gân 3 – 20, song song Cụm hoa chùm, mọc ở đỉnh, dài 13 – 15 cm Cuống cụm hoa dài, nhẵn Hoa 4 trên 1 lá bắc Lá bắc rộng, ôm lấy các hoa khi còn nụ, dài 2 – 3 mm, rộng 3 – 4 mm, màu xanh, nhẵn cả hai mặt Hoa đều, lưỡng tính, màu trắng, trên cuống hoa dài 3 – 4 mm, đường kính 0,5 mm,bị uốn vặn ngược lại, có đốt ở giữa hoặc gần giữa, màu trắng, nhẵn

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của mẫu M2

1 Toàn cây; 2,3 Một phần cụm hoa; 4 Một hoa nguyên vẹn; 5 Một thùy bao hoa;

6 Bộ nhị cho thấy chỉ nhị và vòi nhụy; 7 Bầu cắt dọc; 8 Bầu cắt ngang

Bao hoa 6 mảnh, xếp 2 vòng, mỗi mảnh hình ovan, khum, mép nguyên, ngọn thuôn đều, dài 2 – 3 mm, rộng 1 mm, màu trắng, nhẵn cả hai mặt Nhị 6, xếp 2 vòng, đính ở gốc mảnh bao hoa, ngắn hơn bao hoa Chỉ nhị ngắn hơn bao phấn, rời, nhẵn Bao phấn hình mũi mác, đính gốc, 2 ô, dài 1mm, rộng 0,5 mm, hướng trong

Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên, đường kính 1,5 mm, 3 ô, mỗi

ô 2 noãn Vòi nhụy hình trụ, dài 1,5 mm, trắng, nhẵn, chia làm 3 thùy; núm nhụy thuôn nhọn (Hình 3.2) Quả chưa thấy

Tuy nhiên, các mẫu này có một số khác biệt nhỏ, được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm khác biệt của các mẫu từ M2 – M6

TT Đặc điểm Mẫu M2 Mẫu M3 Mẫu M4 Mẫu M5 Mẫu M6

Sự phình

thành củ

Ở giữa và chóp rễ

Tên khoa học của các mẫu M2 – M6: Các mẫu M2 – M6 đều có đặc điểm

tương đồng với loài Ophiopogon longifolius Decn được mô tả trong Thực vật chí Việt Nam [3]

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu

Các mẫu nghiên cứu (M1 – M6) đều giống nhau về đặc điểm giải phẫu rễ và lá

 Đặc điểm giải phẫu rễ

Rễ có tiết diện tròn Từ ngoài vào trong bao gồm: Bên ngoài là căn bì (velamen) gồm 2 – 3 lớp tế bào hình đa giác xếp sát nhau, thành dày, có những chỗ

bị bong ra Tiếp theo đó là ngoại bì gồm 1 lớp tế bào hình đa giác, xếp sát nhau, vách tế bào tẩm suberin Vùng mô mềm vỏ rất rộng gồm tế bào hình tròn hay đa giác Nội bì có thành dày hình chữ U Trụ bì gồm 1 lớp tế bào, hóa mô cứng rải rác Các bó gỗ cấp 1 phân hóa hướng tâm, xếp xen kẽ với bó libe cấp 1 Vùng mô mềm ruột hẹp gồm các tế bào có vách mỏng, kích thước nhỏ hơn tế bào mô mềm vỏ (Hình 3.3)

 Đặc điểm giải phẫu lá

Lá có tiết diện gần tam giác, từ dưới lên trên bao gồm: Biểu bì dưới gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, xếp sít nhau, vách hóa cutin Phía trên biểu bì là 3 – 6 lớp

tế bào vách rất dày, hình tròn hoặc gần tròn, có ở cả mặt trên và dưới của lá Mô mềm vỏ khuyết, tế bào hình tròn hoặc đa giác, nhỏ, vách mỏng, không sít nhau để lộ khác khoảng không Trong vùng mô mềm có khoảng 5 – 8 bó gỗ không đều,

libe hình nón chồng lên gỗ, các bó libe – gỗ có mô cứng bao xung quanh (Hình 3.4)

Hình 3.3 Đặc điểm giải phẫu của rễ M2

A – Vi phẫu rễ, B – Biểu bì, C – Trung trụ

1 – Velamen, 2 – Ngoại bì, 3 – Mô mềm vỏ, 4 – Nội bì, 5 – Trụ bì, 6 – Libe, 7 – Gỗ, 8 – Mô mềm ruột

Hình 3.4 Đặc điểm giải phẫu của lá M2

A – Vi phẫu lá, B – Bó libe-gỗ, C – Biểu bì

1 – Biểu bì, 2 – Mô dày, 3 – Mô mềm, 4 – Gỗ, 5 – Libe, 6 – Mô cứng